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Oct 18, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 294 (2023) Citer cet article

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La conjugaison est un mécanisme dépendant du contact pour le transfert d'ADN plasmidique entre les cellules bactériennes, qui contribue à la dissémination de la résistance aux antibiotiques. Ici, nous utilisons la microscopie de cellules vivantes pour visualiser la dynamique intracellulaire du transfert conjugatif du plasmide F dans E. coli, en temps réel. Nous montrons que le transfert de plasmide sous forme simple brin (ssDNA) et sa conversion ultérieure en ADN double brin (dsDNA) sont des processus rapides et efficaces qui se produisent avec un timing et une localisation subcellulaire spécifiques. Notamment, la conversion ssDNA-dsDNA détermine le moment de la production de protéines codées par le plasmide. La région principale qui pénètre en premier dans la cellule réceptrice porte des promoteurs simple brin qui permettent la synthèse précoce et transitoire des protéines principales immédiatement après l'entrée du plasmide ADNss. La conversion ultérieure en ADNdb désactive l'expression du gène principal et active l'expression d'autres gènes plasmidiques sous le contrôle de promoteurs double brin conventionnels. Cette stratégie moléculaire permet la production en temps opportun de facteurs séquentiellement impliqués dans l'établissement, le maintien et la diffusion du plasmide.

La conjugaison de l'ADN bactérien est un mécanisme de transfert de gène horizontal répandu dans lequel l'information génétique est transmise d'un donneur à une cellule receveuse par contact direct1,2,3,4. La conjugaison est responsable de la dissémination intra- et inter-espèces de diverses propriétés métaboliques et représente 80 % des résistances acquises chez les bactéries5. Le plasmide F a été le premier élément conjugatif découvert1,6 et est maintenant documenté comme le représentant paradigmatique d'un grand groupe de plasmides conjugatifs répandus chez Escherichia coli et d'autres espèces d'entérobactéries, dans lesquels ils sont associés à la dissémination de colicines, de facteurs de virulence et d'antibiotiques. résistance7,8,9. En raison de leur importance fondamentale et clinique, les plasmides de type F ont fait l'objet d'études approfondies qui ont permis de comprendre en détail les réactions moléculaires et les facteurs impliqués dans leur transfert par conjugaison3,4.

Au sein de la cellule donneuse, les composants du relaxosome, y compris le facteur hôte d'intégration IHF, les protéines accessoires codées par plasmide TraY, TraM et la relaxase multifonctionnelle TraI, sont recrutés à l'origine du transfert (oriT) du plasmide F10,11,12. Le complexe relaxosome est ensuite recruté dans le système de sécrétion de type IV (T4SS) par la protéine de couplage TraD, entraînant la formation du complexe de pré-initiation13,14,15,16,17. Les protéines TraI et TraD sont des composants archétypiques de l'ensemble de base de sous-unités nécessaires à l'établissement de la machinerie de conjugaison active et sont respectivement appelées VirD2 et VirD4 dans la nomenclature commune. Il est proposé que l'établissement de la paire d'accouplement induit un signal encore non caractérisé qui active le complexe de pré-initiation. Ensuite, TraI introduit une coupe d'ADN spécifique au site et au brin (nick) dans l'oriT du plasmide et reste lié de manière covalente à l'extrémité 5 'phosphate. TraI sert également d'hélicase qui extrude le plasmide d'ADNss à transférer, appelé brin T18,19,20,21,22,23,24,25,26. Il a été initialement suggéré et confirmé plus tard que deux relaxases sont nécessaires pour effectuer ces fonctions27,28. À ce stade, le 3'OH du brin T sert à initier la réplication en cercle roulant (RCR) qui convertit le plasmide d'ADNss circulaire intact en ADNdb dans la cellule donneuse3,29,30, tandis que le 5'phosphate lié à TraI est transféré dans la cellule réceptrice via la machinerie T4SS. Alors que la structure moléculaire du T4SS a été bien caractérisée31,32,33,34, la façon dont le complexe T (nucléoprotéine T-strand-TraI) est transloqué à travers la membrane des membranes des cellules donneuses et receveuses reste incertaine.

Le premier segment transféré est la région de tête d'environ 13,5 knt, portant des gènes qui codent pour l'homologue de la protéine SsbF à la protéine essentielle de liaison simple brin codée par voie chromosomique Ssb, la protéine PsiB (Plasmid SOS Inhibition)35,36,37,38 qui inhibe Induction de SOS lors de la conjugaison39,40 et d'autres protéines de fonction inconnue. Remarquablement, la région de tête est conservée dans divers plasmides entérobactériens appartenant à une variété de groupes d'incompatibilité41,42,43,44,45,46. La région de maintenance adjacente et ensuite transférée d'environ 17 knt porte le système de partition plasmidique de type ParABS (SopABC) et les origines de la réplication végétative47,48,49,50. Le dernier segment transféré du plasmide F est la grande région tra d'environ 33,3 knt qui code tous les facteurs protéiques nécessaires au traitement et au transfert de l'ADN plasmidique, y compris le relaxosome, le T4SS et le système d'exclusion contre l'auto-transfert4. En outre, les plasmides de type F portent souvent des gènes cargo impliqués dans diverses fonctions métaboliques couramment intégrées entre les régions de maintenance et tra7,9. Une fois que les extrémités 5 'et 3' du brin T ont été internalisées dans la cellule réceptrice, maintenant appelée transconjugant, le plasmide d'ADNsb est circularisé par TraI26,27,51,52. Le plasmide ssDNA sera également converti en dsDNA par la réaction de synthèse de brin complémentaire. Que cette réaction de synthèse d'ADN se produise lorsque le plasmide pénètre dans la cellule réceptrice ou est initiée après la recircularisation du plasmide reste incertaine. Néanmoins, l'achèvement de la conversion ss-to-dsDNA est nécessaire pour la réplication et la partition du plasmide et est donc essentiel à la stabilité du plasmide dans la nouvelle lignée de cellules hôtes.

Le modèle mécaniste décrit ci-dessus est bien documenté; cependant, la dynamique en temps réel et l'organisation intracellulaire de la conjugaison restent largement non décrites dans la bactérie vivante. En particulier, nous savons très peu de choses sur la localisation subcellulaire et le moment des réactions dans la cellule receveuse, y compris l'entrée du plasmide ssDNA, la conversion ss-to-dsDNA et l'expression du gène plasmidique. En ce qui concerne ce dernier, les premiers travaux ont rapporté que certains gènes principaux (ssbF et psiB dans le plasmide F, et ssbColIb-P9, psiB et ardA dans le plasmide ColIb-P9) sont exprimés rapidement après l'entrée du plasmide dans la cellule acceptrice36,37, 38,42,53,54. Les travaux in vitro de Masai et al.55 ont montré que la forme simple brin de la séquence Frpo non codante, située dans la région de tête du plasmide F, se replie en une structure tige-boucle qui reconstitue les boîtes canoniques -10 et -35. Cette séquence promotrice peut recruter l'ARN polymérase d'E. coli qui initie la synthèse d'ARN dans des essais in vitro55. Des séquences homologues à Frpo ont également été trouvées dans la région de tête de ColIb-P956,57. Ces observations ont conduit à la proposition selon laquelle les séquences de type Frpo pourraient agir en tant que promoteurs d'ADNss initiant la transcription précoce des gènes principaux lorsque le plasmide est encore sous forme d'ADNss. Que ce mécanisme de régulation se produise lors de la conjugaison in vivo reste à démontrer.

Dans cette étude, nous utilisons l'imagerie par microscopie de cellules vivantes pour visualiser la séquence de transfert complète du plasmide F natif entre les souches d'E. coli K12. Nous inspectons les étapes clés de la conjugaison à l'aide de reporters génétiques spécialement développés, y compris une fusion fluorescente de la protéine de liaison à un seul brin codée de manière chromosomique Ssb (Ssb-Ypet) pour surveiller le transfert d'ADNss, le système mCherry-ParB/parS pour révéler le ss -to-dsDNA conversion et la duplication subséquente du plasmide, et les fusions fluorescentes traductionnelles pour quantifier et chronométrer la production codée par le plasmide dans la nouvelle cellule hôte58,59. Cette approche révèle la chorégraphie des réactions de conjugaison chez les bactéries vivantes et fournit de nouvelles informations sur l'interaction entre la transformation des plasmides et l'expression des gènes.

Nous avons surveillé la localisation dynamique d'une fusion endogène fluorescente de la protéine de liaison simple brin codée chromosomiquement Ssb (Ssb-Ypet) dans les cellules donneuses et receveuses, pendant la croissance végétative et la conjugaison (Fig. 1a, b et Fig. S1). Au cours de la croissance végétative, Ssb-Ypet forme des foyers discrets aux positions médiane et quart de cellule dans la région interne des cellules donneuses et receveuses (Fig. 1c et Fig. S2a, b). Ces foyers Ssb, appelés ci-après foyers réplicatifs Ssb, sont associés à l'ADNsb qui suit les fourches de réplication sur l'ADN nucléoïde60,61. Au cours de la conjugaison, la localisation intracellulaire de Ssb change radicalement. Comme indiqué précédemment 58, 59, l'entrée du plasmide ADNss dans la cellule réceptrice, désormais appelée transconjugant, déclenche le recrutement de molécules Ssb et la formation de foyers proximaux membraneux brillants, que nous avons appelés foyers conjugatifs Ssb (Fig. 1b et Fig. S1). Ici, nous observons également la formation de foyers de conjugaison Ssb dans les cellules donneuses, révélant ainsi la présence de plasmide ssDNA de chaque côté du pore de conjugaison lors du transfert (Fig. 1b et Fig. S1). L'analyse de la localisation des foyers révèle que la sortie et l'entrée du plasmide se produisent à des positions spécifiques de la membrane dans les cellules de la paire d'accouplement. Les foyers de conjugaison Ssb sont répartis à la périphérie de la cellule donneuse et préférentiellement aux quarts de position (Fig. 1c et Fig. S2a, b), reflétant la position préférée pour la sortie du plasmide ssDNA à travers des pores de conjugaison actifs. En revanche, l'entrée du plasmide ssDNA se produit principalement dans les régions polaires des cellules transconjugantes (Fig. 1c et Fig. S2a, b). Nos données nous permettent également de déterminer si la conjugaison se produit à un stade spécifique du cycle cellulaire. L'analyse de la longueur des cellules en tant qu'indicateur de l'âge des cellules révèle que les cellules du donneur et du receveur engagées dans le transfert de plasmide présentent une distribution de longueur similaire à celle de la croissance végétative (Fig. 1d). Cela montre que les donneurs peuvent donner et que les receveurs peuvent acquérir le plasmide à n'importe quel stade de leur cycle cellulaire, de la naissance à la division cellulaire.

a Images de microscopie représentatives de donneurs et de receveurs portant le gène de fusion ssb-ypet pendant la croissance végétative. Les receveurs produisent également la protéine fluorescente diffuse mCh-ParB. Barres d'échelle 1 μm. b Images de microscopie accélérée du transfert de plasmide entre un donneur (D) et un receveur (R) qui est converti en une cellule transconjugante (T). Barres d'échelle 1 μm. Des événements supplémentaires sont présentés dans la figure S1. c Cartes thermiques de localisation 2D de Ssb-Ypet chez les donneurs, les receveurs et le transconjugant pendant la croissance végétative (veg.) et la conjugaison (conj.). Normalisation par la longueur cellulaire de (n) cellules individuelles d'au moins trois répétitions biologiques. La barre d'échelle de densité est sur la gauche. d Histogramme de distribution de la longueur des cellules des donneurs, des receveurs et des transconjugants (n cellules analysées à partir d'au moins trois expériences indépendantes). e Moment d'apparition du foyer conjugatif Ssb chez le donneur par rapport aux cellules transconjugantes. Les histogrammes avec moyennes et ET représentent la proportion d'événements de transfert dans lesquels le foyer Ssb apparaît chez les donneurs avant (-1 min), simultanément (0 min) ou après (+1 min ; +2 min) son apparition dans les transconjugants. Le nombre (n) d'événements de transfert individuels analysés à partir de trois expériences indépendantes est indiqué. f Tracé de gigue de l'intensité de fluorescence des foyers conjugatifs Ssb-Ypet lors de leur apparition simultanée. Le nombre de foyers analysés à partir de trois expériences indépendantes (n) est indiqué avec la moyenne et le SEM correspondants. La signification de la valeur P du test statistique bilatéral de Mann-Whitney est indiquée par **** (P ≤ 0,0001). g Tracés de gigue de la durée de vie des foyers conjugatifs Ssb-Ypet dans les cellules donneuses et transconjugantes. La signification de la valeur P du test statistique bilatéral de Mann-Whitney est indiquée par **** (P = 0,0001). Le nombre (n) de cellules analysées à partir d'au moins cinq expériences indépendantes est indiqué. h Graphiques de violon de l'asymétrie de fluorescence d'un mCherry libre et du Ssb-Ypet dans les donneurs, les receveurs et les cellules transconjugantes. La médiane, le quartile 1 et le quartile 3 sont indiqués par les bornes des cases, la moyenne par un point noir, et les minima et maxima par les limites des moustaches. Les points noirs au-dessus et en dessous des valeurs max et min correspondent aux valeurs aberrantes. Les données mCherry gratuites correspondent à une expérience représentative. D'autres parcelles correspondent au même ensemble de données que dans le panneau (c) d'au moins trois répétitions biologiques. Le nombre de cellules analysées (n) est indiqué. i Tracé de gigue de l'intensité des foyers réplicatifs et conjugatifs Ssb-Ypet dans les cellules transconjugantes pendant la conjugaison. Le temps 0 min correspond à l'apparition du foyer conjugatif Ssb-Ypet chez les receveurs. Le nombre de cellules analysées (n) à partir de trois expériences indépendantes est indiqué avec la moyenne et le SEM correspondants. Donneur (LY1007), receveur (LY358), transconjugant (LY358 après acquisition Fwt de LY1007); le mCherry libre est produit à partir du chromosome dans le fond MS388 wt (LY1737). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Dans 77,8 ± 7% (n = 131) des événements de transfert de plasmide individuels visualisés par imagerie accélérée (1 min / image), des foyers de conjugaison Ssb apparaissent dans les cellules donneuses et transconjugantes sur la même image (Fig. 1e). Dans ces cas, les foyers de conjugaison Ssb sont, en moyenne, plus brillants dans le transconjugant que dans les cellules donneuses, reflétant la quantité relative de plasmide ADNsb de chaque côté du pore de conjugaison (Fig. 1f). Dans les 22,2 % d'événements de transfert restants, les foyers de conjugaison Ssb apparaissent d'abord dans le transconjugant, puis chez le donneur une ou deux minutes plus tard (Fig. 1e). L'accumulation retardée d'ADNss chez le donneur par rapport au receveur est corroborée par la quantification d'une durée de vie moyenne de 2,9 ± 1,1 min (n = 294) des foyers conjugatifs Ssb-Ypet dans les transconjugants, contre 2,5 ± 1,1 min (n = 197 ) dans les cellules du donneur (Fig. 1g). Ces données indiquent que l'apparition de foyers de conjugaison est asynchrone dans les cellules de la paire d'accouplement et suggèrent une séquence spécifique de transfert d'ADNss. Le premier segment du brin T généré par l'activité hélicase de TraI dans la cellule donneuse ne reste pas assez longtemps pour recruter des molécules Ssb et est immédiatement transféré au receveur. Ce n'est qu'après cette brève étape de transfert que l'ADNss s'accumule également du côté du donneur, où il peut correspondre à l'un ou l'autre ou aux deux brins plasmidiques non transférés ou au brin T. Cela implique que le taux de formation d'ADNss par l'activité de l'hélicase TraI est plus rapide que celui de l'élimination de l'ADNss par le RCR et du transfert via le T4SS (voir discussion).

L'internalisation d'une grande quantité de plasmide ssDNA provoque le recrutement massif du pool intracellulaire de molécules Ssb à la périphérie des cellules donneuses et transconjugantes. Ce changement dans la distribution subcellulaire de Ssb-Ypet est révélé par une analyse d'asymétrie, qui fournit une mesure non biaisée de l'asymétrie de la distribution de fluorescence dans les cellules sans nécessiter de détection de foyers basée sur un seuil (Fig. 1h). Les cellules de type sauvage produisant un mCherry libre (mCh) présentent une faible asymétrie correspondant à la distribution homogène de la fluorescence des pixels à l'intérieur du cytoplasme de la cellule. Au cours de la croissance végétative, la fluorescence Ssb-Ypet est en partie diffuse dans le cytoplasme et en partie concentrée localement dans les foyers réplicatifs, ce qui entraîne une asymétrie d'environ 1,2. En comparaison, Ssb-Ypet présente une forte asymétrie d'environ 4,1 chez les donneurs et les transconjugants pendant le transfert de plasmide, reflétant la proportion accrue de molécules Ssb regroupées dans les foyers. Par conséquent, nous nous sommes demandé quelle partie des molécules de Ssb sont contenues dans les foyers de conjugaison et si leur formation était associée à une déplétion de Ssb dans les foyers de réplication dans la cellule transconjugante. Pour répondre à cette question, nous avons effectué une détection automatique des foyers Ssb-Ypet et une quantification de la luminosité pendant le transfert de plasmide (Fig. 1i). Nous observons qu'une minute après le début de l'entrée du plasmide, les foyers réplicatifs Ssb-Ypet sont toujours présents mais présentent la moitié de leur intensité initiale, tandis que les foyers conjugatifs sont 35 fois plus brillants. Étant donné que la fluorescence intracellulaire totale de Ssb-Ypet est inchangée pendant le transfert (Fig. S2c), ces variations peuvent être attribuables au déplacement des molécules de Ssb-Ypet sur le plasmide d'ADNsb entrant plutôt qu'à la synthèse de novo de Ssb-Ypet. Cette dynamique reflète que le plasmide d'ADNsb entrant recrute la plupart des molécules Ssb-Ypet dans la cellule acceptrice pendant le transfert.

Il a été estimé que Ssb est présent à environ ~1320 ± 420 monomères par cellule d'E. coli et qu'un dimère de tétramères couvre environ 170 nt in vivo61. Par conséquent, il n'y a pas assez de copies Ssb par cellule pour accueillir les 108 000 nucléotides du plasmide ssDNA F, plus les quelques centaines de nucléotides de ssDNA associés aux fourches de réplication (~ 650 nt à 22 ° C62). En fait, on ne sait pas si le plasmide F est toujours entièrement présent sous forme d'ADNss chez le receveur, car on ne sait pas si la réaction de synthèse de brin complémentaire se produit de manière concomitante ou après l'achèvement du transfert du brin T. Pourtant, le recrutement massif observé de molécules Ssb sur l'ADNsb entrant pourrait réduire la disponibilité de Ssb et provoquer une perturbation transitoire de la réplication de l'ADN du chromosome hôte. Une façon d'aborder cette question in vivo est de surveiller une fusion fluorescente du composant du réplisome β2-clamp (mCh-DnaN), qui est diffusé dans le cytoplasme des cellules non répliquantes et forme des foyers discrets associés au réplisome au cours de la progression de la réplication de l'ADN60, 61,63. L'imagerie par microscopie et l'analyse de l'asymétrie n'ont montré aucun changement dans le schéma de localisation de l'ADN avant, pendant ou après la formation des foyers de conjugaison Ssb (Fig. S2d). Cela indique que le recrutement de Ssb sur le plasmide d'ADNsb entrant n'entraîne pas l'effondrement de la fourche de réplication. Que le taux de réplication de l'ADN soit affecté au cours de ce processus transitoire et court reste une possibilité.

La conversion du plasmide d'ADNsb nouvellement acquis en ADNds par la réaction de synthèse de brin complémentaire et les événements de duplication de plasmide ultérieurs ont été analysés à l'aide du système de marquage d'ADN parS/ParB58,59. Le site de liaison parS est inséré dans le plasmide F, tandis que la protéine de liaison ParB marquée par fluorescence avec le mCherry (mCh-ParB) est produite à partir d'un plasmide dans les cellules receveuses uniquement. Au microscope, la conversion ss-to-dsDNA est rapportée par la disparition du foyer conjugatif Ssb-Ypet et la formation d'un foyer mCh-ParB dans les cellules transconjugantes (Fig. 2a). Nous avons d'abord effectué une imagerie accélérée (1 min / image) pour visualiser le taux de réussite et le moment de la conversion ss-dsDNA après l'entrée de ssDNA (Fig. 2b). L'analyse montre que l'apparition du foyer conjugatif Ssb-Ypet est suivie de la formation du foyer mCh-ParB dans 83,3 ± 2,3 % (n = 311) cellules transconjugantes individuelles analysées, indiquant que la grande majorité des plasmides d'ADNsb internalisés sont convertis avec succès dans des plasmides d'ADNdb (Fig. 2c). Notamment, nous observons que 40 ± 3, 2% (n = 286) des cellules transconjugantes où le plasmide d'ADNss nouvellement acquis a déjà été converti en ADNds reçoivent par la suite de l'ADNss supplémentaire (Fig. 2d et Fig. S3a). Nous quantifions que 92 ± 3, 1% de ces multiples événements d'acquisition d'ADNss proviennent du même donneur, parmi lesquels 79 ± 5, 3% semblent avoir lieu à la même position de la membrane, ce qui suggère qu'ils se produisent à travers le même pore de conjugaison (Fig. S3a). La preuve de transferts multiples au sein d'une paire d'accouplement établie démontre qu'un seul donneur peut donner successivement plusieurs copies du brin T et que les transconjugants dans lesquels la conversion ss-dsDNA a déjà été réalisée ne deviennent pas instantanément réfractaires au plasmide de novo acquisition. En conséquence, l'établissement de l'immunité à la conjugaison par les cellules transconjugantes devrait nécessiter la production des protéines d'exclusion codées par plasmide TraS et TraT.

a Images accélérées montrant le transfert de plasmide ssDNA rapporté par la formation des foyers de conjugaison Ssb-Ypet dans les cellules donneuses (D) et receveuses (R), suivies de la conversion ss-dsDNA reflétée par l'apparition d'un mCh- Focus ParB dans les cellules transconjugantes (T). Barre d'échelle 1 μm. b Quantification en accéléré sur cellule unique de l'apparence du foyer Ssb-Ypet (ligne bleue) et de la première duplication du foyer mCh-ParB (ligne rouge) par rapport à la conversion ss-à-dsDNA révélée par la formation du foyer mCh-ParB dans les cellules transconjugantes ( 0 mn). L'apparence du foyer Ssb-Ypet a été analysée à l'aide de laps de temps de 1 min/image, tandis que la première et la deuxième duplication de mCh-ParB ont été analysées à l'aide de laps de temps de 5 min/image. La moyenne et l'écart-type calculés à partir du nombre indiqué d'événements de conjugaison analysés (n) à partir de sept expériences indépendantes sont indiqués. c Histogramme de la conversion ss-dsDNA réussie reflétée par la conversion des foyers conjugatifs Ssb-Ypet en un foyer mCh-ParB. La moyenne et l'écart-type sont calculés à partir de (n) événements de transfert individuels à partir de six répétitions biologiques (points noirs). d Histogramme montrant le pourcentage de transconjugants avec un foyer mCh-ParB qui acquiert plusieurs plasmides ssDNA comme révélé par l'apparition successive du foyer conjugatif Ssb-Ypet. La moyenne et l'écart-type sont calculés à partir de (n) cellules transconjugantes individuelles de six répétitions biologiques (points noirs). e Nuage de points montrant le décalage temporel entre l'apparition des foyers Ssb-Ypet et mCh-ParB dans les transconjugants. La moyenne et l'écart-type calculés à partir de (n) événements individuels (cercles bleus) à partir de sept répétitions biologiques sont indiqués. f Nuage de points montrant le décalage temporel entre l'apparition du foyer mCh-ParB et sa duplication visuelle en deux foyers (première duplication), et en trois ou quatre foyers (deuxième duplication). La moyenne et l'écart-type calculés à partir de (n) événements de duplication individuels (cercles rouges) d'au moins six répétitions biologiques sont indiqués. g Quantification unicellulaire en accéléré du nombre de foyers F par cellule dans la souche donneuse porteuse de F pendant la croissance végétative et dans les transconjugants après l'acquisition du plasmide F. Pour les donneurs, le nombre de foyers F par cellule (nombre de foyers SopB-sfGFP) par rapport à la naissance cellulaire (t = 0 min) est indiqué (courbe grise). Pour les transconjugants, le nombre de foyers F par cellule (nombre de foyers mCh-ParB) par rapport à l'apparition du foyer mCh-ParB (t = 0 min) est indiqué (courbe noire). La moyenne et l'écart-type calculés à partir de (n) cellules individuelles de quatre répétitions biologiques sont indiqués, ainsi que les lignes d'ajustement linéaires des courbes (vertes et rouges). Souche donneuse porteuse de F (LY834), Transconjugant (LY358 après acquisition Fwt). h Cartes thermiques de localisation 2D des foyers mCh-ParB au moment de son apparition (en haut) et juste avant sa duplication (en bas). Les cartes thermiques sont une normalisation par la longueur cellulaire de (n) cellules transconjugantes individuelles à partir de sept réplicats biologiques. a–f, h Donneur Fwt (LY1007), receveur (LY358) et transconjugant (LY358 après acquisition Fwt). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En considérant uniquement les événements ss-to-dsDNA réussis, nous calculons un décalage moyen de 4 ± 1,6 min (n = 475) entre l'apparition du foyer conjugatif Ssb-Ypet et la formation du foyer mCh-ParB (Fig. 2e). Cette période reflète le temps nécessaire à l'achèvement d'une cascade de réaction qui comprend l'internalisation du plasmide ADNss, l'initiation de la réplication de la synthèse du brin complémentaire et le recrutement de molécules ParB sur le site parS sous forme d'ADNds. Bien que notre système ne permette pas d'évaluer la contribution de chaque étape, les résultats montrent que la séquence complète des réactions est réalisée dans un délai relativement court et cohérent.

Ensuite, nous avons d'abord effectué une imagerie accélérée (5 min / image) pour examiner le moment de la duplication du plasmide dans les cellules transconjugantes (c'est-à-dire la réplication et la séparation visuelle des copies du plasmide) (Fig. 2b). Nous estimons une période moyenne de 10,4 ± 4,7 min (n = 158) entre la conversion ssDNA-to-dsDNA et le premier événement de duplication plasmidique (d'un à deux foyers mCh-ParB) et similaire 10,1 ± 5,1 min (n = 124) entre le premier et le deuxième événement de duplication (de deux à trois ou quatre foyers mCh-ParB) (Fig. 2f). Nous avons ensuite décidé de comparer le taux de duplication plasmidique dans les transconjugants au taux de duplication plasmidique dans une souche donneuse porteuse de F à croissance végétative. Pour ce faire, nous avons tracé le nombre de foyers de plasmide par cellule de la conversion ss-à-dsDNA (apparition du foyer mCh) à la division cellulaire dans les transconjugants et de la naissance cellulaire à la division cellulaire dans les cellules donneuses porteuses de F (Fig. 2g). Les résultats montrent que le nombre de F par cellule augmente significativement plus rapidement dans les cellules transconjugantes que dans les cellules porteuses de F en croissance végétative (augmentation de 75 % de la pente de la courbe d'ajustement), mais pour atteindre un nombre final similaire d'environ 4 ± 1 copies par cellule avant division (Fig. 2g). Le nombre de copies F, comme la réplication des chromosomes, est connu pour être contrôlé par la progression du cycle cellulaire, où l'initiation se produit lorsqu'une masse constante par origine est atteinte64. Par conséquent, nos observations sont cohérentes avec l'interprétation selon laquelle lorsqu'une seule copie de plasmide arrive dans une cellule réceptrice qui peut être à n'importe quel stade du cycle cellulaire, l'initiation de la réplication du plasmide n'est pas réprimée jusqu'à ce que le nombre spécifique de copies de plasmide par masse cellulaire soit restauré. Cette réplication accélérée du plasmide permet l'augmentation rapide du nombre de copies F avant la division des cellules transconjugantes, facilitant ainsi la ségrégation des copies du plasmide dans les cellules filles.

L'analyse de localisation révèle que la conversion ss-à-dsDNA et le premier événement de duplication se produisent à des positions subcellulaires distinctes. Le foyer mCh-ParB initial apparaît préférentiellement dans la région polaire de la cellule transconjugante, comparable à l'emplacement d'entrée de l'ADNsb (comparer la Fig. 2h à la Fig. 1c et la Fig. S3b à la Fig. S2a). Une différence notable est que les foyers mCh-ParB apparaissent moins périphériques, ce qui indique qu'ils ne sont pas aussi proches de la membrane cellulaire que les foyers de conjugaison Ssb-Ypet (comparer la Fig. 2h à la Fig. 1c et la Fig. S3c à la Fig. S2b). Nous observons que le foyer mCh-ParB migre ensuite vers la position médiane de la cellule avant la duplication (Fig. 2h et Fig. S3b, c). Ces données montrent que les deux réactions de synthèse d'ADN impliquées dans le traitement plasmidique (c'est-à-dire la conversion ss-to-dsDNA et la réplication plasmidique) sont séparées dans le temps et dans l'espace dans la nouvelle cellule hôte. Le recrutement de la machinerie de synthèse des brins complémentaires et la réaction de réplication ss-to-dsDNA se produisent au voisinage de la position polaire d'entrée du plasmide ssDNA, tandis que la réplication du plasmide se produit dans la région médiane de la cellule. Au total, ces analyses révèlent que les étapes de traitement du plasmide (entrée de l'ADNss, conversion de l'ADNss en ADNds et réplication du plasmide) se produisent à des positions intracellulaires spécifiques au sein de la nouvelle cellule hôte et suivent une chronologie précise.

Nous avons construit des fusions traductionnelles de superdossier gfp (sfgfp) à l'extrémité 3 'de plusieurs gènes situés dans les différentes régions fonctionnelles du plasmide F pour examiner le calendrier de production des protéines codées par le plasmide dans les cellules transconjugantes, que nous utilisons pour obtenir un aperçu du calendrier de l'expression du gène plasmidique (Fig. 3a et Fig. S4a). Les gènes ygfA, ygeA, psiB, yfjB, yfjA et ssbF sont situés dans la région de tête et sont transférés dans l'ordre après l'origine du transfert oriT. Le gène sopB fait partie du système de partition SopABC et est situé dans la région de maintenance. Les gènes traM, traC, traS et traT sont localisés dans la région tra qui code pour des facteurs impliqués dans le transfert de plasmide. TraM est la protéine accessoire du complexe relaxosome qui est recrutée par l'oriT65 ; TraC est l'ATPase de trafic organisée comme un hexamère de dimères ancré aux faces cytoplasmiques du T4SS66 ; TraS et TraT correspondent au système d'exclusion (immunité) du plasmide F qui protège contre l'auto-transfert67,68,69.

a Carte génétique du plasmide F de 108 kb indiquant les régions leader (vert), Tra (rouge) et de maintenance (bleu), et les positions des gènes étudiés (triangles). Les étoiles représentent l'emplacement génétique des insertions PlacIQ1sfgfp. b Diagramme récapitulatif du moment de la production de chaque fusion de protéines codées par un plasmide dans des cellules transconjugantes par rapport au moment de la conversion ss-dsDNA reflétée par l'apparition du foyer mCh-ParB (0 min). Le diagramme représente les données de l'augmentation de pli du signal sfGFP de la Fig. S5. Les couleurs orange/vert, bleu et rouge correspondent à la production de protéines à partir de la région principale, de maintenance et de transfert, respectivement. Les moments de production de sfGFP cytoplasmique à partir du promoteur PlacIQ1 inséré dans les régions intergéniques repE-sopA (repE), tnpA-ybaA (tnpA) et traM-traJ (traM) sont représentés en gris. Le nombre (n) de cellules transconjugantes individuelles d'au moins trois réplicats biologiques analysés est indiqué. c Graphiques de gigue montrant la fluorescence verte intracellulaire (SNR) pour chaque fusion sfGFP et reporters dans les cellules donneuses en croissance végétative (à gauche) et transconjugantes (à droite) à la valeur SNR maximale de la Fig. S5. Chaque point représente les données des cellules individuelles. Les moyennes et l'écart-type sont calculés à partir du nombre indiqué (n =) de cellules transconjugantes d'au moins trois réplicats biologiques indépendants. Donneurs de dérivés F (voir Tableau S1), Bénéficiaire (LY358). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons d'abord effectué des expériences de cours du temps où des images instantanées de microscopie de la population de conjugaison ont été acquises 1, 2, 4 et 6 h après le mélange des donneurs et des cellules réceptrices. Pour chaque point dans le temps, la fréquence des transconjugants (T/R + T) a été directement mesurée au niveau de la cellule unique à partir de la proportion de cellules receveuses présentant une fluorescence mCh-ParB diffuse (R) ou de cellules transconjugantes hébergeant des foyers mCh-ParB (T ), et le rapport signal sur bruit de fluorescence verte intracellulaire (SNR) a été automatiquement mesuré (Fig. S4b – d). Cette analyse instantanée montre que tous les dérivés de plasmide F portant des fusions sfGFP ont conservé leur capacité de transfert et ont produit des fréquences de transconjugants entre 57 et 95 % après 6 h d'accouplement. De plus, l'acquisition d'un plasmide porteur de fusion est systématiquement suivie d'une augmentation du signal sfGFP dans les cellules transconjugantes, avec un calendrier et des niveaux très variables (Fig. S4b – d).

Une meilleure résolution du niveau de production et du moment des fusions sfGFP par rapport à la conversion ss-to-dsDNA (apparition du foyer mCh-ParB) dans des cellules transconjugantes individuelles a été obtenue en utilisant l'imagerie accélérée de la conjugaison réalisée dans la chambre microfluidique (Films S1, S2). Nous avons effectué la détection des cellules transconjugantes et la quantification des cellules sfGFP SNR intracellulaires au fil du temps (Fig. S5a – d). Lorsque la cellule transconjugante s'est divisée, nous avons poursuivi la quantification de la fluorescence dans les cellules filles résultantes pour surveiller la production de sfGFP sur une plus longue période. À partir de ces données brutes, nous avons calculé le facteur d'augmentation du SNR par intervalle de 10 minutes, où un facteur d'augmentation supérieur à un révèle que les fusions sont produites dans les transconjugants (Fig. S5a – d). Ces données ont finalement été traduites en un diagramme complet présentant les fenêtres temporelles de production pour chaque fusion dans des cellules transconjugantes par rapport à l'événement de conversion ss-dsDNA (Fig. 3b). Cette analyse révèle que les fusions appartenant aux différentes régions plasmidiques présentent des délais de production spécifiques en ce qui concerne les étapes de traitement du plasmide.

Remarquablement, nous détectons la production synchrone des principales protéines de fusion YgeA, PsiB, YfjB, YfjA et SsbF avant même l'apparition du foyer mCh-ParB (Fig. 3b et Fig. S5a). De plus, la production de ces fusions n'est que transitoire car elle culmine à environ 5 min et s'arrête 25 à 35 min après l'événement de conversion ss-to-dsDNA. Cette observation inattendue indique que les fusions principales commencent à être produites lorsque le plasmide est encore sous forme d'ADNsb et s'arrêtent rapidement après que le plasmide est converti en forme d'ADNds. Une exception intéressante est YgfA-sfGFP, pour laquelle la production n'est détectée que dans l'intervalle de 10 à 20 min après l'apparition du foyer mCh-ParB. Le gène ygfA est le plus proche de l'oriT et est donc le premier gène à être transféré au receveur (Fig. 3a et Fig. S4a). Cependant, l'orientation du gène ygfA est opposée aux autres gènes principaux testés, ce qui signifie que le brin T ne correspond pas au brin matrice pour la transcription de ygfA. Par conséquent, et conformément à nos observations, l'expression de ygfA ne peut se produire qu'après la synthèse du brin de matrice complémentaire par la conversion ss-to-dsDNA.

La conversion ss-to-dsDNA est suivie par la production de protéines de maintenance et de Tra, en commençant par SopB et TraM, puis TraC, et finalement les fusions TraS et TraT (Fig. 3b et Fig. S5b, c). La production de ces fusions devrait nécessiter la présence du plasmide sous forme d'ADNdb puisque les gènes correspondants sont connus pour être contrôlés par des promoteurs d'ADNdb (PsopAB pour sopB, PM pour traM et PY pour traC et traST). Cependant, qu'est-ce qui pourrait expliquer les différences observées dans les délais de production ? Nous nous sommes demandé si les écarts de synchronisation pouvaient simplement expliquer la position des fusions sur la carte génétique du plasmide F. Cette possibilité a été exclue par l'observation que l'insertion du rapporteur fluorescent constitutif PlacIQ1sfGFP (gène sfgfp sous le contrôle du promoteur constitutif PlacIQ1) dans les régions intergéniques repE-sopA, tnpA-ybaA et traM-traJ a entraîné des délais de production de sfGFP similaires, dans l'intervalle de 0 à 10 min après l'apparition du foyer mCh-ParB (Fig. 3b et Fig. S5d). Au lieu de cela, nous proposons que les calendriers de production différentiels des gènes de maintenance et de tra reflètent l'activité et la régulation des promoteurs des gènes correspondants. L'opéron sopAB est sous le contrôle du promoteur PsopAB, qui est réprimé par la liaison SopA. Par conséquent, le promoteur PsopAB devrait être totalement non réprimé et actif dans les cellules transconjugantes dépourvues de SopA, permettant ainsi la production rapide du complexe de partition SopAB nécessaire à la stabilité du plasmide et à l'hérédité des divisions cellulaires. Le gène traM est contrôlé par le promoteur PM, qui est faiblement mais constitutivement actif, avant même son activation complète en liant la protéine TraY70. En revanche, le promoteur PY qui contrôle l'expression des gènes traC, traS et traT doit être activé par la protéine TraJ, codée par le gène traJ sous le contrôle de son propre promoteur PJ et situé en amont de PY4. La nécessité de cette cascade d'activation explique probablement la production retardée de TraC, TraS et TraT. Le délai supplémentaire entre la production des fusions TraC et TraS/TraT pourrait potentiellement refléter la distance relative de ces gènes au promoteur PY (5,9 kb pour traC et 20,4 kb pour traST). Il est important de souligner que le plasmide F porte une insertion naturelle de la séquence d'insertion IS3 dans le gène finO du système d'inhibition de la fertilité FinOP, ce qui entraîne la régulation à la hausse et l'expression constitutive des gènes tra71. Par conséquent, d'autres plasmides IncF dans lesquels le système de régulation FinOP est toujours actif devraient présenter des moments et des niveaux de production des protéines Tra différents de ceux rapportés ici.

Notamment, les niveaux intracellulaires de protéines Tra dans les cellules transconjugantes atteignent un plateau entre 60 et 90 min après la conversion ss-to-dsDNA et restent stables tout au long de nos observations (Fig. 3b et Fig. S5c). Cela implique qu'à ce stade, les cellules transconjugantes ont produit la machinerie de transfert et le système d'exclusion et ont très probablement été converties en donneurs de plasmide compétents. À l'appui de cette interprétation, TraM, TraC, TraS, TraT et SopB sont détectés à des niveaux similaires dans les cellules donneuses porteuses de F en croissance végétative (Fig. 3c et Fig. S4c, d, S5b, c). Ce n'est pas le cas pour les protéines YgeA, PsiB, YfjB, YfjA et SsbF, dont les niveaux intracellulaires commencent à diminuer 25 à 35 min après la conversion ss-dsDNA dans les transconjugants, et qui ne sont pas détectés dans les cellules donneuses en croissance végétative ( Figure 3c et figures S4b, S5a). Ces résultats sont cohérents avec l'interprétation selon laquelle les principales protéines sont produites rapidement et uniquement de manière transitoire lors de l'entrée du plasmide d'ADNss dans les cellules receveuses et non lorsque le plasmide est maintenu sous forme d'ADNds pendant la réplication végétative.

Avec des travaux antérieurs37,38,54,56, l'expression précoce et transitoire des principaux gènes dans les cellules transconjugantes soutient l'existence de séquences spécifiques qui agiraient comme des promoteurs simple brin pour initier la transcription des principaux gènes du plasmide ssDNA internalisé. À l'aide d'une analyse bioinformatique, nous avons identifié une région en amont des gènes ssbF, yfjA, yfjB, psiA et psiB, que nous avons nommée Frpo2, qui partage 92 % d'identité avec la région Frpo précédemment signalée (renommée Frpo1) située en amont de ygeA et ygeB et précédemment caractérisée in vitro55 (Fig. 4a). La prédiction du repliement de l'ADN à l'aide de mFold (http://www.unafold.org) indique que la forme simple brin de Frpo2 peut se replier en une structure tige-boucle très stable qui porte également des boîtes canoniques -10 et -35, similaires à la Frpo1 région (Fig. S6a)55. Nous avons abordé l'effet des délétions Frpo1 ou Frpo2 sur l'expression des gènes en aval dans les cellules transconjugantes à l'aide de la microscopie de cellules vivantes. L'analyse par microscopie des cellules transconjugantes recevant le F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, le F ΔFrpo2 ssbF-sfgfp ou le F ΔFrpo2 yjfA-sfgfp n'a révélé aucune augmentation significative de la fluorescence sfGFP avant ou après la conversion ss-to-dsDNA dans les cellules transconjugantes (Fig. 4b).

a Carte génétique de la région de tête montrant la position des gènes (vert pour les fusions sfGFP étudiées et blanc pour les autres gènes) et des promoteurs Frpo1 et Frpo2 (rouge) (en haut). Le diagramme du bas montre la structure tige-boucle formée par les formes d'ADNsb des séquences Frpo1 et Frpo2 (détaillées sur la Fig. S6). b Histogrammes de l'augmentation intracellulaire du sfGFP dans les transconjugants après l'acquisition de F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, F ΔFrpo2 ssb-sfgfp et F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp. La moyenne et l'écart-type sont calculés à partir des cellules transconjugantes individuelles indiquées (n) analysées à partir d'au moins trois expériences indépendantes. Les niveaux obtenus avec le plasmide Fwt de la Fig. S5a sont indiqués en vert comme référence. Donateur de F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp (LY1368), F ΔFrpo2 ssb-sfgfp (LY1365), F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp (LY1364) et le receveur (LY318). c Histogrammes de Fwt, mutants de délétion F ΔFrpo1, F ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeAB, FΔFrpo2 et FΔssbF fréquence du transconjugant (T/R + T) estimée par des tests de placage. La moyenne et l'écart-type sont calculés à partir de trois expériences indépendantes (représentées par des points noirs individuels). La signification de la valeur P ns et **** P ≤ 0,0001 ont été obtenues à partir d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. Donateur de Fwt (LY875), F ΔFrpo1 (LY824), F ΔygeA (LY160), F ΔFrpo1 ΔygeA (LY1424), F ΔFrpo1 ΔygeAB (LY1425), F ΔFrpo2 (LY823), F ΔssbF (LY755), receveur (MS428). d Quantification unicellulaire en time-lapse de l'apparition du foyer Ssb-Ypet (ligne bleue) et de la première duplication du foyer mCh-ParB (ligne rouge) par rapport à la formation du foyer mCh-ParB dans les cellules transconjugantes (0 min) qui reçoivent le plasmide FΔssbF. Le nombre d'événements de conjugaison analysés (n) à partir de cinq réplicats biologiques indépendants est indiqué. Les résultats obtenus sur la figure 2b avec le plasmide Fwt sont rapportés en gris à des fins de comparaison. e Nuage de points montrant le décalage temporel entre l'apparition du foyer Ssb-Ypet et l'apparition du foyer mCh-ParB dans les cellules transconjugantes après l'acquisition du plasmide F ΔssbF. La moyenne et l'écart-type calculés à partir de (n) événement de conversion ss-dsDNA individuel (cercles bleus) à partir de cinq répétitions biologiques sont indiqués. La signification de la valeur P ns (> 0, 05 non significative) a été obtenue à partir du test statistique bilatéral de Mann – Whitney par rapport aux résultats obtenus avec le plasmide Fwt (Fig. 2e). f Nuage de points montrant le décalage temporel entre l'apparition du foyer mCh-ParB et sa duplication visuelle en deux foyers (première duplication), et en trois ou quatre foyers (seconde duplication) dans les cellules transconjugantes après acquisition du plasmide F ΔssbF. La moyenne et l'écart-type calculés à partir de (n) événements de duplication individuels (cercles rouges) à partir de huit répétitions biologiques sont indiqués. Signification de la valeur P ** P = 0, 0023 et *** P = 0, 0007 ont été obtenus à partir du test statistique bilatéral Mann – Whitney par rapport aux résultats obtenus avec le plasmide Fwt (Fig. 2f). Donneur F ΔssbF (LY1068), receveur (LY358). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite abordé l'impact des suppressions de Frpo1 et Frpo2 sur l'efficacité de la conjugaison après trois heures d'accouplement, telle qu'estimée par des tests de placage (Fig. 4c). F ΔFrpo1 présente une fréquence significativement réduite de transconjugants de 25,2 ± 2,9 % par rapport à 92,6 ± 6,6 % pour le Fwt. Des résultats comparables ont été obtenus pour F ΔFrpo1 ΔygeAB (32,7 ± 7,1) et F ΔFrpo1 ΔygeA (14,5 ± 0,4). Étonnamment, la suppression unique de ygeA diminue encore plus l'efficacité de la conjugaison (3,9 ± 1,9 %), et malgré nos multiples tentatives, la suppression de ygeB seule n'a jamais pu être construite. En revanche, les délétions de Frpo2 ou ssbF n'ont pas d'impact significatif sur l'efficacité de conjugaison. Ces résultats montrent que Frpo1 et Frpo2 sont nécessaires à l'expression précoce des gènes en aval lors de l'entrée du plasmide dans les cellules receveuses lors de la conjugaison in vivo. Cependant, les gènes sous le contrôle de Frpo1 semblent avoir un rôle plus critique dans la conjugaison que ceux sous le contrôle de Frpo2.

L'expression rapide et transitoire des gènes principaux lors de l'entrée du plasmide suggère fortement que les protéines principales jouent un rôle essentiel au cours des premières étapes de l'établissement du plasmide dans la nouvelle cellule hôte. La région de tête conservée dans divers plasmides entérobactériens code pour un homologue de la protéine de liaison simple brin Ssb codée sur le chromosome d'E. coli41,43,54,72,73,74. Le gène ssb codé chromosomiquement est conservé et essentiel dans tous les organismes bactériens, ce qui soulève la question de la raison d'être des homologues ssb issus de plasmides. Les premières études montrent que le SsbF codé par le plasmide F peut compléter partiellement les mutations conditionnelles du gène ssb chromosomique73,75. De manière cohérente, nous avons effectué une visualisation simultanée de SsbF-mCh produit à partir d'un plasmide pTrc99a-ssbF-mch et du Ssb-Ypet codé chromosomiquement (Fig. S7a) et avons observé un positionnement intracellulaire similaire (Fig. S7b) confirmé par une analyse de colocalisation (Fig. S7c) . Cela indique que le plasmide SsbF et l'hôte Ssb sont recrutés dans l'ADNsb qui suit les fourches de réplication dans les cellules en croissance végétative. De même, SsbF-sfGFP forme également des foyers dans les cellules transconjugantes qui ont acquis le plasmide F ssbF-sfgfp, principalement lors des premier et deuxième événements de duplication du plasmide (Fig. S7d, e). Néanmoins, le rôle de SsbF lors de la conjugaison n'est toujours pas clair et sa suppression du plasmide F n'a pas d'impact significatif sur l'efficacité de la conjugaison (Fig. 4c).

Pour mieux comprendre le rôle de SsbF lors de la conjugaison, nous avons revisité la dynamique de l'entrée de l'ADNss, de la conversion ss-to-dsDNA et de la duplication du plasmide F ΔssbF. L'analyse d'image par microscopie accélérée révèle que la suppression de SsbF n'a aucun impact sur la dynamique des foyers de conjugaison Ssb-Ypet (Fig. 4d) ou sur le moment de la conversion ss-to-dsDNA (comparer Fig. 4e à Fig. 2e). Cependant, la suppression de SsbF retarde considérablement le moment de la duplication du plasmide dans les cellules transconjugantes (comparer la Fig. 4f à la Fig. 2f). Le délai entre l'apparition de mCh-ParB et la première duplication est augmenté d'environ 58 % (de 10,4 ± 4,7 pour Fwt à 16,4 ± 9,5 pour F ΔssbF), et le temps entre le premier et le deuxième événement de réplication plasmidique est augmenté d'environ 29 % (de 10,1 ± 4,7 pour Fwt à 13 ± 8 pour F ΔssbF). Cela indique que SsbF joue un rôle dans la facilitation des premiers cycles de duplication du plasmide dans la nouvelle cellule transconjugante, éventuellement en augmentant le pool cellulaire de protéine de liaison simple brin disponible pour la réplication de l'ADN. Cette fonction apparaît dispensable puisque l'absence de SsbF retarde la duplication plasmidique mais n'affecte pas l'efficacité finale de la conjugaison, du moins lorsque la conjugaison est réalisée dans des conditions optimales entre les souches E. coli MG1655.

Nos connaissances actuelles sur la conjugaison émergent principalement d'études génétiques, biochimiques et structurales expérimentales qui ont fourni une compréhension bien documentée des réactions moléculaires et des facteurs impliqués dans le transfert d'ADN, tandis que des études génomiques et informatiques ont révélé la diversité des plasmides conjugatifs et leur importance dans l'épidémiologie. de la dissémination de la résistance aux antibiotiques. Ce n'est que récemment que l'application de la microscopie optique a commencé à fournir des informations sur l'organisation de la conjugaison à l'échelle cellulaire58,59,76,77,78,79,80,81,82. Dans cette étude, la microscopie de cellules vivantes combinée à des reporters fluorescents spécialement développés offre une vue unique de la dynamique cellulaire de la conjugaison tout en fournissant des informations sur le moment et la localisation de chaque étape clé.

Nous rapportons la présence de plasmide ssDNA à la fois du côté du donneur et du côté du receveur lors du transfert de plasmide. Remarquablement, le plasmide ssDNA n'est pas positionné au hasard mais plutôt attribué à des emplacements subcellulaires spécifiques dans les cellules de la paire d'accouplement. Le point de sortie du plasmide ssDNA F est préférentiellement situé du côté de la cellule donneuse et préférentiellement aux quarts de positions. Ce schéma pourrait refléter la position intracellulaire de la machinerie T4SS du plasmide F, qui à notre connaissance reste à décrire. Cette possibilité serait affaiblie si la machinerie du plasmide F T4SS était localisée de manière homogène sur toute la périphérie des cellules comme dans le cas des plasmides pTi et R38879,81. Alternativement, la localisation latérale des pores de conjugaison actifs peut refléter l'accès facilité aux molécules de plasmide F, qui sont également positionnées aux quarts de position et exclues des pôles cellulaires83,84. En revanche, le ssDNA entre principalement dans la région polaire des cellules réceptrices. Cela pourrait suggérer que le pôle de la surface des receveurs est l'emplacement préféré du pilus F du donneur. l'attachement ou la stabilisation de la paire d'accouplement. Cette dernière possibilité est renforcée par le fait que la stabilisation de la paire d'accouplement pendant la conjugaison F implique une interaction entre la protéine plasmidique TraN exposée à la surface des cellules donneuses et la protéine de membrane externe hôte OmpA des cellules réceptrices82,85. OmpA s'est avéré enrichi et moins mobile dans les régions polaires des cellules d'E. coli86, favorisant peut-être la stabilisation de la paire d'accouplement et du pore de conjugaison à cet endroit.

La découverte inattendue que le ssDNA apparaît d'abord dans la cellule receveuse, puis s'accumule chez le donneur pendant la conjugaison fournit également des informations sur l'activité de TraI et sa coordination avec le transfert du brin T à travers le T4SS ou le RCR du non- brin transféré. Avant l'initiation du transfert d'ADN, le relaxosome lié à l'oriT du plasmide est ancré au T4SS par la protéine de couplage TraD, formant ainsi le complexe de pré-initiation (Fig. 5a (i)). Le contact avec la cellule réceptrice est proposé pour induire un signal qui active le complexe de pré-initiation. Nous découvrons l'existence d'une brève période où une partie du brin T a déjà été transférée dans la cellule receveuse alors qu'aucun ssDNA n'est présent chez le donneur (Fig. 5a(ii). À ce stade, l'absence de ssDNA chez le donneur implique que tout l'ADNss généré par TraI a été éliminé, à la fois par transfert du brin T à travers le T4SS et par complémentation du brin d'ADNss non transféré par le RCR.Après cette étape transitoire, l'ADNss s'accumule également chez le donneur, suggérant que l'ADNsb est généré par l'activité de l'hélicase TraI chez le donneur plus rapidement qu'il n'est éliminé par transfert et synthèse RCR (Fig. 5a (iii)).

a(i) Avant l'initiation de la conjugaison, le complexe de pré-initiation lié à l'origine de transfert du plasmide est amarré au système de sécrétion de type IV (T4SS). (ii) L'établissement de la paire d'accouplement transduit un signal qui active le complexe de pré-initiation. Le déroulement du plasmide dsDNA par l'activité hélicase de TraI produit le premier segment du brin T, qui est immédiatement transféré dans la cellule réceptrice où il recrute des molécules Ssb, tandis que le brin non transféré est complété par une réplication en cercle roulant ( RCR) dans la cellule donneuse. (iii) L'activité hélicase de TraI génère de l'ADNss à un taux plus élevé que le brin T est transféré à travers le T4SS ou que le brin non transféré est complété par RCR, entraînant ainsi l'accumulation de plasmide d'ADNss recouvert de molécules Ssb chez le donneur cellule. b Lors de l'entrée du plasmide ssDNA dans la cellule réceptrice, les séquences principales Frpo1 et Frpo2 forment des structures tige-boucle qui servent de promoteurs initiant la transcription des gènes principaux en aval, entraînant rapidement la production de protéines principales. La conversion ss-to-dsDNA ultérieure inactive Frpo1 et Frpo2 et autorise l'expression d'autres gènes plasmidiques sous le contrôle de promoteurs dsDNA conventionnels. La production de protéines de maintenance, de transfert et d'autres protéines codées par plasmide aboutit finalement au développement de nouvelles fonctions par la cellule transconjugante.

En supposant que la durée de vie de 2, 9 ± 1, 1 min des foyers Ssb-Ypet dans les transconjugants reflète le temps nécessaire pour terminer l'internalisation du plasmide F ADNsb de 108 000 nt, nous avons calculé un taux de transfert s-1 de 620 ± 164 nt. Ceci est en accord raisonnable avec le taux historique de 770 nt s-1 estimé à partir des 100 minutes nécessaires pour transférer l'ensemble du chromosome de 4,6 Mb d'E. coli87. En outre, le taux de synthèse d'ADN par l'holoenzyme ADN polymérase III pendant la RCR a été estimé à 650–750 nuc s−1 88. En comparaison, le taux d'activité de l'hélicase TraI a été mesuré à 1120 ± 160 pb s−189. Ces estimations soutiennent l'idée que l'accumulation d'ADNss chez le donneur explique le taux plus rapide d'activité de l'hélicase TraI que le taux de transfert de plasmide à brin T ou RCR. Par conséquent, il est possible que, contrairement à la proposition précédemment suggérée mais jamais démontrée, l'activité hélicase de la relaxase ne soit pas strictement couplée à l'activité de translocation de l'ADN à travers le T4SS.

La microscopie des cellules vivantes révèle les étapes de conjugaison de la chronologie globale, comme résumé à la Fig. 5b. Le traitement du plasmide dans la cellule transconjugante est un processus relativement rapide, car l'entrée du plasmide ADNss et sa conversion en ADNds est terminée en environ 4 min en moyenne. Plus important encore, l'événement de conversion ss-to-dsDNA est l'événement pivot qui détermine le programme d'expression du gène plasmidique. Les gènes leaders sont les premiers à pénétrer dans la cellule réceptrice et également les premiers à être exprimés à partir du plasmide F sous forme d'ADNsb. Conformément aux propositions précédentes55,56,57, nous montrons que l'expression précoce des gènes principaux dépend de séquences qui agissent comme des promoteurs simple brin lorsque le plasmide est encore sous forme d'ADNsb. Comme décrit précédemment pour Frpo1, nous proposons que les séquences Frpo2 hautement homologues identifiées ici se replient en une structure tige-boucle stable qui reconstruit les boîtes consensus -35 et -10, entraînant l'initiation de la transcription.

L'expression du gène principal est également transitoire car la conversion ss-à-dsDNA désactive la production de protéines principales en inactivant les promoteurs Frpo1 et Frpo2 tout en autorisant l'expression des gènes de maintenance, de transfert et d'autres gènes plasmidiques sous le contrôle des promoteurs d'ADNdb conventionnels, souvent soumis à leur propre spécificités réglementaires. Les niveaux de protéines d'entretien et de transfert dans les transconjugants atteignent un état d'équilibre équivalent à celui des cellules contenant du F en croissance végétative en environ 30 à 90 min, selon la protéine. Fait intéressant, nos travaux antérieurs ont montré que les facteurs de résistance à la tétracycline codés par le transposon Tn10 inséré dans la région intergénique ybdB-ybfA du plasmide F sont également produits immédiatement après la conversion ss-to-dsDNA et atteignent le niveau de la cellule résistante en ~ 90 min58. Ces résultats indiquent systématiquement que cette échelle de temps correspond à la période nécessaire aux cellules transconjugantes pour acquérir des fonctions codées par le plasmide, y compris la maintenance du plasmide, la capacité de conjugaison, l'immunité contre l'auto-transfert et la résistance supplémentaire potentiellement portée par le plasmide.

La régulation de l'expression des gènes plasmidiques par traitement plasmidique est un moyen élégant d'assurer la production séquentielle et opportune de protéines plasmidiques dans la cellule transconjugante, et en particulier de limiter la production de facteurs principaux à une fenêtre de temps étroite après l'entrée du plasmide ADNss. Cependant, la synthèse de protéines de novo pourrait ne pas être le seul moyen de fournir à la cellule transconjugante des protéines codées par un plasmide. Des travaux récents d'Al Mamun et al. rapporte que le transfert du plasmide de type F pED208 (IncFV) est concomitant avec la translocation de plusieurs protéines codées par un plasmide, notamment TraI, ParA, ParB1, Ssb homologue SsbED208, ParB2, PsiB et PsiA90. La translocation des protéines a été détectée à basse fréquence (10-5 recombinants par cellule donneuse entre une et cinq heures d'accouplement) à l'aide d'un test de recombinase Cre très sensible. La translocation des protéines pourrait également se produire lors du transfert du plasmide F natif mais ne pourrait pas expliquer à elle seule nos observations. En effet, notre analyse par microscopie montre que les fusions YgeA, PsiB, YfjB, YfjA et SsbF sont inférieures au seuil de détection par microscopie dans les cellules donneuses mais sont quantifiées à des niveaux intracellulaires significatifs dans toutes les cellules transconjugantes. Cela implique que les quantités de protéines principales observées dans les cellules transconjugantes ne peuvent pas simplement provenir de cellules donneuses, mais résultent de la synthèse protéique de novo, qui, selon nous, dépend des séquences Frpo1 et Frpo2. Par conséquent, il semble probable que la translocation directe des protéines et la synthèse de novo soient des mécanismes concomitants assurant la présence de facteurs principaux et des fonctions associées immédiatement après l'entrée du plasmide ADNsb dans la cellule transconjugante. Cela suggère en outre le rôle critique de la région de tête dans la conjugaison. Plusieurs éléments appuient cette opinion. La région de tête est conservée dans une variété de plasmides de conjugaison41,42,43,44,45,46. De plus, les régions principales des plasmides appartenant à un large éventail de groupes d'incompatibilité (IncF, IncN, IncP9 et IncW) classés comme plasmides MOBF utilisant la relaxase comme marqueur phylogénétique ont été signalées comme étant la cible préférentielle des systèmes CRISPR-Cas dirigés contre conjugaison8,91,92. Récemment, la région de tête s'est avérée être une cible évolutive importante pour la dissémination du plasmide pESBL (IncI)93. Concernant le plasmide F, nous pouvons souligner que Frpo1 et Frpo2 partagent 92% de similitude au niveau des nucléotides et ne sont distants que d'environ 5 kb. Cela implique que lorsqu'elles sont sous forme d'ADNdb pendant la réplication végétative du plasmide, les séquences Frpo1 et Frpo2 seraient un substrat potentiel pour la recombinaison homologue, entraînant la suppression du segment intermédiaire. Cependant, le segment intermédiaire porte les gènes flmAB, homologues fonctionnels du système toxine-antitoxine hok/sok du plasmide R194, qui sont susceptibles de sauvegarder la stabilité de la région de tête.

Malgré cet ensemble de preuves, il est actuellement difficile de rationaliser l'importance de la région principale puisque les fonctions moléculaires de la plupart des protéines principales sont encore inconnues. Nos données indiquent que les gènes en aval de Frpo1 (ygeA et ygeB) ont une fonction critique dans la conjugaison. En revanche, les gènes situés en aval de Frpo2 (ssbF, yfjA, yfjB, psiB, psiA et flmC) semblent être indispensables car les suppressions de Frpo2, ssbF ou psiB44 n'ont pas d'impact significatif sur l'efficacité globale de conjugaison adressée par les tests de placage. Pourtant, il a été démontré que SsbF et PsiB suppriment l'induction de SOS induite par la conjugaison dans la cellule transconjugante, ce qui est probablement important pour la physiologie et la prolifération du transconjugant plutôt que pour le transfert de plasmide en soi. Une limitation potentielle de l'étude de conjugaison est que les tests d'efficacité de transfert sont généralement effectués entre des souches bactériennes identiques ou étroitement apparentées dans des conditions optimales de milieu et de température. Cela sape probablement le rôle de gènes qui ne sont pas strictement essentiels mais qui pourraient faciliter ou optimiser la conjugaison, ou aider à la prolifération de la cellule transconjugante. Ainsi, il est possible que l'importance des facteurs dominants soit mieux révélée dans des conditions moins favorables, entre bactéries phylogénétiquement éloignées, ou à l'échelle évolutive. Pendant ce temps, la microscopie en temps réel pourrait aider à découvrir l'influence potentiellement subtile de ces gènes sur la séquence de conjugaison dans les cellules vivantes.

Les souches bactériennes sont répertoriées dans le tableau S1, les plasmides dans le tableau S2 et les oligonucléotides dans le tableau S3. La fusion de gènes avec des étiquettes fluorescentes et la suppression de gènes sur le plasmide F ont utilisé la recombinaison λRed95,96. Les plasmides F modifiés ont été transférés à la souche de fond K12 MG1655 par conjugaison. Lorsque plusieurs modifications génétiques sur le plasmide F étaient nécessaires, les gènes kan et cat ont été éliminés en utilisant une recombinaison spécifique au site induite par l'expression de la recombinase Flp à partir du plasmide pCP2095. Le clonage plasmidique a été réalisé par Gibson Assembly et vérifié par séquençage Sanger (Eurofins Genomics biotech). Les souches et les plasmides ont été vérifiés par séquençage Sanger (Eurofins Genomics). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans un milieu M9 additionné de glucose (0, 2%) et d'acide casaminé (0, 4%) (M9-CASA) avant l'imagerie, et dans un bouillon Luria-Bertani (LB) pour les tests d'efficacité de conjugaison. Le cas échéant, des suppléments ont été utilisés dans les concentrations suivantes ; Ampicilline (Ap) 100 µg/ml, Chloramphénicol (Cm) 20 µg/ml, Kanamycine (Kn) 50 µg/ml, Streptomycine (St) 20 µg/ml et Tétracycline (Tc) 10 µg/ml.

Des cultures d'une nuit dans LB de cellules receveuses et donneuses ont été diluées à un A600 de 0,05 et cultivées jusqu'à ce qu'un A600 compris entre 0,7 et 0,9 soit atteint. 25 µl de donneur et 75 µl de cultures receveuses ont été mélangés dans un tube Eppendorf et incubés pendant 90 min à 37 °C. Environ 1 ml de LB a été ajouté doucement et les tubes ont été à nouveau incubés pendant 90 min à 37°C. Le mélange de conjugaison a été vortexé, dilué en série et étalé sur gélose LB X-gal 40 µg/ml IPTG 20 µM additionné de l'antibiotique approprié pour sélectionner les populations receveuses ou donneuses. Les colonies receveuses (R) ont ensuite été étalées sur une gélose LB contenant de la tétracycline à 10 µg / ml pour sélectionner les transconjugants (T) et la fréquence des transconjugants calculée à partir du (T / R + T) présenté à la Fig. 4c.

Les cultures d'une nuit dans M9-CASA ont été diluées à un A600 de 0,05 et cultivées jusqu'à ce que A600 = 0,8 soit atteint. Des échantillons de conjugaison ont été obtenus en mélangeant 25 µl du donneur et 75 µl du receveur dans un tube Eppendorf. Pour les expériences en accéléré, 50 µl de la culture pure ou du mélange de conjugaison ont été chargés dans une chambre microfluidique B04A (ONIX, CellASIC®)97. L'apport de nutriments a été maintenu à 1 psi et la température a été maintenue à 37 ° C tout au long du processus d'imagerie. Les cellules ont été imagées toutes les 1 ou 5 min pendant 90 à 120 min. Pour l'imagerie instantanée, des échantillons de 10 µl de culture clonale ou de mélange de conjugaison ont été déposés sur un tampon d'agarose à 1 % M9-CASA sur une lame98 et imagés directement.

L'imagerie conventionnelle par microscopie à fluorescence à grand champ a été réalisée sur un microscope Eclipse Ti2-E (Nikon), équipé d'un objectif de phase Plan Apo Lambda à huile x100/1,45, d'une caméra CMOS numérique ORCA-Fusion (Hamamatsu) et d'un logiciel NIS pour l'acquisition d'images. . Les acquisitions ont été réalisées en utilisant 50% de puissance d'une source lumineuse Fluo LED Spectra X à des longueurs d'onde d'excitation de 488 et 560 nm. Les paramètres d'exposition étaient de 100 ms pour Ypet, sfGFP et mCherry et de 50 ms pour le contraste de phase.

L'analyse quantitative des images a été effectuée à l'aide du logiciel Fiji avec le plugin MicrobeJ99. Pour l'analyse instantanée, la détection du contour des cellules a été effectuée automatiquement à l'aide de MicrobeJ et vérifiée à l'aide de l'interface d'édition manuelle. Pour les expériences en accéléré, la détection des cellules a été effectuée de manière semi-automatique à l'aide de l'interface d'édition manuelle, qui permet de sélectionner les cellules à surveiller et de détecter automatiquement les contours des cellules. Au sein des populations de conjugaison, les catégories de donneur (pas de signal mCh-ParB), de receveur (signal diffus mCh-ParB) ou de transconjugant (foyers mCh-ParB) ont été attribuées à l'aide de l'option "Type" de MicrobeJ. Les cellules receveuses ont été détectées sur la base de la présence de fluorescence rouge au-dessus du niveau de fond d'autofluorescence de la cellule détecté chez les donneurs. Parmi ces cellules réceptrices, des transconjugants ont été identifiés en exécutant la détection automatisée MicrobeJ des foyers de fluorescence ParB (détection Maxima). Cette approche a été utilisée indépendamment de la présence ou de l'absence des fusions Ssb-Ypet ou sfGFP dans les cellules du donneur et du receveur. Dans les différents types de cellules, les paramètres d'intensité moyenne de fluorescence (au), d'asymétrie, de rapport signal/bruit (SNR) ou de longueur de cellule (µm) ont été automatiquement extraits et tracés à l'aide de MicrobeJ. Le SNR correspond au rapport (signal intracellulaire moyen/signal de bruit moyen), où le signal intracellulaire moyen est le signal de fluorescence par surface cellulaire et le bruit est le signal mesuré à l'extérieur des cellules (dû à la fluorescence émise par le milieu environnant). Contrairement à la quantité totale de fluorescence par cellule, qui dépend de la taille/âge des cellules et tient compte du fond, l'estimation quantitative du SNR est plus appropriée pour une quantification impartiale de la fluorescence intracellulaire au fil du temps. Les foyers Ssb-Ypet, SsbF-mCh et mCh-ParB ont été détectés à l'aide de la fonction de détection MicrobeJ Maxima, et la localisation des foyers et l'intensité de fluorescence ont été extraites et tracées automatiquement. Les parcelles présentant des données en accéléré ont été soit alignées sur la première image où la cellule transconjugante présente un foyer conjugatif Ssb-Ypet (acquisition d'ADNss) ou un foyer mCh-ParB (conversion ss-to-dsDNA) comme indiqué dans la légende de la figure correspondante. Surtout, parce que la conjugaison est asynchrone dans la population, les films time-lapse ne capturent pas toujours toute la séquence de transfert d'ADN, c'est-à-dire l'apparition/disparition du foyer Ssb-Ypet, la formation du foyer mCh-ParB, les premier et deuxième événements de duplication mCh-ParB. Il convient de noter que l'utilisation de laps de temps de 1 min / image était appropriée pour analyser l'apparition / la disparition de Ssb-Ypet par rapport à la formation de mCh-ParB (Fig. 2b – e), mais a provoqué un blanchiment de mCh-ParB, entravant ainsi l'analyse de mCh-ParB. événements de duplication sur le long terme. Nous avons ensuite utilisé des laps de temps de 5 min / image pour analyser les premier et deuxième événements de duplication de mCh-ParB par rapport à la formation de foyers mCh-ParB (Fig. 2b, f). Aussi, la caractérisation des différents paramètres de transfert a été réalisée à l'aide d'analyses spécifiques. Par exemple, les décalages temporels ont été calculés en comptant le nombre d'images entre les deux événements considérés (apparition et disparition de Ssb-Ypet sur les figures 2e, 4e; formation de foyer mCh-ParB et première ou seconde duplication sur les figures 2f, 4f). En revanche, les Fig. 2b, 4b ont été générés en annotant la présence/l'absence de foyers Ssb-Ypet ou mCh-ParB dans chaque trame temporelle.

La signification de la valeur P a été analysée en exécutant des tests statistiques spécifiques sur le logiciel GraphPad Prism. Les données unicellulaires de l'analyse quantitative par microscopie ont été extraites de l'interface MicrobeJ et transférées vers GraphPad. La signification de la valeur P des données quantitatives à cellule unique a été réalisée à l'aide d'un test statistique bilatéral Mann – Whitney non paramétrique non apparié, qui permet de comparer les différences entre des groupes de données indépendants sans hypothèse de distribution normale. La signification de la valeur P pour la fréquence des transconjugants obtenus par des tests de placage a été évaluée à l'aide d'une analyse de variance à une voie (ANOVA) avec le test de comparaisons multiples de Dunnett, qui permet de déterminer la signification statistique des différences observées entre les moyennes de trois groupes expérimentaux indépendants ou plus contre une moyenne du groupe témoin (correspondant au Fwt). Si nécessaire, la valeur P et la signification sont indiquées sur les panneaux de la figure et dans la légende correspondante.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données permettant de comprendre et d'évaluer les conclusions de cette recherche sont disponibles dans le texte principal et les informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec cet article dans le fichier Source Data. Les données brutes de microscopie sont disponibles sur Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21206444). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Les auteurs remercient le National BioResource Project et le Coli Genetic Stock Center pour avoir fourni des souches, A. Ducret pour son aide précieuse avec MicrobeJ et N. Fraikin pour une discussion utile. Cette recherche a été financée par la Fondation pour la recherche médicale, numéro de subvention FRM-EQU202103012587 à CL et AC ; l'Agence nationale de la recherche, numéro d'octroi ANR-18-CE35-0008 aux CL, YY et KG ; et l'Université de Lyon grâce au financement de CVCL reconnaît également la Fondation Schlumberger pour l'éducation et la recherche (FSER 2019).

Microbiologie moléculaire et biochimie structurale (MMSB), Université Lyon 1, CNRS, Inserm, UMR5086, 69007, Lyon, France

Agathe Couturier, Chloé Virolle, Kelly Goldlust, Annick Berne-Dedieu, Audrey Reuter, Sophie Nolivos, Sarah Bigot & Christian Lesterlin

Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), 91198, Gif-sur-Yvette, France

Yoshiharu Yamaichi

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CL et SB ont conçu, conçu et supervisé l'exécution de l'étude ; AC, CV, KG, AB-D., AR, SN et SB ont réalisé les expériences et analysé les données. CL et SB ont rédigé le document et CL a préparé les figures. CL et YY ont fourni le financement.

Correspondance à Sarah Bigot ou Christian Lesterlin.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Couturier, A., Virolle, C., Goldlust, K. et al. Visualisation en temps réel de la dynamique intracellulaire du transfert de plasmide conjugatif. Nat Commun 14, 294 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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Reçu : 05 octobre 2022

Accepté : 11 janvier 2023

Publié: 18 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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Communication Nature (2023)

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