Visualisation du micro

Oct 18, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13375 (2022) Citer cet article

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Les techniques de microscopie optique sont un choix populaire pour visualiser les micro-agents. Ils génèrent des images avec une résolution spatio-temporelle relativement élevée mais ne révèlent pas d'informations codées permettant de distinguer les micro-agents et l'environnement. Cette étude présente la microscopie à fluorescence multicolore pour rendre l'identification codée par couleur des micro-agents mobiles et des environnements dynamiques par démixage spectral. Nous rapportons les performances de la microscopie multicolore en visualisant l'attachement de micro-agents simples et en grappes à des sphéroïdes cancéreux formés avec des cellules HeLa comme preuve de concept pour la démonstration de l'administration ciblée de médicaments. Une puce microfluidique est développée pour immobiliser un seul sphéroïde pour la fixation, fournir un environnement stable pour la microscopie multicolore et créer un modèle de tumeur 3D. Afin de confirmer que la microscopie multicolore est capable de visualiser des micro-agents dans des environnements vascularisés, des réseaux vasculaires in vitro formés de cellules endothéliales et de membranes chorioallantoïques de poulet ex ovo sont utilisés comme modèles expérimentaux. La visualisation complète de nos modèles est obtenue par excitation séquentielle des fluorophores de manière circulaire et acquisition d'images individuelles synchrones à partir de trois bandes de spectre différentes. Nous démontrons expérimentalement que la microscopie multicolore décompose spectralement les micro-agents, les corps organiques (sphéroïdes et vaisseaux cancéreux) et les milieux environnants en utilisant des fluorophores avec des caractéristiques de spectre bien séparées et permet l'acquisition d'images avec 1280 \(\times\) 1024 pixels jusqu'à 15 images par seconde. Nos résultats montrent que la microscopie multicolore en temps réel permet une meilleure compréhension grâce à la visualisation codée par couleur concernant le suivi des micro-agents, la morphologie des corps organiques et une distinction claire des milieux environnants.

Le domaine de la microrobotique a ouvert de nouvelles voies pour diverses applications en médecine grâce aux avancées des technologies de micro/nano-fabrication1,2,3. L'une des applications les plus importantes est l'administration ciblée de médicaments, qui est une technique innovante pour augmenter le taux de réussite du traitement, atténuer les effets secondaires des médicaments et réduire le temps de récupération du patient4,5. Les micro-agents, les effecteurs finaux des systèmes microrobotiques, sont utilisés comme supports pour l'administration de médicaments à base de nanoparticules et dirigés vers le tissu d'intérêt par des stimuli externes (par exemple, des champs magnétiques et des ondes acoustiques)6. Les techniques d'imagerie sont utilisées pour que les micro-agents atteignent le tissu cible, car l'intégration du capteur reste un défi en raison des limitations de taille7,8. Les images acquises ne peuvent être considérées que comme une source de rétroaction pour l'identification de la cible, la manipulation des micro-agents et la libération des médicaments à l'emplacement souhaité. Par conséquent, une visualisation claire joue un rôle crucial dans le processus de livraison.

L'imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (CT), la fluoroscopie, l'échographie et l'imagerie photoacoustique sont utilisées pour visualiser les micro-agents dans des conditions in vitro et in vivo. L'IRM est utilisée pour l'activation et la visualisation simultanées de micro-agents avec un rapport contraste/bruit élevé9,10,11. De plus, les images IRM contiennent des détails anatomiques avec un rapport contraste/bruit élevé pour un pilotage précis des micro-agents. Cependant, le faible taux d'acquisition d'images de l'IRM le rend inadapté aux applications de micro-agents qui nécessitent une visualisation en temps réel12. Semblable à l'IRM, la tomodensitométrie fournit des images haute résolution des micro-agents, mais elle dispose d'un espace de travail limité pour l'intégration des systèmes d'actionnement et de détection13. La fluoroscopie est une méthode d'imagerie alternative pour la tomodensitométrie afin d'obtenir un espace de travail plus grand et d'obtenir un meilleur taux d'acquisition d'images14,15. La tomodensitométrie et la fluoroscopie ont des effets nocifs sur les cliniciens et les patients en raison de l'exposition aux rayonnements ionisants16. Parmi les modalités d'imagerie, les techniques basées sur les ultrasons n'ont pas d'effets secondaires connus sur la santé et sont utilisées pour la visualisation en temps réel des micro-agents17,18,19,20,21. L'imagerie par ultrasons offre un grand espace de travail pour le placement des systèmes d'actionnement puisque les images sont acquises à l'aide d'une petite sonde portative22,23,24. Cependant, les images ultrasonores sont intrinsèquement bruyantes et contiennent des artefacts qui entravent la détection des micro-agents. L'imagerie photoacoustique surmonte la limitation de l'imagerie ultrasonore par l'amélioration du contraste des micro-agents. L'absorption de la lumière chauffe les micro-agents contenant des matériaux métalliques, et les ondes acoustiques qui en résultent sont générées par dilatation thermique25. Les ondes acoustiques générées font que les micro-agents atteignent un rapport signal sur bruit plus élevé que l'imagerie par ultrasons et sont résolus à partir de l'environnement26,27,28.

Les techniques de microscopie optique sont utilisées pour les tests préliminaires et les micro-agents dans les applications de laboratoire sur puce puisque les environnements expérimentaux sont fabriqués avec des matériaux transparents6,7. Les techniques de microscopie à fond clair et à fluorescence monobande sont largement utilisées pour visualiser les micro-agents. La visualisation complète des échantillons est obtenue avec la microscopie à fond clair, mais les différences de hauteur entre les micro-agents et l'environnement physique provoquent un flou des images acquises29. La microscopie à fluorescence à bande unique fournit uniquement une visualisation des micro-agents à haute résolution et ne fournit pas d'informations sur l'environnement30,31. Dans notre étude précédente, la microscopie à fluorescence multicolore a été introduite pour surmonter les limites des techniques de microscopie optique pour la visualisation des micro-agents29. Un microscope multicolore à grand champ a été développé comme outil pour collecter des images focalisées à partir de différentes bandes spectrales et corriger les aberrations. Les échantillons complets ont été résolus spectralement et une visualisation sans occlusion des micro-agents et de l'environnement a été obtenue.

Dans cette étude, nous abordons le manque d'imagerie multicolore en temps réel des micro-agents et de l'environnement. La principale différence entre les techniques d'imagerie utilisées dans les études précédentes et notre approche est qu'un meilleur mécanisme de compréhension de la fonctionnalité et de la dynamique des micro-agents est établi par le codage couleur des échantillons complets. Étant donné que la couleur est un support d'information essentiel pour la perception humaine et l'amplification de la cognition, les images multicolores acquises permettent une visualisation claire des micro-agents et de l'environnement32. Le potentiel de la microscopie multicolore est démontré en visualisant des micro-agents mobiles comme substituts des transporteurs de médicaments dans des environnements tumoraux 3D et vascularisés. Les principales contributions de cette étude (dans le domaine de la microrobotique) sont (1) la démonstration de la microscopie de fluorescence multicolore en temps réel par démélange spectral de micro-agents, de corps organiques (sphéroïdes et vaisseaux cancéreux) et de canaux microfluidiques. (2) Développer une puce microfluidique qui immobilise un seul sphéroïde de cancer 3D à un emplacement fixe pour les tâches de livraison avec des micro-agents et l'acquisition d'images multicolores à partir d'un environnement confiné. (3) Visualisation codée par couleur en temps réel des micro-agents à l'intérieur du réseau vasculaire perfusable in vitro formé sur un système microfluidique. De plus, plusieurs expériences d'imagerie sont menées à l'aide de micro-agents de différentes géométries et tailles pour montrer nos contributions.

Pour les expériences d'imagerie, un modèle de tumeur est créé en plaçant des sphéroïdes cancéreux formés à l'aide de cellules HeLa cervicales dans la puce microfluidique développée remplie de milieu de culture. Un réseau vasculaire microfluidique in vitro et une membrane chorioallantoïque de poulet ex ovo sont utilisés comme modèles pour visualiser des micro-agents dans des environnements vascularisés. Des images multicolores sont acquises grâce à des expériences où les micro-agents sont déplacés magnétiquement à l'intérieur des modèles. L'acquisition d'images multicolores en temps réel est configurée sur la base d'un codage couleur sans ambiguïté ainsi que de l'excitation des fluorophores avec des intervalles de temps minimaux. Premièrement, la diaphonie spectrale désactive l'identification des micro-agents et de l'environnement à partir d'une seule bande spectrale et leur visualisation avec une couleur désignée. Afin de surmonter la diaphonie, les photons de fluorescence émis sont collectés à partir de trois bandes spectrales relativement bien séparées pour la formation d'images individuelles. Deuxièmement, les fluorophores ont une durée de vie limitée et l'intensité des photons de fluorescence émis diminue pendant l'imagerie en raison du photoblanchiment. Afin de prolonger la durée de vie de l'imagerie multicolore en réduisant les photodommages sur les fluorophores, une stratégie d'excitation séquentielle est utilisée.

Les avantages des stratégies d'excitation simultanées33,34 et séquentielles35,36 pour la microscopie à fluorescence multicolore sont largement étudiés à l'aide de structures cellulaires. L'excitation simultanée des fluorophores permet une acquisition d'images à partir de bandes spectrales sans délai. Cependant, les images acquises contiennent une diaphonie importante qui désactive la détection sans ambiguïté de microstructures ou de compartiments spécifiques. L'excitation séquentielle des fluorophores et le déclenchement synchrone des capteurs d'imagerie (c'est-à-dire le multiplexage spectral) surmontent la diaphonie37,38. L'inconvénient de la stratégie séquentielle est que les images résolues spectralement sont acquises avec un retard égal, ce qui limite le taux de formation de la multicouleur39. Les modèles contenant des micro-agents mobiles et stationnaires sont entièrement résolus sans diaphonie par excitation séquentielle des fluorophores de manière circulaire et acquisition d'image synchrone à la séquence d'excitation. La visualisation en temps réel des modèles est obtenue par un multiplexage spectral relativement rapide.

Présentation générale de la fabrication de micro-agents fluorescents et magnétiques par électrofilage. ( a ) Représentation schématique de la configuration d'électrofilage et du contenu de la solution de polymère. (b1) et (b2) Images au microscope électronique à balayage des mailles de fibres droites et perlées déposées sur le collecteur en utilisant l'électrofilage, respectivement. (c1) Procédé de broyage de polymères pour obtenir des micro-agents en coupant les fibres continues à l'aide d'un sonicateur. (c2) Images de fluorescence des micro-agents fabriqués. (c3) Profil de surface 3D du micro-agent visualisé par microscopie confocale. (d1) Analyse du spectre ultraviolet-visible de la coumarine-6 ​​dans le diméthylformamide (DMF). (d2) et (d3) Analyse du spectre de la coumarine-6 ​​dans du DMF à différentes longueurs d'onde d'excitation et d'émission. (e1) Microscopie à fluorescence pour visualiser le mouvement des micro-agents avec un champ magnétique de 21 mT. (e2) Les champs vectoriels superposés sur les images de fluorescence montrent le mouvement des micro-agents analysés à l'aide du flux optique Lucas – Kanade. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m.

Nos micro-agents sont fabriqués par broyage des fibres continues perlées et droites synthétisées par électrofilage (Fig. 1). Les fibres synthétisées sont constituées de polystyrène comme polymère porteur et de nanoparticules d'oxyde de fer (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) comme matériau magnétique (Fig. 1b). La coumarine 6 est choisie pour colorer les fibres car elle est immobilisée dans une matrice de polystyrène et insoluble dans l'eau. De plus, la coumarine 6 a une résistance au photoblanchiment relativement élevée. Le processus de broyage brise les fibres en fragments à l'aide d'ondes ultrasonores. Cela permet d'obtenir des micro-agents magnétiques et fluorescents dont la taille varie de 4 à 131 \(\upmu\)m (Fig. 1c1,c2). La microscopie à fluorescence à bande unique est réalisée pour visualiser le mouvement et l'interaction électrostatique des micro-agents fabriqués dans l'eau Milli-Q. La figure 2a montre le mouvement de traction de deux micro-agents fabriqués à l'aide de fibres droites. La figure 2b montre le mouvement dynamique d'un micro-agent fabriqué à l'aide de fibres perlées. Au cours des expériences d'imagerie, nous observons que les micro-agents fabriqués à partir de fibres droites sont entièrement chargés en \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) et rigides. D'autre part, la solution de polymère préparée pour la synthèse de fibres perlées permet la fabrication de micro-agents flexibles puisque la distribution de \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) est aléatoire. Les figures 2c1–c3,d1,d2 montrent le mouvement diagonal et vertical d'un micro-agent flexible utilisant un champ magnétique oscillant, respectivement. L'interaction électrostatique entre les micro-agents est visualisée à l'aide de trois expériences. La première expérience est menée pour visualiser le comportement de micro-agents dans un champ tournant. Nous observons que les micro-agents fabriqués à l'aide de fibres perlées et droites s'agrègent en raison de l'interaction dipôle-dipôle et forment un cluster au fil du temps. La figure 2e montre un cas représentatif d'une formation de grappes de micro-agents avec un champ tournant de 16 mT à 8 Hz. La deuxième expérience est conçue pour visualiser la fixation de deux micro-agents utilisant des forces électrostatiques. La figure 2f1 montre des images acquises en accéléré en mettant en évidence la pièce jointe (auto-assemblage). Le mouvement des micro-agents attachés est représenté sous forme de champs vectoriels à l'aide du flux optique de Lucas-Kanade et illustré à la Fig. 2f240. Nos résultats montrent que les micro-agents attachés se déplacent ensemble et que les forces électrostatiques empêchent la désagrégation. Dans la troisième expérience, le comportement des micro-agents est observé lorsqu'aucun champ magnétique n'est appliqué. Les images acquises révèlent que les micro-agents fabriqués à l'aide de fibres droites coulent et créent un modèle d'auto-organisation en forme de ligne dans un réservoir ouvert et un canal microfluidique (Fig. 2g1, g2). Le modèle d'auto-organisation n'est pas observé lorsque l'expérience est répétée avec les micro-agents fabriqués à l'aide de fibres perlées. Une diminution de la concentration en matériau magnétique dans les micro-agents désactive le comportement d'auto-organisation. Les micro-agents fabriqués sont utilisés comme substituts pour le transport de médicaments et attachés à des sphéroïdes de cellules HeLa colorées avec CellTracker Red CMTPX.

Microscopie à fluorescence à bande unique pour visualiser les micro-agents magnétiques marqués à la coumarine 6. (a) L'image accélérée montre le mouvement vers l'avant des micro-agents par traction magnétique. (b) La séquence d'instantanés démontre le mouvement oscillant du micro-agent. (c1) et (d1) Les images de fluorescence superposées montrent le mouvement diagonal et vertical des micro-agents, respectivement. (c2), (c3) et (d2) Modèles de mouvement oscillant des micro-agents. (e) Agrégation des micro-agents par un champ magnétique tournant. (f1) Fixation des micro-agents par interaction électrostatique. (f2) Le champ vectoriel exprime le mouvement des micro-agents attachés analysés à l'aide du flux optique de Lucas-Kanade. (g1) et (g2) Auto-organisation des micro-agents dans un réservoir et un canal microfluidique, respectivement. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m.

Nous visualisons l'attachement de micro-agents simples et multiples aux sphéroïdes de cellules HeLa avec trois expériences dans un réservoir ouvert contenant du vert d'indocyanine dans le milieu de culture. Dans toutes les expériences, des images multicolores sont formées à 15 images par seconde et des micro-agents sont dirigés vers les sphéroïdes avec une intensité de champ magnétique de 36 mT. Dans les deux premières expériences, des micro-agents à pointes acérées sont attachés en perforant les sphéroïdes (Fig. 3a1,b1). Dans la troisième expérience, trois micro-agents sont consécutivement attachés au sphéroïde. Les deux premiers micro-agents adhèrent à la surface du sphéroïde par interaction électrostatique, tandis que le troisième micro-agent est fixé par perforation (Fig. 3c1). Les pièces jointes sont vérifiées en examinant les changements à long terme à l'aide de l'imagerie dynamique. La lumière d'excitation génère un gradient de chaleur entre les zones éclairées et non éclairées, ce qui se traduit par un flux. Nous visualisons la mobilité des micro-agents dans le flux comme une méthode passive de vérification de l'attachement. L'effet du flux sur les micro-agents attachés et non attachés pendant 92 min est illustré à la Fig. 3a2. Bien que la vitesse du micro-agent attaché soit mesurée à environ 0 \(\upmu\)m/s, les micro-agents non attachés sont mobilisés par le flux. Nous observons également qu'un micro-agent non attaché déplacé par le flux s'agrège avec le micro-agent attaché en utilisant des forces électrostatiques (Fig. 3a3). Le déplacement des micro-agents agrégés est mesuré 0 \(\upmu\)m pendant 92 min. Notre expérience valide que l'attachement au sphéroïde augmente l'inertie des micro-agents et les immobilise dans le flux. Dans toutes les expériences, les attaches sont vérifiées en visualisant l'immobilité des micro-agents dans le flux pendant plus de 90 min (Fig. 3a2–c2). Les images dynamiques acquises pour la vérification révèlent également que les micro-agents attachés se déplacent avec les sphéroïdes en raison de l'évaporation du milieu à l'intérieur du réservoir par la chaleur générée (Fig. 3a3, b2, c2). Après l'évaporation complète du milieu, les déplacements sont mesurés 20 \(\upmu\)m et 68 \(\upmu\)m pour les sphéroïdes auxquels sont fixés respectivement des micro-agents simples et multiples. Afin de confirmer que l'évaporation n'affecte pas la fixation, un micro-agent est déplacé en rotation autour de sa partie insérée dans le sphéroïde avec un champ magnétique de 14 mT pendant deux minutes (Fig. 3b3). La vitesse maximale pour l'extrémité distale du micro-agent est mesurée à 1,4 corps-longueur/s (180 \(\upmu\)m/s). Aucun détachement du micro-agent du sphéroïde n'est observé. Nos résultats montrent que la microscopie multicolore génère des images codées par couleur en temps réel pour visualiser et vérifier l'attachement des micro-agents aux sphéroïdes.

Microscopie à fluorescence multicolore time-lapse pour la fixation de micro-agents magnétiques simples et multiples aux sphéroïdes de cellules HeLa. (a1 – c1) Fixation de micro-agents sur des sphéroïdes de cellules HeLa avec un champ magnétique de 36 mT. (a2,a3) Effet du flux passif sur les micro-agents attachés et non attachés. (b2,c2) Visualisation des changements dans les micro-agents attachés aux sphéroïdes. (b3) Vérification de la fixation par mouvement de rotation du micro-agent autour de sa partie insérée dans le sphéroïde après deux heures. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo ci-jointe (Partie 1).

La microscopie à fluorescence multicolore en temps réel est réalisée par excitation séquentielle des fluorophores de manière circulaire et acquisition d'images individuelles synchrones de 500 à 540 nm, 592,5 à 667,5 nm et 817,5 à 875,5 nm. Des images individuelles des micro-agents marqués à la coumarine 6 sont acquises à partir de la bande spectrale 500 à 540 nm. Les sphéroïdes sont colorés avec du CMTPX et du vert d'indocyanine pour rendre leur visualisation dans les bandes spectrales de 592, 5 à 667, 5 nm et de 817, 5 à 875, 5 nm, respectivement (Fig. 5a4). Ainsi, le mouvement simultané des sphéroïdes et des micro-agents peut être visualisé à partir de toutes les bandes spectrales utilisées en microscopie multicolore. Nos micro-agents sont capables de mobiliser les sphéroïdes de cellules HeLa par un champ magnétique externe. La figure 4a montre un sphéroïde propulsé par plusieurs micro-agents attachés dans le réservoir contenant du vert d'indocyanine dans le milieu de culture avec un champ magnétique de 60 mT. La figure 4b montre la rotation dans le sens des aiguilles d'une montre d'un sphéroïde en raison de déséquilibres dans la fixation des micro-agents lors de la propulsion. Nous mobilisons les sphéroïdes avec des micro-agents pour rendre compte des performances de la microscopie multicolore en temps réel. Le réservoir ouvert est utilisé comme banc d'essai expérimental car il permet la mobilité en translation et en rotation des sphéroïdes par la fixation de micro-agents. Les images multicolores sont formées à 15 ips, où le taux d'acquisition d'image individuelle est de 45 ips. Les figures 4c1,d1 montrent le mouvement vers l'avant de deux et plusieurs sphéroïdes propulsés par des micro-agents avec un champ magnétique de 120 mT, respectivement. La figure 4e1 montre un cas représentatif pour diriger un sphéroïde avec propulsion des micro-agents en changeant la direction du champ magnétique. Les informations de chemin obtenues par suivi visuel montrent les mouvements de translation des sphéroïdes jusqu'à 218 \(\upmu\)m/s (\(\approx\) 1,3 longueur de corps/sec) sur la Fig. 4c2,d2,e241. Afin de visualiser la mobilité rotationnelle, un sphéroïde est déplacé dans le sens des aiguilles d'une montre par une seule pièce jointe de micro-agent avec un champ magnétique maximal de 36 mT (Fig. 5a1, a4). Les informations de mouvement du sphéroïde avec micro-agent sont représentées sous forme de champs vectoriels à l'aide du flux optique de Lucas-Kanade et illustrées à la Fig. 5a2. Les champs de vecteurs et la trajectoire du micro-agent attaché affichent que le sphéroïde tourne autour de son axe avec une vitesse angulaire maximale de 1,2 rad/s (Fig. 5a3). La mobilité rotationnelle et translationnelle est visualisée ensemble en actionnant deux sphéroïdes collés avec un cluster de micro-agents dans un champ magnétique rotatif de 16 mT à 1 Hz (Fig. 5b1). La figure 5b2 montre le champ de mouvement pour la rotation des deux sphéroïdes avec le cluster de micro-agents. Le mouvement de translation des sphéroïdes est tracé sur la figure 5b3. Nos expériences montrent que la microscopie multicolore permet de visualiser le mouvement simultané de plusieurs sphéroïdes et micro-agents dans des champs magnétiques variant dans le temps jusqu'à une vitesse de translation de 504 \(\upmu\)m/s (\(\approx\) 3,4 corps- longueur/s pour un sphéroïde) à 15 fps. Nous validons également que les sphéroïdes en tant que corps organique peuvent être activés par des micro-agents uniques, multiples et un groupe de micro-agents dans un environnement de réservoir. Afin d'immobiliser un seul sphéroïde pour la fixation de micro-agents et de fournir un environnement confiné pour la microscopie multicolore, une puce microfluidique est développée.

Traduction de sphéroïdes de cellules HeLa par des micro-agents magnétiques dans un réservoir rempli de milieu de culture et de vert d'indocyanine. (a1) Propulser un seul sphéroïde par connexion de micro-agents. (a2) Microscopie bicolore accélérée pour la connexion de micro-agents au sphéroïde. (b1) Rotation d'un sphéroïde provoquée par la propulsion de micro-agents. (b2) Démonstration de la rotation sphéroïde par des images de gradient. (c1,d1) Traduction simultanée de deux et plusieurs sphéroïdes par des micro-agents, respectivement. (e1) Pilotage d'un sphéroïde propulsé par des micro-agents en changeant la direction du champ magnétique. (c2 – e2) Informations sur le chemin et la vitesse des sphéroïdes dans (c1 – e1), respectivement. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo ci-jointe (Partie 1).

Rotation et translation de sphéroïdes de cellules HeLa avec fixation de micro-agents dans un réservoir rempli de milieu de culture et de vert d'indocyanine. (a1,b1) Actionnement des sphéroïdes avec un seul et un groupe de micro-agents, respectivement. (a2,b2) Les champs vectoriels superposés sur les images multicolores accélérées montrent le mouvement de rotation des sphéroïdes analysés à l'aide du flux optique de Lucas-Kanade. (a3,b3) Profil de mouvement et informations de vitesse des sphéroïdes. (a4) Décomposition de l'image spectrale de l'image multicolore au temps zéro. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo ci-jointe (Partie 1).

Pour créer un modèle de tumeur simplifié en 3D, une puce microfluidique capable d'immobiliser un seul sphéroïde de cellule HeLa d'un diamètre compris entre 100 et 250 \(\upmu\)m est développée42. La puce contient une chambre construite à l'aide d'un réseau de piliers en forme de U avec un espacement de 80 \(\upmu\)m, qui bloque la fuite du sphéroïde et permet l'entrée de micro-agents (Fig. 6a1). Lors de l'injection, les piliers emprisonnent le sphéroïde (Fig. 6a2). Une bulle d'air est ensuite transférée dans la puce pour immobiliser le sphéroïde en créant une différence de pression entre l'intérieur et l'extérieur du réseau de piliers (Fig. 6a3). Ainsi, le sphéroïde est fixé à un certain emplacement pour les expériences multicolores, contrairement au positionnement aléatoire dans le réservoir ouvert. La puce est remplie de 250 \(\upmu\)g/ml de vert d'indocyanine dans le milieu de culture cellulaire pour la rendre visible en microscopie à fluorescence. Le milieu et les micro-agents sont injectés sans déplacer le sphéroïde en raison de la différence de pression. La figure 6b montre une image multicolore time-lapse pour un micro-agent passant entre deux piliers et sous un sphéroïde immobilisé. La figure 6c1 montre une seule fixation de micro-agent en perforant un sphéroïde immobilisé avec un champ magnétique de 36 mT. L'imagerie dynamique est réalisée à 15 fps pendant 395 min pour valider que la puce maintient les sphéroïdes auxquels les micro-agents sont attachés pour la microscopie multicolore à long terme. Les images dynamiques acquises révèlent que la résistance au photoblanchiment du vert d'indocyanine est inférieure à celle de la coumarine 6 et du CMTPX. L'imagerie par fluorescence de la puce est impossible en raison du photoblanchiment du vert d'indocyanine à la minute 170, où les baisses d'intensité des pixels du sphéroïde et du micro-agent sont respectivement de 21, 2% et 1, 6% (Fig. 6c2, c3). Afin de récupérer l'imagerie de fluorescence de la puce, la lumière d'excitation est éteinte pendant une heure. La diffusion de molécules de vert d'indocyanine non blanchies de l'extérieur de la zone d'imagerie vers l'intérieur pendant le temps mort permet à nouveau la microscopie multicolore (Fig. 6c4)43. La récupération de fluorescence ne peut pas être effectuée dans le réservoir car le milieu s'évapore complètement en raison de la chaleur produite par la lumière d'excitation (Fig. 3a3,b2,c2). Le réservoir n'est pas scellé pour montrer la différence entre les plates-formes microfluidiques ouvertes et fermées en termes d'acquisition d'images multicolores. Les expériences menées dans notre étude démontrent que le réservoir (en tant que plate-forme ouverte) et la puce microfluidique (en tant que plate-forme fermée) peuvent être utilisés pour la microscopie multicolore en temps réel. Cependant, l'évaporation du milieu à l'intérieur du réservoir empêche l'acquisition d'images multicolores après un certain temps. Un réservoir ouvert n'est pas un environnement stable pour visualiser les changements à long terme en utilisant l'imagerie dynamique multicolore tant qu'il n'est pas scellé avec une chambre transparente étanche à l'air pour empêcher l'évaporation. D'autre part, la puce conserve le milieu chauffé à l'intérieur pour (1) permettre une microscopie à long terme et (2) prolonger le temps d'imagerie multicolore par récupération de fluorescence. Afin de vérifier que la récupération de la fluorescence n'affecte pas la fixation, le micro-agent est déplacé de manière aléatoire avec un champ magnétique de 14 mT entre les minutes 264 et 267 (Fig. 6c5). La vitesse maximale pour l'extrémité distale du micro-agent est mesurée à 67 \(\upmu\)m/s (1,3 longueur de corps/s), et aucun détachement n'est observé. La figure 6c6 vérifie l'attachement en montrant la partie du micro-agent à l'intérieur du sphéroïde à la minute 395. Plusieurs micro-agents sont attachés à un sphéroïde immobilisé avec un champ tournant de 16 mT à 5 Hz (Fig. 6d). Nous observons que les micro-agents attachés forment un cluster au fil du temps en raison de l'interaction dipôle-dipôle (Fig. 6e). Bien qu'un cluster de micro-agents ait la capacité d'actionner des sphéroïdes comme le montre la figure 4b1, le déplacement du sphéroïde est mesuré à 0 \(\upmu\)m pendant 137 min. Notre expérience montre que la puce crée un environnement statique pour la microscopie multicolore en permettant à plusieurs micro-agents d'être attachés sans déplacer le sphéroïde. Nous validons expérimentalement que notre modèle de tumeur fournit un banc d'essai contrôlable et stable pour l'acquisition d'images multicolores d'attachements de micro-agents simples et multiples à un sphéroïde. Afin de vérifier que la microscopie multicolore peut visualiser des micro-agents dans des environnements vascularisés, un réseau vasculaire sur un système microfluidique est utilisé comme banc d'essai expérimental.

Microscopie à fluorescence multicolore pour visualiser les micro-agents magnétiques dans un environnement microfluidique. (a1) Disposition de la puce conçue pour immobiliser un seul sphéroïde de cellule HeLa. (a2) Micro-agent attaché à un sphéroïde piégé. (a3) Immobilisation d'un sphéroïde à l'aide d'une bulle d'air. (b) L'image superposée montre un micro-agent voyageant sous un sphéroïde immobilisé. (c1) Fixation d'un micro-agent à un sphéroïde immobilisé. (c2–c4) Récupération de la fluorescence après photoblanchiment du vert d'indocyanine. (c5) Vérification de l'attachement en déplaçant magnétiquement le micro-agent. (c6) Les flèches indiquent la partie du micro-agent à l'intérieur du sphéroïde. (d) Espace de travail de la configuration utilisée pour la microscopie et l'actionnement magnétique. (e) Formation d'un cluster de micro-agents attaché au sphéroïde. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo ci-jointe (Partie 2).

Le réseau vasculaire perfusable in vitro est conçu par co-culture de RFP-HUVEC et de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse dans un système microfluidique. Pour la microscopie multicolore, 250 \(\upmu\)g/ml de vert d'indocyanine dans le milieu de culture cellulaire et des micro-agents sont injectés dans le système. La figure 7a1 représente une image multicolore statique du système microfluidique mettant en vedette le réseau vasculaire d'ingénierie et les micro-agents. La figure 7a2 montre la vue agrandie du ROI défini sur l'image multicolore et met en évidence le mouvement des micro-agents dans le réseau vasculaire par flux passif et traction magnétique avec un champ de 70 mT. Le micro-agent (1) se déplace librement le long du champ magnétique, tandis que les micro-agents (2) et (3) frappent les parois de la lumière après 33 s. Notre expérience montre que les micro-agents pénètrent dans le réseau vasculaire via les ouvertures de la lumière et peuvent être suivis simultanément (Fig. 7a3). La figure 7b montre la formation d'images multicolores représentatives et vérifie que les micro-agents, le réseau vasculaire et le système microfluidique sont résolus spectralement dans trois bandes spectrales distinctes. La morphologie structurelle du réseau vasculaire est visualisée à partir de bandes à double spectre (592, 5–667, 5 nm et 817, 5–875, 5 nm) en raison de la diffusion du vert d'indocyanine dans le milieu de culture (Fig. 7b2, b3). Cela permet une visualisation complète de la structure vasculaire et délimite clairement l'espace hydrogel (Fig. 7b4,b5). La mobilité des micro-agents à l'intérieur du réseau vasculaire est visualisée dans trois séries d'expériences multicolores dans des conditions de culture non cellulaire. Dans toutes les expériences, les images multicolores sont acquises à 3 images par seconde pour minimiser les dommages causés par la photo sur RFP. Le taux d'acquisition d'images plus élevé est réalisable avec des conditions d'incubation puisque les RFP-HUVEC ont un bon métabolisme de travail actif pour reconstruire les signaux de fluorescence. La première expérience est menée pour visualiser un micro-agent déplacé par le flux passif (Fig. 7c). La vitesse moyenne du micro-agent est calculée comme 3,3 corps-longueur/sec (25 \(\upmu\)m/s). La deuxième expérience est conçue pour visualiser des micro-agents tirés magnétiquement contre le flux passif avec un champ de 42 mT. La figure 7d, e montre les images accélérées superposées du mouvement des micro-agents avec une vitesse moyenne de 1,4 corps-longueur/s (17 \(\upmu\)m/s) et 2,5 corps-longueur/s (12 \ (\upmu\)m/s), respectivement. Dans la troisième expérience, l'agrégation de trois micro-agents utilisant des forces électrostatiques est visualisée (Fig. 7f1). Les micro-agents agrégés sont déplacés par le flux passif avec une vitesse moyenne de 0,04 corps-longueur/s (4 \(\upmu\)m/s) (Fig. 7f2,f3). Les images multicolores acquises révèlent qu'aucune désagrégation ne se produit pendant 186 s (Fig. 7f1, f2). Nos expériences d'imagerie démontrent que la microscopie multicolore : (1) fournit une résolution spatio-temporelle pour l'analyse quantitative des micro-agents à l'intérieur du système vasculaire, (2) permet l'acquisition d'images des micro-agents avec une longueur minimale de 5 \(\upmu\)m , (3) permet un codage couleur sans ambiguïté des micro-agents et de la morphologie vasculaire modifiée en temps réel. Ensuite, nous rapportons les performances de la microscopie multicolore en visualisant des micro-agents à l'intérieur et à l'extérieur des vaisseaux sanguins naturels.

Microscopie à fluorescence multicolore pour visualiser les micro-agents magnétiques dans un réseau vasculaire perfusable. ( a1 ) Image multicolore des micro-agents marqués à la coumarine 6 dans un système vasculaire formé avec des RFP-HUVEC sur un système microfluidique rempli de milieu de culture et de vert d'indocyanine. (a2) Mouvement des micro-agents par flux passif et traction magnétique avec un champ de 70 mT. (a3) Chemin et vitesse des micro-agents. (b) Formation d'images multicolores en superposant les images acquises spectralement différentes. (c1,d1–e1) Mouvement des micro-agents dans une lumière par flux passif et tirage magnétique avec un champ de 42 mT, respectivement. (c2–e2) Images de fluorescence fusionnées des micro-agents et des lumières. (f1,f2) L'agrégation et le mouvement des micro-agents dans un système vasculaire par flux passif, respectivement. (f3) Vitesse et trajectoire des micro-agents agrégés. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo ci-jointe (Partie 3).

Le système vasculaire ex ovo de la membrane chorioallantoïque (CAM) contenant les vaisseaux sanguins multi-échelles hiérarchiques est utilisé pour visualiser les micro-agents dans un environnement natif (Fig. 8a1). Les figures 8a2,a3 montrent la morphologie structurelle de la vascularisation visualisée en utilisant le fond clair comme référence et la microscopie multicolore avec autofluorescence des érythrocytes, respectivement. L'image multicolore est formée par un mélange spectral de trois caractéristiques cellulaires principales : la vascularisation, les érythrocytes et la CAM (Fig. 8a4). Nous perfusons la CAM à l'aide de DPBS pour éliminer complètement les érythrocytes flottants dans les structures vasculaires. Cette structure vasculaire décellularisée permet la libre circulation des micro-agents ainsi que de multiples solutions de fluorophores. Pour la coloration, le système vasculaire est placé dans une boîte de Pétri contenant 250 \(\upmu\)g/ml de vert d'indocyanine dans du milieu de culture, 100 \(\upmu\)g/ml de Rhodamine B dans de l'eau et les micro-agents pendant une nuit. période. Avant les expériences d'imagerie, la boîte contenant l'échantillon coloré est lavée avec du DPBS par agitation manuelle pendant 15 min pour éviter l'agrégation des micro-agents sur la CAM. Une partie circulaire d'un diamètre de 15 mm est découpée dans l'échantillon et transférée sur un réservoir en PDMS pour la microscopie multicolore. L'image multicolore statique représentative d'un vaisseau sanguin bifurqué décellularisé et des micro-agents après lavage au DPBS est illustrée à la Fig. 8b1. Les ROI (1) à (3) définies sur le plan d'image multicolore mettent en évidence les micro-agents sur la membrane chorioallantoïque, sur la paroi du vaisseau et à l'intérieur du vaisseau, respectivement. Afin de révéler des détails sur les micro-agents et les vaisseaux, la vue agrandie des ROI (1) à (3) est illustrée aux Fig. 8b1 à b3, respectivement. La décomposition de l'image spectrale du retour sur investissement (2) et (3) vérifie que les micro-agents et le vaisseau sont imagés à partir de différentes bandes de spectre, et qu'il existe une différence de contraste entre la CAM et la paroi du vaisseau (Fig. 8b2,b3). La différence de contraste diminue de 90 % puisque les pores hétérogènes présents sur la paroi du vaisseau permettent la diffusion de la rhodamine B et du vert d'indocyanine (Fig. 8c, d). Des images multicolores en temps réel sont acquises à 5 ips avec un temps d'exposition de 66 ms, où les micro-agents sont tirés avec un champ magnétique de 42 mT. La vitesse moyenne des micro-agents se déplaçant à l'extérieur et à l'intérieur du vaisseau est calculée comme 1 corps-longueur/s longueur/s (8 \(\upmu\)m/s) et 0,5 corps-longueur/s longueur/s (2 \(\upmu\)m/s), respectivement (Fig. 8c,d). Le micro-agent à l'intérieur du récipient est tiré jusqu'à ce qu'il atteigne la paroi. Le déplacement du micro-agent après avoir atteint la paroi du vaisseau est mesuré à 0 \(\upmu\)m pendant 5 min, tandis que les micro-agents à l'extérieur se déplacent le long du champ magnétique (Fig. 8d). Notre expérience démontre que la microscopie multicolore fournit une visualisation en temps réel des micro-agents à l'intérieur des vaisseaux sanguins naturels.

Microscopie à fluorescence multicolore pour la visualisation des micro-agents magnétiques dans la membrane chorioallantoïque de poulet ex ovo. (a1) Échantillon préparé pour la visualisation du réseau vasculaire en utilisant la propriété d'autofluorescence des érythrocytes. (a2,a3) Images en fond clair et multicolores du réseau, respectivement. (a4) Décomposition spectrale du ROI sur (a3). (b1) Image multicolore des micro-agents marqués à la coumarine 6 et d'un récipient contenant de la rhodamine B et du vert d'indocyanine. ROI (1)–(3) sur (b1) montrant les micro-agents sur la membrane, sur la surface du vaisseau et à l'intérieur du vaisseau, respectivement. (b2,b3) Vue agrandie et décomposition spectrale des ROI (2) et (3), respectivement. (c, d) Mouvement magnétique des micro-agents à l'extérieur et à l'intérieur des vaisseaux, respectivement. Barre d'échelle 100 \(\upmu\)m. Veuillez vous référer à la vidéo d'accompagnement (Partie 4).

Dans ce travail, nous démontrons la microscopie à fluorescence multicolore pour visualiser des micro-agents polymères dans des modèles 3D de tumeur sur puce et de système vasculaire pour l'application envisagée de l'administration ciblée de médicaments. Par rapport aux techniques d'imagerie utilisées dans la littérature, les micro-agents et les environs sont résolus spectralement dans trois bandes spectrales distinctes, et la visualisation codée par couleur des modèles est acquise. Nous validons expérimentalement que la microscopie multicolore permet l'acquisition d'images spectralement différentes de micro-agents à différents rapports d'aspect, corps organiques, milieux environnants jusqu'à 15 ips et détection de mouvement séquentielle jusqu'à 504 \(\upmu\)m/s à partir de chaque spectre groupe. Grâce au codage couleur, une meilleure compréhension de l'identification et de la discrimination de chaque micro-composant est obtenue. Nos mesures montrent que la microscopie multicolore délimite les compartiments spatiaux en temps réel pour analyser et vérifier la fonctionnalité des micro-agents. Nous nous attendons à ce que la microscopie multicolore en temps réel accélère la mise en pratique des micro-agents en permettant la visualisation claire requise.

La configuration d'électrofilage pour la fabrication de micro-agents est construite à l'aide d'une alimentation haute tension (60C24-P250-I5, Advanced Energy, États-Unis) et d'une pompe à seringue (NE-4000, New Era Pump Systems, États-Unis) (Fig. 1a) . Une unité d'acquisition de données (34972A, 34901A, 34907A, Keysight, États-Unis) est utilisée à la fois pour transférer les signaux de commande vers l'alimentation haute tension et pour collecter les données de rétroaction. La configuration est placée à l'intérieur d'une enceinte hermétique pour assurer une fabrication reproductible en fournissant la même condition de convection d'air. La solution de polymère pour l'électrofilage se compose de granulés de polystyrène (430102-1KG, Sigma-Aldrich, USA) comme polymère porteur, de N,N-Diméthylformamide (DMF) anhydre comme solvant (227056-1L, Sigma-Aldrich, USA), de coumarine 6 ( 442631-1G, Sigma-Aldrich, USA) en tant que fluorophore hydrophobe, et nanoparticules d'oxyde de fer (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) (637106-25G, Sigma-Aldrich, USA ) comme matériau magnétique44,45. Pour la fabrication de fibres continues perlées et droites, des solutions à 30,02 % (19,8 % de polystyrène, 10,0 % \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2 % de coumarine 6) et 45,25 % (30,1 % de polystyrène, 15,0 % \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2 % de coumarine 6) rapport poids/volume dans du DMF sont préparés, respectivement. \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) et le DMF sont d'abord soniqués pendant 30 min pour désagréger les particules. Des pastilles de polystyrène et de la coumarine 6 sont ensuite ajoutées au mélange et mélangées à l'aide d'un mélangeur à rouleaux (LLG-uniRoller 6, LLG-Labware, Allemagne) pendant 12 h pour obtenir une solution homogène. Pour le processus d'électrofilage, la solution de polymère est placée dans une seringue en plastique et reliée par un tube en téflon à une aiguille à pointe émoussée de calibre 18 (TS18SS-15, Adhesive Dispensing Ltd., Royaume-Uni). La tension d'accélération, le débit d'alimentation de la solution et la distance pointe-collecteur sont respectivement définis à 14 kV, 2,5 mL/h et 16 cm. Une solution de polymère de 0,04 ml est électrofilée à la fois et des mailles de fibres sont déposées sur une feuille d'aluminium mise à la terre à 24 \(^{\circ }\)C et 22 % d'humidité. Le résidu de solvant sur les fibres électrofilées est éliminé par séchage à température ambiante pendant 12 heures. Les figures 1b1,b2 montrent les morphologies des mailles de fibres imagées par microscopie électronique à balayage (JSM-7200F, JEOL, Japon). Les mailles de fibres déposées sont coupées en morceaux de 2-3 mm à l'aide d'un scalpel puis immergées dans un flacon en verre contenant 1 % (volume/volume) de Tween 80 (P4780-100ML, Sigma-Aldrich, USA) dans de l'eau Milli-Q. Des micro-agents fluorescents et magnétiques sont obtenus en coupant les fibres à l'aide d'un sonicateur (2510, Branson, USA) pendant 2 h (Fig. 1c1). Le processus de broyage du polymère par sonication raccourcit de manière aléatoire les fibres continues pour obtenir des micro-agents. La configuration d'électrofilage est également conçue pour déposer les fibres sur le collecteur avec une orientation aléatoire. Cette technique de fabrication est sélectionnée pour permettre la validation de l'acquisition d'images multicolores à l'aide de micro-agents à distribution de taille aléatoire. Afin d'obtenir des micro-agents aux tailles souhaitées, les fibres synthétisées peuvent être alignées avec un collecteur à tambour et coupées à l'aide d'un laser46. De plus, le processus d'électropulvérisation assure la fabrication de micro-agents en forme de perles avec une distribution de taille étroite. La configuration peut être utilisée pour l'électropulvérisation sans aucune modification47. La figure 1c2 montre des images de fluorescence des micro-agents fabriqués. Le profil de surface d'un micro-agent caractérisé par microscopie confocale (S Neox, Sensofar, Espagne) est illustré à la Fig. 1c3. Afin de déterminer les gammes de longueurs d'onde d'excitation et d'émission optimales pour la microscopie à fluorescence, le spectre des micro-agents est caractérisé à l'aide d'un spectrofluorimètre (FP-8300, Jasco, Japon).

La solution pour l'analyse spectrale est préparée en dissolvant 2,11 mg de coumarine 6 dans 5 ml de DMF. 10 \(\upmu\)l de solution sont dilués avec 690 \(\upmu\)l de DMF dans une cuvette en quartz (CV10Q700F, Thorlabs, USA) pour la mesure. Les spectres d'excitation et d'émission ultraviolets et visibles, la plage de longueurs d'onde comprise entre 200 et 900 nm, sont mesurés à l'aide d'une analyse de spectre 2D (Fig. 1d1). Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission maximales pour la coumarine 6 dans le DMF sont respectivement mesurées à 461 nm et 505 nm. Une analyse de spectre 3D est effectuée pour mesurer le spectre d'émission à différentes longueurs d'onde d'excitation. La solution est excitée entre 350 nm et 500 nm avec un incrément de 1 nm et les photons fluorescents émis sont collectés dans la gamme de longueurs d'onde de 450 nm et 600 nm (Fig. 1d2, d3). Notre mesure montre que les photons de fluorescence d'intensité maximale sont collectés lorsque l'excitation et l'émission sont effectuées avec des bandes de spectre de 436 à 477 nm et de 497 à 518 nm, respectivement. Selon l'analyse du spectre, les bandes 450–490 nm et 500–540 nm sont sélectionnées pour exciter la coumarine 6 et collecter les photons fluorescents émis pour la visualisation des micro-agents fabriqués, respectivement. La figure 1e1 montre un exemple de microscopie à fluorescence à bande unique pour le mouvement magnétique d'un micro-agent. Une microscopie multicolore est réalisée pour visualiser les micro-agents dans un environnement tumoral contenant des sphéroïdes de cellules HeLa d'un diamètre de 200 \(\upmu\)m.

Les cellules HeLa sont cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (11-965-092, Fisher Scientific Ltd. Canada), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (F7524-500ML, Sigma-Aldrich, États-Unis) et de 1 % (volume/volume ) pénicilline-streptomycine (15-140-122, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)29. Les cellules en 2D sont cultivées et passées à 80% de confluence et un changement de milieu est effectué toutes les 48 heures. Pour la formation de sphéroïdes cancéreux 3D, les cellules sont trypsinisées, remises en suspension à une densité de \(2\fois {10}^6\) cellule/ml et ensemencées dans de l'agarose à 3 % (poids/volume) (16500500, ultra-pur agarose, Invitrogen, États-Unis) matrices de micropuits résultant en une moyenne de 267 cellules par sphéroïde. La moitié du changement de milieu est effectuée quotidiennement. Au jour 3, les sphéroïdes sont collectés et colorés avec \ (10 ​​\, \ upmu \ hbox {M} \) CellTracker Red CMTPX (C34552, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) par incubation de 45 min dans un milieu sans sérum et lavés deux fois avec du milieu de culture cellulaire. Les cultures 2D et 3D sont réalisées dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 \(^\circ\)C. Pour un stockage à long terme, les sphéroïdes 3D colorés avec CMTPX sont fixés à température ambiante avec 4 % de formaldéhyde (F8775-25ML, Sigma-Aldrich, États-Unis) pendant 15 min, puis lavés deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Pour les expériences d'imagerie, les sphéroïdes sont immobilisés et maintenus à l'aide de la puce microfluidique développée (Fig. 6a).

La méthode standard de lithographie douce est utilisée pour fabriquer un moule négatif des puces d'une hauteur de 187 \(\upmu\)m à l'aide d'un photorésist SU-848. Le processus de salinisation est effectué pour faciliter l'élimination de la couche de polydiméthylsiloxane (PDMS) en améliorant l'hydrophilie de surface du moule. Un mélange dégazé de PDMS 10: 1 et d'agent de durcissement (Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit, Dow Corning, USA) est versé sur le moule et durci à 70 \ (^ \ circ \) C dans le four pendant 12 h. Une fois la couche de PDMS durcie retirée, les orifices d'entrée et de sortie sont perforés. La fabrication de la puce est complétée par le collage de la couche PDMS sur un verre de microscope à l'aide d'une oxydation au plasma. La force de liaison est améliorée en cuisant la puce sur une plaque chauffante à 70 \(^\circ\)C pendant 4 h. Un sphéroïde unicellulaire est d'abord transféré dans la puce et immobilisé par une injection de bulles d'air. Les micro-agents sont mélangés avec 250 \(\upmu\)g/ml de vert d'indocyanine (I2633-25MG, Sigma-Aldrich, USA) dans le milieu de culture puis injectés dans la puce par pipetage. Ainsi, un modèle de tumeur 3D est créé pour l'acquisition d'images multicolores (Fig. 6a3). Afin de montrer que la microscopie multicolore fournit des images à résolution spectrale pour les micro-agents dans des modèles vascularisés, un réseau vasculaire perfusable est formé sur un canal microfluidique.

Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine à protéine de fluorescence rouge (RFP-HUVEC) (cAP-0001, Angio-Proteomie, USA) sont cultivées en 2D avec le milieu de croissance des cellules endothéliales-2 (milieu EGM-2) (Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit, C-22111, Promo Cell, USA) avec 1 % (volume/volume) (v/v) de pénicilline-streptomycine. En parallèle, des cellules souches mésenchymateuses (PT-2501, Lonza, USA) sont cultivées en 2D dans du milieu minimum essentiel eagle-alpha modification (22571020, Thermo Fisher Scientific, USA) additionné de 10% (v/v) de sérum bovin fœtal (F7524v , Sigma-Aldrich, États-Unis), l-glutamine 2 mM (35050061, Thermo Fisher Scientific, États-Unis), acide ascorbique 0,2 mM (A8960-5G, Sigma Aldrich, États-Unis), pénicilline-streptomycine 1 % (v/v) (15 -140-122, Thermo Fisher Scientific, États-Unis) et 1 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes de base (PHG0261, Thermo Fisher Scientific, États-Unis). Les deux types de cellules sont cultivées dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 \(^{\circ }\)C et sont utilisées entre les passages 4 et 6. Les cellules sont cultivées jusqu'à 80 % de confluence avant le détachement et mélangées dans un concentration de \(10\fois 10^{6}\) cellules/ml (ratio 1 pour 1) dans un hydrogel de fibrine à une concentration finale de 3 mg/ml (Fibrinogen, 0215112201, MP Biomedicals, USA) et 3 U de thrombine (0215416301, MP Biomedicals, USA). Le mélange cellule-matrice est injecté dans la chambre d'hydrogel du port de chargement de gel du système microfluidique et est autorisé à polymériser dans l'incubateur à 37 \(^{\circ}\)C pendant 15 min. Avant, la surface microfluidique est fonctionnalisée pour favoriser une forte interaction hydrogel avec le PDMS et le verre en incubant la puce microfluidique après liaison par oxydation plasma pendant 4 h avec du bromhydrate de poly-d-lysine (P1024-10MG, Sigma-Aldrich, États-Unis) avec ce qui suit étapes de lavage avec de l'eau Milli-Q stérile. Après la polymérisation de l'hydrogel, les ports de chargement de gel sont bloqués avec des bandes de feuille d'étanchéité de plaque PCR standard pour éviter les fuites fluidiques et les canaux d'écoulement à côté du canal d'hydrogel sont remplis de milieu EGM-2. La chute de pression de 5 Pa pour créer les stimuli mécaniques pour la vascularisation in vitro est établie en connectant deux pousse-seringues (AL-1600, New Era Pump Systems, USA) sur des côtés opposés verticalement. Un aperçu du système microfluidique pour la création de vascularisation in vitro est illustré dans la Fig. 1 supplémentaire. Le port d'entrée est utilisé pour injecter le milieu EGM-2 et le port de sortie pour le retirer tandis que les ports fluidiques sont bloqués avec du PDMS après le premier remplissage. En appliquant des débits prédéterminés avec le milieu EGM-2 par des études de flux réalisées à l'aide de COMSOL Multiphysics (version 5.5, COMSOL AB, Suède). La dépression est maintenue pendant 7 jours avant les expériences. Pour la microscopie multicolore, 250 \(\upmu\)g/ml de vert d'indocyanine dans le milieu de culture cellulaire et des micro-agents sont injectés dans le système microfluidique. La figure 7a1 montre les micro-agents dans le réseau vasculaire modifié. Afin de visualiser les micro-agents dans les vaisseaux naturels, une membrane chorioallantoïque de poulet ex ovo est utilisée comme banc d'essai.

Les embryons de poussin White Leghorn sont incubés à 38 \(^\circ\)C et 65 % d'humidité tout au long du processus de culture. Au jour 10, le contenu des œufs est craqué dans des boîtes de Pétri de culture cellulaire de 60 mm49. L'albumine d'œuf et le contenu du jaune sont éliminés à l'aide de pipettes de manipulation de liquide visqueux. Le système vasculaire est lavé trois fois à l'aide d'une solution glacée de DPBS (14190250, Thermo Fisher Scientific, États-Unis), puis fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % (1004965000, Sigma-Aldrich, États-Unis) pendant une nuit à 4 \(^\circ\)C pendant une longue période. -stockage à terme. Ceci est suivi d'une incubation avec 0,3% de Triton X-100 (T8787-250ML, Sigma-Aldrich, USA) dans du DPBS pendant 30 minutes et d'un lavage trois fois avec une solution de PBS glacée. Pour la microscopie multicolore, le système vasculaire est d'abord décellularisé (érythrocytes retirés) puis coloré avec de la rhodamine B (K94900-25, Labshop, Pays-Bas) et du vert d'indocyanine.

La microscopie multicolore à champ large en temps réel est réalisée par excitation des fluorophores à partir de trois bandes spectrales différentes de manière circulaire29. La lumière de fluorescence émise est collectée de manière synchrone pour acquérir des images individuelles en niveaux de gris 8 bits avec 1280 \(\times\) 1024 pixels. Des objectifs à longue distance de travail 10x et 5x (Plan Apo, Mitutoyo, Japon) sont utilisés pour focaliser la lumière d'excitation sur les échantillons et collecter les photons fluorescents émis, respectivement. La coumarine 6 et le vert d'indocyanine sont excités respectivement dans les bandes spectrales de 450 à 490 nm et de 750 à 800 nm. La lumière émise est collectée de 500 à 540 nm pour la coumarine 6 et de 817,5 à 875,5 nm pour le vert d'indocyanine, respectivement. CMTPX, RFP-HUVEC et Rhodamine B sont excités à partir de la bande de 554,5 à 589,5 nm, et la lumière émise est collectée dans la gamme de longueurs d'onde de 592,5 à 667,5 nm. Les valeurs d'intensité dans les images individuelles acquises de 500 à 540 nm, 592,5 à 667,5 nm et 817,5 à 875,5 nm sont représentées respectivement à l'aide de cartes de couleur noir-vert, noir-rouge, noir-bleu (Figs. 5a4, 7b , 8a4). Des images multicolores sont formées en superposant les images individuelles converties en couleur acquises en un tour. Un réseau orthogonal de quatre bobines électromagnétiques à noyau de fer avec une fréquence de coupure de 110 Hz est placé dans l'espace de travail du microscope pour déplacer les micro-agents à l'aide du champ de rotation (Fig. 6d). Pour la dissipation thermique, le réseau de bobines est monté sur un support en aluminium à l'aide de colliers coniques. Les bobines sont recouvertes d'un ruban de cuivre pour améliorer le transfert de chaleur et l'isolation électrique. Des amplificateurs commutables alimentés en courant continu (EA-PS 5040-20A, EA Elektro-Automatik, Allemagne) sont utilisés pour alimenter les bobines50. Un générateur de signaux (4050B, BK Precision, USA) est utilisé pour générer des signaux de référence pour la fréquence du champ tournant. Les signaux sont distribués à un pilote de bobine correspondant à l'aide d'une interface de démultiplexeur (74HC4052, Texas Instruments, USA) par détection de front descendant à l'aide d'un microcontrôleur. Le champ magnétique maximal produit par le réseau de bobines est mesuré à 30 mT à l'aide d'un teslamètre (3MH3A, Senis AG, Suisse). La force de traction magnétique est générée à l'aide de deux aimants permanents néodyme-fer-bore (S-45-30-N, Supermagnete, Allemagne). Le champ magnétique maximal et le gradient générés par les aimants sont respectivement mesurés à 120 mT et 5 T/m.

Selon les directives néerlandaises sur les soins aux animaux, l'approbation de l'IACUC pour l'expérimentation d'embryons de poulet n'est pas nécessaire à moins que l'éclosion ne soit prévue. De plus, seules les expériences avec des embryons de poulet de développement EDD14 et plus nécessitent l'approbation de l'IACUC. Les embryons utilisés dans cette étude étaient tous aux premiers stades du développement embryonnaire (EDD10). Les œufs de poule fécondés utilisés dans cette étude ont été achetés auprès de fermes d'œufs de volaille agréées aux Pays-Bas. Les études de culture RFP-HUVEC ont été approuvées par le ministère néerlandais et les expériences ont été réalisées dans un environnement de laboratoire ML-1, suivi des politiques universitaires et du protocole standard.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Pelin Kubra Isgor pour avoir présenté l'idée de conception initiale de la puce microfluidique. Ils souhaitent également remercier Efe Bulut, Wouter Abbas, Edwin Morsink, Nick Helthuis, Erik G. de Vries, Michiel Richter, Vasileios Trikalitis et Juan Sevilla pour leur assistance technique et leurs discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre du projet ROBOTAR Grant 638428 : Robot-Assisted Flexible Needle Steering for Targeted Delivery of Magnetic Agents.

Laboratoire de robotique chirurgicale, Département de génie biomécanique, Université de Twente, 7522 NB, Enschede, Pays-Bas

Mert Kaya, Islam SM Khalil & Sarthak Misra

Laboratoire de robotique chirurgicale, Département de génie biomédical et Centre médical universitaire de Groningue, Université de Groningue, 9713 AV, Groningue, Pays-Bas

Mert Kaya, Zhengya Zhang et Sarthak Misra

Laboratoire de vascularisation, Département de génie biomécanique, Université de Twente, 7522 NB, Enschede, Pays-Bas

Fabian Stein, Prasanna Padmanaban et Jeroen Rouwkema

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MK a développé le microscope à fluorescence multicolore, conçu la configuration d'électrofilage et fabriqué des micro-agents. MK et ZZ ont conçu des composants mécaniques dans la configuration d'électrofilage. MK et FS ont modifié et fabriqué la puce microfluidique. FS a formé des sphéroïdes de cellules HeLa et conçu un réseau vasculaire in vitro sur le système microfluidique. PP a incubé des embryons de poulet et préparé des échantillons de membrane chorioallantoïque ex ovo. MK, FS et PP ont réalisé des expériences et préparé le manuscrit. ISMK, JR et SM ont fourni des commentaires scientifiques. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Mert Kaya.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kaya, M., Stein, F., Padmanaban, P. et al. Visualisation des micro-agents et de leur environnement par microscopie à fluorescence multicolore en temps réel. Sci Rep 12, 13375 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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Reçu : 22 avril 2022

Accepté : 22 juillet 2022

Publié: 04 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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