Le citraconate inhibe la catalyse ACOD1 (IRG1), réduit les réponses d'interféron et le stress oxydatif, et module l'inflammation et le métabolisme cellulaire

Oct 22, 2023

Nature Metabolism volume 4, pages 534–546 (2022)Citer cet article

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Bien que les propriétés immunomodulatrices et cytoprotectrices de l'itaconate aient été largement étudiées, on ne sait pas si ses isomères naturels, le mésaconate et le citraconate, ont des propriétés similaires. Ici, nous montrons que l'itaconate est partiellement converti en mésaconate intracellulaire et que l'accumulation de mésaconate dans l'activation des macrophages dépend de la synthèse préalable de l'itaconate. Lorsqu'ils sont ajoutés aux cellules humaines à des concentrations supraphysiologiques, les trois isomères réduisent les niveaux de lactate, tandis que l'itaconate est le plus puissant inhibiteur de la succinate déshydrogénase (SDH). Dans les cellules infectées par le virus de la grippe A (IAV), les trois isomères modifient profondément le métabolisme des acides aminés, modulent la libération de cytokines/chimiokines et réduisent la signalisation de l'interféron, le stress oxydatif et la libération de particules virales. Des trois isomères, le citraconate est le plus puissant agoniste du facteur 2 lié au facteur 2 électrophile et nucléaire-érythroïde 2 (NRF2). Seul le citraconate inhibe la catalyse de l'itaconate par la cis-aconitate décarboxylase (ACOD1), probablement par liaison compétitive au site de liaison au substrat. Ces résultats révèlent le mésaconate et le citraconate comme composés immunomodulateurs, antioxydants et antiviraux, et le citraconate comme le premier inhibiteur naturel de l'ACOD1.

Les petits acides dicarboxyliques insaturés itaconique, mésaconique et citraconique sont des isomères naturels qui ne diffèrent que par l'emplacement d'une double liaison (Fig. 1). L'itaconate est un métabolite clé des macrophages activés et est le produit de l'enzyme mitochondriale ACOD11,2. Il fait l'objet d'intenses recherches en tant que lien entre le métabolisme et l'immunité, possède des propriétés immunomodulatrices (examinées dans les réf. 3,4) et a été détecté dans les biofluides humains, les cellules et les tissus dans une variété de maladies inflammatoires et infectieuses ainsi que dans des modèles de rongeurs. des maladies humaines (résumé dans la réf. 5). Les informations sur l'origine et le catabolisme du mésaconate et du citraconate chez les eucaryotes sont rares. Compte tenu de leur forte similarité structurale, une interconversion entre les trois isomères est envisageable, par exemple via des isomérases endogènes. Sur la base de travaux sur le métabolisme de l'itaconate à l'aide de mitochondries hépatiques isolées6, Nemeth et al. ont suggéré que le mésaconate pourrait être un produit du catabolisme de l'itaconate via l'itaconyl-CoA7. La seule étude suggérant un mécanisme de biosynthèse du citraconate dans les organismes supérieurs est basée sur le profilage des métabolites de patients atteints d'acidémie méthylmalonique, où il a été postulé qu'il s'agissait d'un catabolite de l'isoleucine8, un acide aminé à chaîne ramifiée (BCAA). Il existe de plus en plus de preuves que des niveaux accrus de mésaconate ou de citraconate peuvent être associés à des maladies métaboliques humaines (résumées dans la réf. 5). Cependant, il reste à clarifier si ces concentrations accrues sont pertinentes sur le plan physiopathologique ou si elles représentent simplement des épiphénomènes de troubles du métabolisme. Chez l'homme, il n'existe aucune information sur la distribution tissulaire du mésaconate ou du citraconate. Cependant, dans un criblage d'organes de souris saines, nous avons récemment montré que le mésaconate est présent dans les ganglions lymphatiques et le citraconate dans les ganglions lymphatiques et la rate, ce qui soulève la possibilité d'une certaine fonction dans l'immunité5.

Les intermédiaires TCA sélectionnés et le lactate ont été mesurés par HPLC – MS / MS à 6 et 24 h dans les expériences d'absorption d'isomères d'itaconate présentées dans Extended Data Fig. 1. Les concentrations sont exprimées en fonction du volume cellulaire calculé. a, PCA illustrant de fortes altérations dues aux trois isomères à 6 h, mais une relative normalisation des effets du mésaconate et du citraconate à 24 h. b–d, L'isomère mesuré est indiqué au-dessus de chaque graphique, les isomères ajoutés en dessous de l'axe des x. e, Concentrations de lactate et d'intermédiaires TCA sélectionnés (concentrations données sur les axes y) 6 h après addition des isomères indiqués sous l'axe x. Les trois isomères réduisent les taux de lactate (ce qui correspond à l'inhibition de la glycolyse), mais seul l'itaconate augmente les taux de succinate, suggérant une inhibition de la SDH. Citra, acide citraconique ; Ita, acide itaconique; Mesa, acide mésaconique. n = 3 répétitions biologiques, signifie ± sd Test t non apparié. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001 ; NS, non significatif.

Les propriétés immunomodulatrices et cytoprotectrices de l'itaconate et des dérivés chimiquement modifiés tels que le diméthyl- et le 4-octyl-itaconate (4-OI) sont étudiées intensément pour créer des interventions thérapeutiques pour les maladies inflammatoires et dégénératives3,4 et les infections virales9,10. En revanche, on ne sait pas si le mésaconate ou le citraconate appliqués de manière exogène peuvent être absorbés par les cellules et s'ils exercent des effets immunomodulateurs, anti-oxydants ou anti-infectieux similaires à l'itaconate. Au-delà des rôles bien documentés de l'itaconate dans l'immunométabolisme, la synthèse aberrante de l'itaconate par ACOD1 a été impliquée dans la carcinogenèse. L'itaconate qui est libéré par les macrophages péritonéaux peut servir de facteur de croissance pour les tumeurs qui se sont propagées dans la cavité péritonéale11, et un rôle protumorigène d'ACOD1 a également été rapporté dans les gliomes12,13. Les inhibiteurs d'ACOD1 peuvent donc avoir des propriétés anti-néoplasiques, mais on ne sait pas s'il existe des molécules endogènes qui inhibent l'activité d'ACOD1. Compte tenu de ces questions ouvertes, nous avons utilisé une combinaison d'essais sans cellules, de modèles cellulaires, d'un modèle d'infection IAV et d'un modèle murin d'inflammation induite par les lipopolysaccharides (LPS) pour : (1) tester s'il existe une interconversion entre les trois isomères ; (2) évaluer l'impact du mésaconate et du citraconate sur le métabolisme cellulaire, l'inflammation, le stress oxydatif et l'infectiosité de l'IAV ; et (3) tester si l'un des trois isomères inhibe l'activité ACOD1.

En recherchant les origines du mésaconate et du citraconate, nous avons d'abord testé s'il existe une interconversion spontanée entre les trois isomères et si ACOD1 peut également catalyser la synthèse du mésaconate ou du citraconate. Il n'y avait aucune preuve de synthèse de mésaconate ou de citraconate dans un test enzymatique ACOD1 sans cellule2 (Fig. 1b supplémentaire) et il n'y avait pas d'interconversion spontanée lorsque des composés purs étaient incubés dans du milieu RPMI jusqu'à 24 h (Fig. 1c – e supplémentaire) . Cependant, de faibles concentrations contaminantes biologiquement non pertinentes de chaque isomère ont été détectées dans des stocks purs des autres isomères respectifs (Fig. 1g supplémentaire).

Cordes et al. ont montré que l'itaconate ajouté de manière exogène (25 mM) peut conduire à des concentrations intracellulaires de 14 mM dans les cellules RAW 264.7 murines au repos14. Après avoir déterminé les concentrations non toxiques des isomères (Fig. 1h supplémentaire), nous avons testé leur absorption dans des cellules humaines différenciées de type macrophage (dTHP1). En effet, les trois isomères ont été absorbés efficacement (Extended Data Fig. 1a – f) et il n'y avait aucune preuve de synthèse de novo de citraconate ou d'itaconate. Cependant, lorsque l'itaconate a été ajouté au milieu, le mésaconate est apparu de manière intracellulaire. La concentration de mésaconate par rapport à l'itaconate intracellulaire variait de 1, 7% à 8, 0% et était inversement corrélée à la concentration intracellulaire d'itaconate (données étendues Fig. 1d).

Il convient de noter qu'une petite quantité de mésaconate est également apparue dans les surnageants 24 h après l'ajout d'itaconate, ce qui correspond à la sécrétion de mésaconate généré de manière intracellulaire (Extended Data Fig. 1g). Nous avons donc testé si l'itaconate synthétisé de manière endogène conduirait également à une accumulation de mésaconate. En effet, la stimulation LPS / interféron-γ (IFN-γ) des cellules dTHP1 a conduit à une accumulation de mésaconate qui a culminé après l'itaconate (Extended Data Fig. 2a – d), alors que ni l'itaconate ni le mésaconate n'étaient détectables dans les cellules ACOD1 − / − dTHP1 stimulées avec LPS/IFN-γ. Le citraconate n'a été détecté dans aucun des deux types de cellules. Une conversion apparente de l'itaconate en mésaconate a également été détectée dans la rate de souris au cours d'une évolution de 72 h d'inflammation systémique induite par le LPS (Extended Data Fig. 2e – h). Cependant, la conversion fractionnée de l'itaconate en mésaconate n'était que d'environ 4 %, ce qui est beaucoup moins que dans les cellules dTHP1. Pour tester si la conversion de l'itaconate en mésaconate peut également avoir lieu dans des cellules n'exprimant pas physiologiquement l'ACOD1, nous avons transfecté la lignée cellulaire épithéliale respiratoire A549 avec un vecteur exprimant de manière constitutive l'ACOD1 humain (hACOD1) ou l'ACOD1 murin (mACOD1 ; Extended Data Fig. 2i– l). Contrairement au retard observé dans les cellules dTHP1, il y avait une augmentation parallèle de l'itaconate et du mésaconate, le mésaconate s'élevant à 4 % à 5 % (hACOD1) et à 2,5 % à 2,7 % (mACOD1) par rapport à l'itaconate, mais les concentrations absolues de mésaconate étaient beaucoup plus élevés dans les cellules exprimant mACOD1, qui produisent des niveaux d'itaconate beaucoup plus élevés que l'enzyme humaine2 (Extended Data Fig. 2j, k). Le citraconate n'a pas été détecté. L'itaconate peut inhiber la SDH, augmentant ainsi les taux de succinate15. En effet, le succinate s'est accumulé de manière marquée dans les cellules exprimant mACOD1 (Extended Data Fig. 2i). Une augmentation plus faible du succinate a été observée dans les cellules transfectées par hACOD1, mais uniquement à des concentrations d'itaconate supérieures aux niveaux de succinate de base. Pris ensemble, les résultats présentés dans les Figs. 1 et 2 suggèrent que le citraconate a une origine indépendante de l'itaconate, tandis que le mésaconate provient de l'itaconate via un processus à médiation enzymatique qui se produit physiologiquement au moins dans la rate et les macrophages, mais n'est pas strictement dépendant du type cellulaire.

En plus d'inhiber la SDH, l'itaconate peut déplacer le métabolisme central du glucose de la glycolyse aérobie vers le shunt pentose-phosphate16. Nous avons donc évalué les effets de l'ajout de concentrations croissantes des trois isomères sur le lactate, le succinate et d'autres intermédiaires du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) sélectionnés. Comme le montre le graphique de l'analyse en composantes principales (ACP) de la figure 1a, les effets des isomères différaient nettement 6 h après l'ajout et étaient les plus importants pour l'itaconate. Il convient de noter qu'à 24 h, les modifications dues à l'itaconate ont encore augmenté, tandis que celles dues au mésaconate et au citraconate ont commencé à se normaliser (Fig. 1a). Les trois isomères ont nettement réduit les concentrations de lactate à 6 h (Fig. 1e), mais l'effet s'est atténué à 24 h (Extended Data Fig. 3a). Remarquablement, il y avait une augmentation dose-dépendante unique du succinate aux deux moments après l'ajout d'itaconate, compatible avec l'inhibition de la SDH, alors qu'après l'ajout de mésaconate ou de citraconate, les niveaux de succinate n'ont augmenté que légèrement après 24 h. Cependant, lors de l'utilisation du rapport succinate / fumarate comme mesure de l'inhibition de la SDH, une faible inhibition était également évidente à des doses élevées de mésaconate à 6 h (Extended Data Fig. 3h) et une très faible inhibition (environ 2% d'inhibition par l'itaconate) par mésaconate et citraconate à 24 h. L'accumulation beaucoup plus importante de succinate due à l'ajout d'itaconate a également été vérifiée dans deux expériences utilisant des cellules infectées par l'IAV (Extended Data Fig. 3i, j).

Il a été avancé que l'itaconate inhibe la SDH en alkylant de manière covalente les groupes SH dans le site actif (SDHA)17. Cependant, la formation d'adduits de Michael avec le glutathion (Extended Data Fig. 4a – c) était en fait la plus efficace avec le citraconate (qui n'inhibe pas la SDH), et était 8 et 48 fois plus élevée qu'avec l'itaconate et le mésaconate, respectivement (Figure supplémentaire .2a–d et tableau supplémentaire 1). En effet, les calculs de l'orbitale moléculaire inoccupée la plus basse et de l'indice d'électrophilie (ω) 18 ont identifié le citraconate comme le plus fort et le mésaconate comme l'électrophile le plus faible (données étendues Fig. 4d et tableau supplémentaire 1).

Compte tenu de l'écart entre l'électrophilie des composés (capacité d'alkylation SH) et l'activité inhibitrice de SDH, nous avons utilisé la modélisation structurelle pour tester des modes de liaison alternatifs. En effet, la liaison covalente aux résidus de cystéine les plus proches en tant que principal mode d'inhibition a été jugée invraisemblable pour l'itaconate dans la SDHA humaine et porcine (Fig. 2e, f supplémentaires). Compte tenu de la similitude structurelle de l'itaconate avec le succinate et les inhibiteurs de type substrat tels que l'oxaloacétate, l'itaconate peut cibler le site de liaison du succinate via un mécanisme compétitif. L'amarrage des trois isomères dans le site actif de la SDHA humaine et porcine a révélé que l'itaconate devrait se lier au site de liaison du succinate via des interactions électrostatiques avec des énergies de liaison favorables similaires à l'oxaloacétate (données étendues Fig. 4e, f et Fig. 2h supplémentaire). ). Le mésaconate et le citraconate présentent peu de contacts en raison de la rigidité et de la planéité conférées par la conjugaison étendue. Il convient de noter que le mésaconate est un analogue du fumarate, produit d'oxydation du succinate, et il est plausible qu'il interagisse avec le SDHA (Extended Data Fig. 4g, h et Supplementary Fig. 2i), alors que la configuration cis du citraconate semble être défavorable. pour la reliure (Fig. 2j supplémentaire). Un test d'activité in vitro de la SDH utilisant des mitochondries bovines (dont le site actif est conservé à 100 % dans la SDH humaine) a confirmé une forte inhibition de la SDH par l'itaconate et essentiellement aucune par le citraconate, mais il a révélé un degré modéré d'inhibition par le mésaconate (Extended Data Fig. 4i ). En accord avec des preuves biochimiques récentes19, ces résultats suggèrent que l'itaconate inhibe la SDHA via des interactions directes non covalentes avec le centre actif. Le faible degré d'inhibition de la SDH par le mésaconate dans nos expériences cellulaires peut être dû à une entrée cytoplasmique-mitochondriale plus faible ou parce que sa force d'inhibition est insuffisante pour provoquer des différences prononcées dans des conditions d'équilibre.

Les dérivés de l'itaconate sont étudiés en tant que composés antiviraux et traitements d'appoint pour modifier les réponses de l'hôte dans les infections virales9,10. Nous avons donc infecté des cellules dTHP1 et A549 avec IAV et les avons traitées avec des concentrations non toxiques des trois isomères, comme déterminé par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) ( Figure supplémentaire 1h). Les analyses ont été effectuées au moment de la réponse intracellulaire maximale à l'infection, c'est-à-dire 12 h après l'infection (pi) (dTHP1) et 24 h pi (A549)20. Comme les macrophages humains primaires, les cellules dTHP1 supportent une infection IAV non productive qui présente une réplication de l'ARN viral et une forte réponse intracellulaire, mais pas la libération de virions descendants. Dans ce type de cellule, les traitements n'ont pas entraîné de réduction notable de la synthèse de l'ARN messager (ARNm) de l'hémagglutinine virale (HA) (Extended Data Fig. 5a). En revanche, les cellules A549 supportent une infection productive avec la libération de nouveaux virions. Comme prévu, à 24 h pi, il y avait des niveaux cellulaires élevés d'ARNm HA et des titres IAV élevés dans les surnageants de culture. L'ajout des isomères n'a pas affecté les niveaux d'ARNm de HA, mais, remarquablement, les trois titres viraux fortement réduits dans les surnageants (itaconate, 30 fois ; mésaconate, 36 fois ; citraconate, 53 fois) (données étendues Fig. 5b,c ). Ainsi, les trois isomères possèdent des propriétés anti-IAV qui interfèrent apparemment avec la production ou la libération de nouvelles particules virales, vraisemblablement en interférant avec un processus post-transcriptionnel.

Pour rechercher des corrélats métaboliques de leurs effets antiviraux et pour obtenir une vision plus large des effets partagés et uniques des trois isomères sur le métabolisme cellulaire, nous avons ensuite utilisé ce modèle d'infection IAV dans une analyse ciblée des acides aminés et des métabolites apparentés. L'impact de l'IAV sur le métabolisme des acides aminés était faible dans les cellules dTHP1, mais les trois isomères effectuaient des altérations prononcées du métabolisme des acides aminés dans les cellules infectées qui étaient distinctes des modifications dues à la 4-OI (qui a été appliquée à titre de comparaison) et sont également apparues différer entre les isomères (Extended Data Fig. 5d). Dans les cellules A549, l'impact de l'infection était beaucoup plus fort, mais les isomères ont entraîné d'autres changements dans les populations de métabolites liés aux acides aminés (Extended Data Fig. 5e). Le plus grand impact de l'infection sur le métabolisme des acides aminés dans les cellules A549 était évident en ce que 21 analytes étaient différentiellement abondants (dont 17 étaient réduits), alors qu'un seul analyte (Cys) était significativement modifié dans les cellules THP1 (Extended Data Fig. 5f). De même, l'infection a modifié les valeurs de 12 indicateurs de métabolites dans les cellules A549, mais seulement deux dans les cellules dTHP1 (Extended Data Fig. 5g). Le traitement des cellules dTHP1 infectées par l'IAV avec les isomères a entraîné une modification significative de 24 analytes, dont 19 ont été diminués (Fig. 3a, b supplémentaires). Certains effets étaient uniquement associés à un isomère, mais d'autres étaient partagés par deux ou les trois. Par exemple, les trois isomères ont augmenté l'activité prédite de la prolyl hydroxylase (une activité enzymatique importante pour la déstabilisation du facteur 1α inductible par l'hypoxie [HIF-1α]), mais l'itaconate et le citraconate ont eu les effets les plus importants sur les niveaux de proline et de trans-4-hydroxyproline (Fig. . 4j–l). Mesaconate a effectué le plus grand nombre de changements significatifs; en particulier, il a largement réduit les niveaux d'acides aminés, ce qui était évident dans toutes les sous-classes d'acides aminés (Figs. 3c et 4b, c supplémentaires). Dans les cellules A549, les traitements ont entraîné moins de changements significatifs, probablement en raison de l'impact plus fort de l'infection (Fig. 3e – h supplémentaire). Ceci est illustré par Arg, His, Lys et Trp, quatre acides aminés qui sont importants pour la réplication du virus de la grippe et qui sont généralement réduits lors d'une infection productive par le virus de la grippe21. Tous ceux-ci ont été réduits de manière significative dans les cellules A549 infectées, mais (contrairement aux cellules dTHP1), les traitements n'ont pas entraîné de réduction supplémentaire notable (Fig. 4d – g supplémentaire). Néanmoins, des effets distincts et partagés des isomères étaient évidents dans les cellules A549. Par exemple, les trois isomères ont augmenté les niveaux de kynurénine (Kyn) et prédit l'activité d'IDO1, une enzyme potentiellement immunosuppressive responsable de la conversion de Trp en Kyn et de la génération de NAD+ en tant que produit final de la voie Trp-Kyn-NAD+ (Supplementary Fig. 4h, i), tandis que l'itaconate augmentait préférentiellement les niveaux de Thr, Ala, Ser, Asp et de diméthylarginine asymétrique (Fig. 4m – q supplémentaire). Les polyamines jouent un rôle important dans les interactions virus-hôte à plusieurs étapes, principalement post-transcriptionnelles22. Les trois polyamines mesurées étaient des intermédiaires de la voie spermidine/spermine N1-acétyltransférase, et leur déplétion peut inhiber la réplication du virus à ARN23. En effet, les trois isomères avaient tendance à diminuer les niveaux de polyamines dans les cellules A549 infectées, bien que la signification à P <0, 05 n'ait été atteinte que dans le cas du précurseur ornithine (Fig. 4t – y supplémentaire). Pris ensemble, ces résultats démontrent que les concentrations supraphysiologiques (imitant l'application pharmacologique) des isomères de l'itaconate exercent des effets profonds sur le métabolisme des acides aminés dans les cellules infectées par l'IAV, qui peuvent différer considérablement selon l'isomère, le type de cellule et le type d'infection (productive versus non-infectieuse). productif), et peuvent être fonctionnellement liés à des réseaux antiviraux tels que la voie des polyamines.

Considérant que le citraconate est l'électrophile le plus puissant des trois isomères, nous avons ensuite comparé la capacité des isomères à activer la voie de signalisation KEAP1-NRF224. Le citraconate a exercé l'effet stabilisant le plus fort sur NRF2 dans les kératinocytes HaCaT et a induit le plus fortement l'ARNm codant pour l'aldo-céto réductase membre de la famille 1 B10 (AKR1B10, un facteur en aval induit par NRF2) (Fig. 2a – c). Dans les cellules NRF2–/– HaCaT, l'expression de l'ARNm d'AKR1B10 était plus faible au départ et il n'y avait d'induction significative qu'aux concentrations plus élevées de citraconate, avec un changement de pli inférieur à celui des cellules de type sauvage (Fig. 2d). Lors du dosage de 14 gènes potentiellement régulés par NRF225, le citraconate a effectué l'induction globale la plus forte dans les cellules de type sauvage, alors que l'expression de la plupart des cibles au départ et après stimulation était plus faible dans les cellules NRF2–/– (Extended Data Fig. 6a, b) . La stimulation par l'IFN-γ des cellules HaCaT de type sauvage a entraîné une régulation négative marquée de l'ARNm de SLC7A11, qui a été sauvée par le citraconate dans les cellules de type sauvage, mais pas dans les cellules NRF2–/– (Fig. 2e). De même, dans les cellules dTPH1 infectées par l'IAV, l'application de citraconate a augmenté l'expression des ARNm de SLC7A11, GCLM et ME1, tandis que le mésaconate n'a eu aucun effet (Extended Data Fig. 6c – e). Ces effets inducteurs étaient modestes, ce qui concordait avec la classification des isomères comme électrophiles modérés (tableau supplémentaire 1). L'itaconate peut réduire les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS)14. Nous avons comparé l'activité anti-ROS des trois isomères dans des cellules dTHP1 infectées par l'IAV. L'infection a entraîné une augmentation significative du nombre de cellules ROS-positives mitochondriales, qui a été inversée de manière significative par l'itaconate et le citraconate, alors que la réduction des ROS par le mésaconate n'était que marginalement significative (Fig. 2f).

a–d, le citraconate est le plus puissant agoniste de NRF2. a,b, Stabilisation de la protéine NRF2 dans des cellules de type sauvage. Western blot (3 h après stimulation) de deux expériences indépendantes (a) et mesures densitométriques combinées des bandes à 110-120 kDa correspondant à NRF2 (b) (n = 2). c, d, Expression de l'ARNm AKR1B10 inductible par NRF2 dans des cellules de type sauvage et NRF2–/– 16 h après la stimulation. Les cellules ont été prétraitées avec des isomères d'itaconate pendant 6 h ou non traitées puis stimulées avec de l'IFN-γ (300 U ml-1) pendant 10 h en présence ou en l'absence des isomères (n = 6, moyenne ± sd). e, le citraconate sauve la suppression de l'ARNm de SLC7A11 par l'IFN-γ dans les cellules de type sauvage mais pas dans les cellules NRF2–/– HaCaT (RT–qPCR). f, le citraconate exerce des effets anti-oxydants similaires à l'itaconate. Les cellules dTHP1 ont été infectées par l'IAV et les ROS ont été mesurés à 12 h pi (isomères d'itaconate = 25 mM, 4-OI = 125 µM). g–n, Effets immunomodulateurs partagés et distincts des isomères et du 4-OI. Les cellules dTHP1 ont été infectées par l'IAV en l'absence ou en présence d'itaconate, de mésaconate, de citraconate (concentrations variables) ou de 4-OI (125 µM), et les molécules liées à l'inflammation ont été mesurées à 12 h pi g, h, les niveaux d'ARNm de CXCL10 dans culots cellulaires et protéine CXCL10 dans le surnageant. i, Effets différentiels sur les polypeptides liés à l'inflammation dans les surnageants de culture cellulaire (essai 27-plex ; expérience séparée de g, h ; concentrations d'isomères = 20 mM, 4-OI = 125 µM.) PCA basée sur les concentrations de 25 cibles qui ont passé la qualité évaluation. c–i, n = 3 répétitions biologiques, moyenne ± sd j,k, les isomères d'itaconate réduisent la phosphorylation de STAT1. Les cellules A549 et dTHP1 (un blot représentatif de deux répliques) ont été prétraitées avec des isomères d'itaconate (25 mM) ou 4-OI, infectées avec IAV pendant 2 h et traitées pendant 10 h (dTHP1) et 22 h (A549) (anti-P -Immunoblot STAT1). l–n, le citraconate réduit les réponses IFN induites par l'IAV dans le tissu pulmonaire humain. Les explants pulmonaires ont été infectés par l'IAV (2 × 105 FFU ml-1) en présence ou en l'absence d'itaconate, de citraconate et de 4-OI aux concentrations indiquées (mM). L'expression des ARNm cibles a été mesurée à 24 h pi (cinq explants, trois pièces par explant, total n = 15, médiane, intervalle interquartile). Citra, acide citraconique ; Ita, acide itaconique; Mesa, acide mésaconique. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec test de comparaisons multiples de Dunnett, sauf l – n (test U bilatéral de Mann – Whitney avec correction de Bonferroni).

Données source

L'itaconate possède de fortes propriétés immunomodulatrices3,4, et nous avons ainsi testé si le mésaconate et le citraconate modifiaient également les réponses inflammatoires. Dans les cellules dTHP1 infectées par l'IAV, les trois isomères réduisaient l'ARNm codant pour le ligand 10 de la chimiokine à motif CXC (CXCL10), alors que la réduction de la protéine CXCL10 dans les surnageants cellulaires était plus importante avec l'itaconate et le citraconate (Fig. 2g, h). L'itaconate et le citraconate ont réduit l'ARNm de l'interleukine-6 ​​(IL-6), aucun n'a affecté la transcription de l'IL-1β, et seuls le mésaconate et le citraconate ont réduit l'ARNm du facteur de nécrose tumorale α (TNFα) (données étendues Fig. 6f – h). Dans une expérience indépendante, l'infection par l'IAV a conduit à une reprogrammation substantielle des populations de cytokines / chimiokines dans les surnageants, qui a été fortement modulée par l'ajout de 4-OI, mais moins par les trois isomères (Fig. 2i). Néanmoins, des effets communs et uniques des trois isomères ont été observés (Extended Data Fig. 6i – q). Encore une fois, seuls l'itaconate et le citraconate ont réduit de manière significative les niveaux de protéine CXCL10. Les trois isomères ont réduit les concentrations d'IL-1β et de protéine inflammatoire des macrophages-1β (CCL4), alors que seul le mésaconate a réduit l'IL-2 et le facteur de nécrose tumorale-α. Il convient de noter que les trois isomères ont augmenté les concentrations de la chimiokine CCL5 (RANTES), alors que seuls l'itaconate et le citraconate ont nettement augmenté les concentrations d'IL-8. Cette analyse a révélé que : (1) la 4-OI exerçait les effets « normalisants » les plus forts sur la libération de cytokines/chimiokines par les cellules dTHP1 infectées ; (2) le mésaconate et le citraconate appliqués de manière exogène possèdent des propriétés immunomodulatrices communes et uniques (dont certaines sont partagées avec l'itaconate); et (3) les conséquences fonctionnelles potentielles peuvent être liées en partie à des différences de recrutement de cellules inflammatoires supplémentaires. Pour tester si la réduction observée des niveaux d'ARNm et de protéines CXCL10 était due à une diminution de la signalisation IFN canonique de type I, nous avons évalué les effets des isomères sur le transducteur de signal et l'activateur de la phosphorylation de la transcription 1 (STAT1) dans les cellules dTHP1 et A549. L'infection par l'IAV a considérablement augmenté les niveaux de STAT1 non phosphorylé et phosphorylé, et les trois isomères ont réduit les niveaux de STAT1 phosphorylé mais non phosphorylé (Fig. 2j, k). Le mésaconate avait un effet un peu plus faible sur les cellules dTHP1, alors que le 4-OI était de loin le plus puissant dans les deux types de cellules. Le potentiel anti-IFN du citraconate a également été vérifié dans des tissus pulmonaires humains cultivés ex vivo. L'infection par l'IAV a entraîné l'augmentation attendue de l'ARNm viral de HA, IFIT1 et CXCL10. Bien qu'il n'y ait pas eu de réduction significative des niveaux d'ARN HA viral, le citraconate a considérablement réduit l'expression d'IFIT1 et de CXCL10 (Fig. 2l – n).

Parmi plusieurs composés présentant une similitude avec le cis-aconitate, seul le citraconate s'est avéré être un inhibiteur de l'ACOD1. Remarquablement, cela n'a pas affecté l'activité d'Aspergillus ACOD1, mais le citraconate 10 mM a diminué l'activité d'ACOD1 humain et murin d'environ 90% (Fig. 3a – c et Extended Data Fig. 7a, b). L'inhibition d'ACOD1 par le citraconate a également été vérifiée dans les cellules A549 exprimant ACOD1. En effet, il y avait une diminution dose-dépendante de l'accumulation d'itaconate en présence de citraconate (Fig. 3d). Cela n'était pas dû à une diminution de l'expression d'ACOD1, car les niveaux d'ARNm n'étaient pas affectés (Fig. 3e). La concentration de citraconate dans le milieu qui a entraîné une inhibition semi-maximale de l'activité ACOD1 (IC50) s'est avérée être de 50 µM (Fig. 5d, e supplémentaire). La comparaison de l'empreinte pharmacophore des trois isomères de l'itaconate avec celle du cis-aconitate a montré que le citraconate a le coefficient de Tanimoto le plus élevé, c'est-à-dire la plus grande similitude avec le cis-aconitate (données étendues Fig. 7c). Cela suggère qu'il se lie au site actif d'ACOD1 et agit comme un analogue de substrat. En effet, la modélisation structurelle a prédit qu'il se lie favorablement au site actif de l'ACOD12 humain et de l'homologue murin2 selon un mode similaire au cis-aconitate (Fig. 3f – h et Extended Data Fig. 7d, e), alors que l'itaconate non planaire et le mésaconate trans-isomère affichent des énergies de liaison plus faibles et s'adaptent de manière moins optimale (Extended Data Fig. 7f).

a–c, essai sans cellule. Le hACOD1 recombinant a été incubé avec des concentrations croissantes de substrat (cis-aconitate) et d'inhibiteur (citraconate) et l'accumulation d'itaconate a été mesurée par HPLC. n = 3 tests indépendants, moyenne ± sd La ligne représente une courbe ajustée à l'équation de Michaelis-Menten avec un inhibiteur compétitif. b, graphique Lineweaver – Burk des données présentées en a (moyenne ± sd). c, Résumé des cinétiques enzymatiques et d'inhibition basées sur a (hACOD1) et les données présentées dans les données étendues Fig. 7a, b (mACOD1). d, e, test basé sur les cellules. Des cellules A549 ont été transfectées avec un plasmide surexprimant hACOD1 et incubées avec des concentrations croissantes de citraconate. Les concentrations intracellulaires de citraconate et d'itaconate ont été mesurées par HPLC–MS/MS. L'ajout de citraconate entraîne une réduction de l'accumulation d'itaconate de manière dose-dépendante (d), ce qui n'est pas dû à une diminution de la transcription de hACOD1 (e). n = 3 réplicats biologiques (d), n = 6 réplicats biologiques (e), moyenne ± sd f–g, Mode de liaison putatif du citraconate (jaune) dans le site actif de hACOD1 (PDB ID : 6R6U)2. f, Les groupes C1- et C4-carboxyle du citraconate sont ancrés de manière optimale dans le site actif grâce à un réseau d'attractions électrostatiques ; c'est-à-dire des liaisons hydrogène et des ponts salins (lignes pointillées) avec les résidus His159, Lys207, Lys272 et Leu278. Surface de la protéine électrostatique au site actif : positive (bleue), négative (rouge) et neutre (blanche). g, Interactions ligand bidimensionnelles. h, Modélisation moléculaire de l'itaconate (jaune) par rapport au cis-aconitate (magenta) révélant moins d'interactions entre les deux groupes carboxyle de l'itaconate et les résidus basiques du site actif hACOD1 principalement en raison de sa structure non plane et flexible. IC, intervalles de confiance ; citra, citraconate.

Pour étudier la cinétique cellulaire des effets de l'inhibition d'ACOD1 dans un modèle classique d'activation des macrophages, nous avons réalisé une expérience de 36 h d'activation LPS/IFN-γ des cellules dTHP1 en présence de deux concentrations différentes de citraconate et des concentrations mesurées d'intermédiaires TCA, l'itaconate et le mésaconate. Le PCA a démontré des effets relativement légers d'un prétraitement de 6 h avec du citraconate sur des cellules non stimulées, mais une reprogrammation progressive du TCA pendant la stimulation LPS / IFN-γ (Fig. 4a). Il convient de noter que les traitements au citraconate avaient tendance à inverser les changements induits par le LPS/IFN-γ, ce qui était principalement (mais pas exclusivement) dû à la prévention de l'accumulation d'itaconate et de mésaconate. Plus précisément, dans les cellules stimulées non traitées, l'itaconate s'est accumulé rapidement et a culminé à 12 h, alors que le citraconate 1 mM a essentiellement empêché l'itaconate et réduit considérablement l'accumulation de mésaconate (Fig. 4b, c). L'effet inhibiteur du citraconate a persisté pendant 36 h, ce qui correspondait aux niveaux stables de citraconate intracellulaire tout au long du temps (Fig. 4d). De manière inattendue, l'absence de synthèse d'itaconate ne s'est pas accompagnée d'une augmentation des niveaux de cis-aconitate à des moments précoces, ce qui pourrait être dû à la diminution de la disponibilité de son citrate précurseur (Fig. 4g, i). Les deux concentrations de citraconate ont réduit les niveaux de lactate ; en particulier, la concentration de 0,1 mM a entraîné une diminution modérée des taux de succinate et du rapport succinate/fumarate, suggérant une augmentation modeste de l'activité de la SDH due au soulagement de l'inhibition de la SDH par l'itaconate endogène. La valeur IC50 mesurée du citraconate intracellulaire pour la catalyse ACOD1 (Fig. 5a – c supplémentaires) concordait bien avec les valeurs mesurées dans le test sans cellule (Fig. 3c).

Les cellules dTHP1 ont été stimulées avec du LPS (200 ng ml-1) et de l'IFN-γ (400 U ml-1) pendant les durées indiquées en l'absence ou en présence de citraconate 0, 1, 1, 5, 10 et 25 mM. Des cellules dTHP1 non stimulées traitées pendant 6 h ont été utilisées comme contrôle supplémentaire. Les isomères d'itaconate, le lactate et les mêmes intermédiaires TCA que sur la figure 1 ont été mesurés par LC – MS / MS. Des concentrations de citraconate de 0, 1 et 1 mM dans le milieu ont entraîné une forte inhibition d'ACOD1 à des concentrations de citraconate intracellulaire physiologiquement plausibles et ont donc été utilisées pour les analyses présentées en a – l. Les données obtenues avec les concentrations de 5 à 25 mM ont également été utilisées pour calculer les valeurs IC50. a, PCA basée sur tous les analytes sauf le citraconate. b–e, évolution dans le temps des concentrations d'itaconate (b), de mésaconate (c), de citraconate (d) et du rapport succinate/fumarate (e). f–l, Concentrations de lactate et de certains intermédiaires TCA. m–o, l'inhibition d'ACOD1 par le citraconate n'a pas d'effet important sur l'inflammation dans les cellules dTHP1 activées par le LPS-IFN-γ. Montage expérimental identique à a–l. Les niveaux des ARNm indiqués ont été mesurés par RT – qPCR 12 h après la stimulation. m, ARNm de CXCL10. n, ARNm d'IL-6. o, ARNm d'IL-1β. Citra, acide citraconique ; ita, acide itaconique. b–o, n = 3 répétitions biologiques, moyenne ± sd *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunnett.

Considérant que l'inhibition d'ACOD1 résultait de concentrations de citraconate nettement inférieures aux effets immunomodulateurs (0,03–1 mM contre 10–25 mM), nous avons ensuite testé si la concentration plus faible entraînerait un phénotype lié à l'inflammation, qui serait probablement dû à l'abrogation pharmacologique. de la synthèse endogène d'itaconate. À cette fin, nous avons activé les cellules dTHP1 avec LPS/IFN-γ, ce qui se traduit par une activation maximale et une expression ACOD1 beaucoup plus élevée que l'infection par des virus tels que l'IAV. Bien que la stimulation LPS / IFN-γ ait entraîné une régulation positive vigoureuse de l'ARNm de l'IL-1β, de l'IL-6 et de la CXCL10, le traitement avec du citraconate 1 mM ou de l'itaconate 1 mM (utilisé comme contrôle qui n'inhibe pas ACOD1) n'a pas affecté CXCL10 et IL -1β ARNm dans une mesure notable. En revanche, la concentration de 25 mM de l'un ou l'autre des isomères a réduit les niveaux d'ARNm d'IL-6 (Fig. 4m – o). Ainsi, l'inhibition pharmacologique de la synthèse endogène d'acide itaconique par le citraconate à faible dose n'a pas eu d'impact majeur sur le phénotype inflammatoire des cellules dTHP1 activées au maximum, alors qu'une réduction de l'ARNm de l'IL-6 a été observée à la concentration la plus élevée (immunomodulatrice). Dans une expérience distincte, nous avons ensuite testé si des concentrations faibles/élevées des deux isomères affecteraient la respiration mitochondriale. L'itaconate à 25 mM, mais pas le citraconate, a réduit la respiration maximale et la capacité de réserve des cellules dTHP1 non stimulées ou des cellules dTHP1 stimulées avec LPS / IFN-γ (Extended Data Fig. 8), ce qui était cohérent avec un flux réduit à travers la chaîne de transport d'électrons en raison de Inhibition de la SDH et bien d'accord avec notre observation selon laquelle le citraconate n'inhibe pas la SDH (Extended Data Fig. 4). La stimulation LPS / IFN-γ a réduit la respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de réserve, et le citraconate 1 mM avait tendance à normaliser la respiration maximale et la capacité respiratoire de réserve, tandis que le citraconate 25 mM avait tendance à normaliser uniquement la capacité respiratoire de réserve. Les effets du citraconate à faible dose pourraient être expliqués par un modèle dans lequel l'inhibition de l'ACOD1 entraîne une réduction de l'accumulation endogène d'itaconate, qui à son tour augmente le flux d'électrons en soulageant l'inhibition de la SDH médiée par l'itaconate.

Pris ensemble, nos résultats révèlent que le mésaconate et le citraconate sont des parents proches auparavant sous-estimés de l'itaconate qui exercent des effets uniques et partagés biologiquement pertinents sur le métabolisme, l'inflammation et l'infection virale. Le résumé graphique et le tableau de données étendu 1 résument et comparent les principales caractéristiques des trois isomères. Les différences observées dans les effets sont probablement dues à des différences dans les interactions électrostatiques, les propriétés stériques et l'électrophilie, qui à leur tour pourraient être affectées par la nucléophilie des donneurs Michael potentiellement partenaires. Les disparités marquées entre les trois isomères dans l'inhibition d'ACOD1 (citraconate) ou de SDH (itaconate) illustrent les effets des différences électrostatiques et stériques, et la plus grande capacité du citraconate à induire NRF2 est probablement due à sa plus forte électrophilie. Ce dernier peut également expliquer son plus grand effet sur la production d'IAV à partir de cellules A549, car il a été démontré que l'inhibition via la voie de l'exportine 1 par des composés basés sur un squelette d'itaconate inhibe l'exportation de la ribonucléoprotéine virale dans le cytoplasme par SH-alkylation d'un résidu Cys critique9 . Le citraconate peut, par conséquent, effectuer la plus forte réduction de la réplication de l'IAV dans les cellules A549 en raison de sa plus grande capacité à alkyler ce résidu. Il a été proposé que l'itaconate exerce des effets antiviraux en inhibant la SDH26, mais il est peu probable que l'inhibition de la SDH joue un rôle dans les effets antigrippaux des trois isomères, car le citraconate (qui n'inhibe pas la SDH) a inhibé la réplication de l'IAV le plus efficacement. .

Nous avons identifié le citraconate comme le premier inhibiteur ACOD1 endogène, mais les conséquences physiologiques au niveau de l'organisme restent inconnues. Chez les souris saines, nous avons précédemment trouvé les niveaux de citraconate les plus élevés dans les ganglions lymphatiques5. Bien que le ou les types de cellules hébergeant le citraconate restent inconnus, il est tentant de supposer qu'il pourrait moduler les processus immunitaires dans les ganglions lymphatiques en inhibant ACOD1. Parce qu'il n'y a aucune preuve que le citraconate se produise dans les cellules myéloïdes, une telle inhibition d'ACOD1 devrait probablement se produire de manière paracrine. Son rôle en tant qu'agoniste endogène de NRF2 nécessite également une exploration plus approfondie, notamment parce que les types de cellules hébergeant le citraconate in vivo ne sont pas connus. Considérant que le citraconate n'a pas été détecté dans les cellules dTHP1 activées, nous considérons qu'il est peu probable qu'il joue un rôle plus important dans la signalisation NRF2 dans les macrophages que l'itaconate. Nos résultats corroborent un modèle précédemment formulé selon lequel le mésaconate est dérivé de l'itaconate6,7 (voir également l'article d'accompagnement de He et al.27), mais on ne peut que spéculer sur la ou les origines physiologiques du citraconate chez l'homme. Nous montrons qu'il n'est pas dérivé de l'itaconate ou du mésaconate. Sur la base d'études sur des patients atteints d'acidurie méthylmalonique, il a été proposé qu'il s'agisse d'un dérivé de l'isoleucine BCAA par le biais du tiglyl-CoA8. Le métabolisme des BCAA est un élément essentiel de l'homéostasie énergétique et immunitaire, et le citraconate pourrait ainsi faire partie des réseaux de régulation régissant le métabolisme des BCAA. Dans l'ensemble, le citraconate semble être l'isomère ayant le plus grand potentiel de développement translationnel de médicaments. Ses caractéristiques à multiples facettes telles que les propriétés anti-inflammatoires, anti-oxydantes et antivirales en font une colonne vertébrale particulièrement attrayante pour le développement de médicaments pharmacologiquement optimisés pour traiter les troubles induits par l'inflammation, l'infection virale ou les deux. La pertinence pharmacologique de l'inhibition d'ACOD1 par le citraconate reste à explorer in vivo. Nos études avec du citraconate à faible dose (1 mM) suggèrent que l'abrogation de la synthèse endogène de l'itaconate pourrait ne pas avoir un impact important sur l'activation maximale des macrophages humains, du moins en ce qui concerne les ARNm de CXCL10, IL-6 et IL-1β. La plupart des travaux sur le rôle de l'itaconate endogène ont été réalisés chez la souris, et les phénotypes hyper- et hypo-inflammatoires des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ACOD1-/- ont été décrits28,29. De plus, l'ACOD1 murin est beaucoup plus actif que l'enzyme humaine, ce qui entraîne des niveaux d'itaconate cinq à dix fois plus élevés dans les macrophages activés par rapport aux humains1,2. Il est donc possible qu'ACOD1 joue un rôle moins important dans la régulation de l'inflammation chez l'homme que chez la souris. De plus, les conséquences de l'inhibition d'ACOD1 peuvent devenir pleinement manifestes uniquement au niveau de l'organisme et peuvent ne pas être apparentes dans les modèles cellulaires. En effet, nous avons récemment découvert que l'expression de CXCL10 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse infectés par l'IAV ne différait pas entre les souris de type sauvage et les souris ACOD1–/–, alors que l'inflammation pulmonaire évaluée histologiquement était significativement plus élevée chez les souris ACOD1–/–10. Contrairement à l'inflammation, le citraconate à faible dose a eu un effet marqué sur les intermédiaires du cycle du TCA et a eu tendance à améliorer la respiration mitochondriale dans les cellules dTHP1 stimulées par le LPS/IFN-γ. Curieusement, il a été démontré que l'accumulation d'itaconate est corrélée à la paralysie immunitaire, comme on le trouve par exemple dans la septicémie30. Les dérivés du citraconate peuvent donc s'avérer bénéfiques dans le traitement des patients atteints de septicémie en phase terminale ou d'autres scénarios caractérisés par l'épuisement de l'immunité innée. De plus, compte tenu des effets protumorigènes d'ACOD1, le citraconate peut s'avérer utile comme échafaudage pour le développement d'inhibiteurs d'ACOD1 pour le traitement du cancer.

Nos résultats concernant le mésaconate complètent ceux rapportés dans l'article d'accompagnement de He et al.27. En utilisant une analyse de flux métabolique assistée par isotope stable, ces auteurs démontrent que le mésaconate est bien un catabolite de l'itaconate. Ils rapportent les effets immunomodulateurs du mésaconate dans les macrophages murins, qui semblent largement indépendants de Nrf2, et ils montrent les effets bénéfiques du mésaconate dans un modèle murin de septicémie induite par le LPS. De plus, ils montrent que l'itaconate est un inhibiteur de SDH beaucoup plus puissant que le mésaconate. Cependant, leurs résultats diffèrent des nôtres en ce sens qu'ils constatent une certaine inhibition de la SDH par le mésaconate lors de l'analyse de cellules entières. Les différences entre les observations de He et al. et par nous peuvent être dus à des différences dans les espèces et les dosages utilisés. Néanmoins, pris ensemble, les résultats des deux articles suggèrent qu'il est peu probable que l'inhibition de la SDH par le mésaconate ait un fort impact biologique.

hACOD1 (acides aminés 4–461) et mACOD1 (acides aminés 4–462) ont été produits dans Escherichia coli, purifiés comme décrit précédemment2 et stockés dans du tampon GF (10 mM HEPES, pH 7,4, 10 % v/v glycérol, 150 mM NaCl ). Les dosages ont été effectués en triple. Les enzymes dans 46,6 µl de tampon GF (30 µg mACOD1 ou 90 µg hACOD1) ou 46,6 µl de tampon GF sans enzyme ont été mélangés avec 3,3 µl de cis-aconitate 15 ou 150 mM (pH 6,5), ce qui a donné des concentrations finales de cis-aconitate de 1 ou 10 mM. Les tests (50 μL) ont été incubés à 37 °C pendant 2 h puis placés sur de la glace. Pour l'extraction des acides organiques, 800 ul de solvant d'extraction (acétonitrile/méthanol 1:1) ont ensuite été ajoutés à la réaction et le volume résultant a été transféré dans un nouveau tube. Les tubes de réaction maintenant vides ont été rincés avec de l'eau (150 ul), qui a ensuite été ajoutée aux tubes contenant le test d'activité dans le solvant d'extraction, ce qui a donné un volume final de 1000 ul. Les échantillons ont été mélangés pendant 30 s et conservés à –80 °C.

Un ensemble d'acides carboxyliques (acide pyruvique, acide succinique, acide citrique, acide citraconique, acide (2E)-2-éthylbut-2-ènedioïque (EN300-234639, Enamine), acide dl-isocitrique et acide trans-aconitique) ont été criblés comme inhibiteurs potentiels. Les acides ont été dissous dans de l'eau et neutralisés. Les dosages enzymatiques ont été effectués dans un tampon phosphate de sodium, pH 7,4, avec 2 mM de cis-aconitate et 10 mM de l'inhibiteur potentiel. La quantité d'enzyme qui décarboxylerait environ la moitié du substrat a été utilisée par dosage de 150 µl (20 µg d'Aspergillus ACOD1, acides aminés 12 à 490, 24 µg de hACOD1 et 5 µg de mACOD1). L'itaconate a été quantifié par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), comme décrit ci-dessous.

Les ACOD1 humains, de souris et d'Aspergillus ont été préparés comme décrit précédemment2 et stockés dans du tampon GF (HEPES 10 mM, pH 7,4, 10 % v/v glycérol, 150 mM NaCl). Les solutions de l'inhibiteur (acide citraconique ; Acros) et du substrat (acide cis-aconitique ; Sigma-Aldrich), tous deux à pH 6,5 (NaOH), ont été conservées à -20 °C. Pour le dosage, 125 µl de tampon phosphate de sodium 0,2 M, pH 6,5, ont été mélangés sur de la glace avec 5 µl d'enzyme, 10 µl de citraconate (ou 10 µl d'eau) et 10 µl de cis-aconitate. Les concentrations finales de l'inhibiteur étaient de 50, 100 et 200 uM. Les combinaisons suivantes de quantité d'enzyme et de concentration de substrat ont été utilisées : 2 µg de hACOD1 ou 0,4 µg de mACOD1 avec 0,1, 0,2 ou 0,5 mM de substrat ; 3 µg de hACOD1 ou 0,6 µg de mACOD1 avec un substrat 1 ou 2 mM ; 5 µg de hACOD1 ou 1 µg de mACOD1 avec un substrat de 5 ou 10 mM. Les dosages ont été effectués en triple exemplaire. L'incubation à 37 °C pendant 10 min a été immédiatement suivie d'une inactivation thermique de l'enzyme à 95 °C pendant 3 min. Le précipité de protéines a été culotté par centrifugation pendant 1 h. Les surnageants ont été acidifiés avec 100 µl de H3PO4 100 mM. L'acide itaconique a été mesuré par HPLC (colonne Shodex RSpak DE-413, 1 ml min-1 H3PO4 10 mM, volume d'injection 10-20 µl, détection à 210 nm). Les courbes résultantes ont été ajustées à l'aide de GraphPad Prism avec l'équation v = kcat[S]/(KM(1 + [I]/Ki) + [S]) (où v = vitesse, kcat = constante de vitesse catalytique, KM = Michaelis- constante de Menten, Ki = constante d'inhibiteur) avec les variables indépendantes concentration d'inhibiteur [I] et concentration de substrat [S].

L'inhibition de la SDH a ​​été testée avec le kit de test d'activité MitoCheck Complex II (Cayman). Le kit fournit des réactifs pour mesurer l'activité SDH dans les mitochondries cardiaques bovines. L'itaconate, le citraconate et le mésaconate ont été neutralisés avec du NaOH (pH 7,4–7,7) et testés à des concentrations de 10 mM, 3 mM, 1 mM, 0,25 mM, 50 µM et 10 µM. Le malonate disodique inhibiteur de SDH a ​​été utilisé comme témoin positif. Le test a été effectué dans une plaque à 96 puits en triple exemplaire selon les instructions du fabricant sous inhibition des complexes mitochondriaux I, III et IV par 1 µM de roténone, 10 µM d'antimycine A et 1 mM de KCN, respectivement.

Une lignée cellulaire de leucémie monocytaire aiguë humaine (THP1, DSMZ n° ACC 16) a été cultivée dans du RPMI 1640 (Gibco, n° de catalogue 31870-025) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal avancé inactivé par la chaleur (FBS-11A ; Capricorn Scientific) et 1 % de GlutaMAX-I (100× ; Gibco, catalogue n° 35050-038), à 5 % de CO2 et 37 °C. Quelques 5 × 105 cellules ont été ensemencées dans des plaques 12 puits (Falcon) puis différenciées en macrophages adhérents. Les cellules ont été stimulées avec 125 ng ml-1 de phorbol 12-myristate 13-acétate (Sigma-Aldrich, n° de catalogue P8139) pendant 48 h dans du milieu complet RPMI avant que le milieu ne soit rafraîchi. Les cellules ont ensuite été autorisées à se différencier davantage pendant un jour supplémentaire. La différenciation a été vérifiée morphologiquement par microscopie et par cytométrie en flux pour l'expression de CD14 et CD11c. Des cellules d'adénocarcinome humain ressemblant à des cellules épithéliales alvéolaires de type II (A549, ACC107, obtenues auprès de DSMZ) ont été propagées dans du milieu DMEM additionné de 10 % de FCS et de 1 % de GlutaMAX-I. La lignée cellulaire de kératinocytes humains HaCaT a été fournie par T. Werfel (Hannover Medical School)31 et cultivée dans du RPMI 1640 (Gibco, catalogue n° 21875-034) additionné de 10 % de FCS à 5 % de CO2 et à 37 °C. Les cellules NRF2–/– HaCaT sont décrites dans la réf. 32. Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour la contamination par Mycoplasma à l'aide du kit de détection Venor GeM Classic Mycoplasma pour PCR conventionnelle (Minerva Biolabs, catalogue n° 11-1100).

Les cellules dTHP1 ont été incubées pendant 6 ou 24 h avec différentes concentrations d'itaconate (0,125, 5, 10 et 25 mM), de mésaconate ou de citraconate (5, 10 et 25 mM) dans 1 ml de RPMI. Après élimination complète du milieu et lavage soigneux (une à trois fois) des cellules et des bordures de puits avec 1 ml de PBS, les cellules ont été extraites avec 1 ml de tampon d'extraction glacé (acétonitrile/méthanol/eau, 2:2:1) contenant des étalons internes, suivis d'un mélange pendant 30 s et ont été conservés à –20 °C pour un stockage à court terme et à –80 °C pour un stockage à long terme. Pour l'expérience de co-stimulation LPS/IFN-γ, les cellules dTHP1 ont été traitées avec 200 ng ml-1 LPS (Sigma, catalogue n° L6511) et 400 U ml-1 IFN-γ humain (PeproTech, catalogue n° 300-02 ) pendant 0, 6, 12, 18, 24, 30 et 48 h puis extrait avec 1 ml de tampon d'extraction glacé comme décrit précédemment5.

Nous avons supprimé un fragment de 2 962 pb (7 347–10 308) couvrant une partie de l'exon 4 et la totalité de l'exon 5. Les cellules THP1 ont été soumises à une électroporation transitoire avec deux plasmides d'expression EF1α-Cas9-2A-EGFP/U6-guideRNA (1250 V, 50 ms, 1 impulsion ; 5 × 106 cellules ml−1, 50 µg ml−1 chaque plasmide), en utilisant le Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific)33, un contenant un ARN guide dirigé contre ACOD1 exon 4 (5′-CCATGGATTTTTGATGACACG-3′) et l'autre contenant un ARN guide dirigé contre la région 3' non traduite du locus ACOD1 (5'-CATGAGCCTCAAGGTTTTAG-3'). Les cellules ont été triées pour améliorer l'expression de la protéine fluorescente verte après 18 h et ensemencées sous forme de colonies unicellulaires via une dilution limitée. Après expansion, les clones déficients en ACOD1–/– ont été identifiés par PCR génomique et séquençage Sanger. Le knock-out a été vérifié en confirmant l'absence de protéine ACOD1 par immunoblot (Fig. 6b supplémentaire) et l'absence de synthèse d'itaconate par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC – MS / MS) (Extended Data Fig. 2a).

Quelques 5 × 105 cellules dTHP1 ont été infectées avec la souche IVA (H1N1) PR8M à une multiplicité d'infection de 1. Dans le cas des traitements, les cellules ont été pré-incubées pendant 12 h avec un tampon à pH ajusté contenant de l'itaconate, du mésaconate, du citraconate et /ou de l'itaconate de 4-octyle aux concentrations indiquées sur les figures et ont ensuite été incubés avec le virus pendant 2 h dans du milieu frais pour permettre la liaison du virus et son entrée dans les cellules. Le milieu d'infection a ensuite été remplacé par un milieu frais à pH ajusté contenant le composé de traitement à la concentration indiquée. Douze heures après l'infection, les cellules ont été lavées dans un tampon, culottées et l'ARN a été extrait pour une analyse ultérieure de l'expression de l'ARNm par PCR quantitative avec transcription inverse (RT – qPCR), en utilisant les séquences d'amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. Les concentrations de CXCL10 dans les surnageants cellulaires étaient mesuré à l'aide du kit de développement ELISA ABTS standard humain CXCL10 (PeproTech, n° de catalogue 900-K39). Les concentrations de cytokines/chimiokines dans les surnageants ont été mesurées à l'aide du panel de cytokines humaines à 27 plex (Bio-Rad, catalogue n° 171-A1112) comme décrit dans la réf. 10, à partir duquel le texte suivant a été utilisé : "Des courbes standard ont été générées avec huit dilutions en série de 2 à partir de 32 ng/mL. 100 μL de tampon de dosage ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque de microfiltration, suivis de l'ajout de 50 μL de suspension de billes. Après avoir lavé les billes avec le tampon de dosage, 50 μL de standard ou l'échantillon (surnageant) ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 30 min à température ambiante (TA) sous agitation douce. 25 μL de prémélange d'anticorps pour la détection ont été ajouté dans chaque puits suivi d'une incubation pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce Trois étapes de lavage ont été effectuées en utilisant 50 μL de tampon de dosage dans chaque puits, suivi d'un lavage avec une solution de streptavidine pendant 10 min à RT avec agitation Lavage final avec 125 μL de tampon de test a été effectué avant la quantification à l'aide du logiciel BIO-PLEX Manager version 4." L'IL-7 et l'IL-13 ont été exclues des analyses ultérieures en raison de concentrations inférieures à la limite de détection dans la plupart des échantillons.

Comme décrit précédemment34, des cellules MDCK-II (American Tissue Culture Collection, catalogue n° CRL-2936) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits et cultivées pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2. Les cellules confluentes à 90 % ont été lavées une fois avec du PBS++ (1 x PBS contenant du Ca2+, du Mg2+, de la BSA à 0,3 % (Sigma) et de la pénicilline-streptomycine (Invitrogen)) et les cellules ont été infectées avec les dilutions d'échantillons de virus en série de 10 fois et incubées à la pièce température pendant 1h. L'inoculum viral a été aspiré et 150 µl d'Avicel à 1,25 % contenant 1 µg de trypsine traitée par Np-tosyl-L-phénylalanyl chlorométhyl cétone par ml ont été ajoutés à chaque puits et incubés à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été fixées à température ambiante pendant 1 h avec du PBS++ contenant 3,7 % de formaldéhyde et 1 % de Triton X-100. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS/Tween-20 (0,05 %), puis incubées avec un anticorps primaire (IgG monoclonale de souris anti-IAV-NP, surnageant d'hybridome dilué au 1/100 ; fourni par S. Ludwig, Université de Münster) à température ambiante pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois et incubées avec de l'IgG conjuguée à la peroxydase de raifort anti-souris de chèvre (HRP) (Invitrogen A16072) à température ambiante pendant 1 h. Le 3-amino-9-éthylcarbazole (Sigma) a été utilisé comme substrat pour l'immunocoloration et incubé à température ambiante pendant 30 à 60 min. Après un développement clair des foyers colorés en rouge, ils ont été comptés pour déterminer le titre viral en unités formant des foyers (FFU) en utilisant l'équation FFU ml−1 (stock) = (1/dilution de virus) × (nombre de foyers) × (facteur de dilution).

L'utilisation de tissus humains a été approuvée par le comité d'éthique de la faculté de médecine de Hanovre (dossier n° 2923-2015) et tous les donneurs ont donné leur consentement éclairé pour l'utilisation des tissus à des fins de recherche. Le tissu pulmonaire explanté de patients présentant une indication clinique de transplantation pulmonaire a été divisé en morceaux d'environ 30 mg et cultivé et infecté essentiellement comme décrit dans la réf. 10. Les tissus ont été conservés dans du tampon RPMI jusqu'à 20 h avant le début de l'expérience. Les morceaux de tissu ont été prétraités pendant 14 à 19 h avec un tampon à pH ajusté contenant uniquement le composé ou le tampon, puis incubés dans un milieu d'infection RPMI contenant l'IAV (2 × 105 FFU ml-1) et le composé ou le tampon uniquement pendant 24 h supplémentaires. Trois pièces provenant chacune de cinq donneurs (trois emphysèmes, trois fibroses pulmonaires idiopathiques ; deux hommes, trois femmes ; âgés de 58 à 66 ans) ont été utilisées.

Les cellules ont été lavées une fois dans du PBS glacé et lysées dans un tampon RIPA glacé (contenant un inhibiteur de protéase et de phosphatase). Lors de la quantification de la protéine par le test de Bradford, un volume égal de tampon d'échantillon 2x Laemmli a été ajouté. Les échantillons ont été dénaturés par la chaleur à 95°C pendant 10 min. Les extraits protéiques ont été résolus par électrophorèse sur gel et transférés sur une membrane de transfert en nitrocellulose NC de 0,2 µm (GE Healthcare, catalogue n° 10600004). La liaison non spécifique a été bloquée avec du lait en poudre écrémé à 5 % et les bandes ont été visualisées par chimioluminescence améliorée avec des anticorps primaires spécifiques à STAT1 (Santa Cruz Biotechnology, catalogue n° sc-345 ; dilué à 1:500), phospho-STAT1 ( Cell Signalling, n° de catalogue 9167S ; dilué à 1 : 1 000), NRF2 (Cell Signalling, n° de catalogue 12721S ; dilué à 1 : 1 000), suivi d’une incubation avec de l’IgG anti-lapin de chèvre–HRP (Southern Biotech, n° de catalogue 4030- 05). La β-actine a été visualisée à l'aide d'un anticorps anti-β-actine conjugué à la HRP (Abcam, n° de catalogue ab49900) ou d'un anticorps monoclonal de souris IgG1 d'anticorps β-actine (C4) (Santa Cruz Biotechnology, n° de catalogue sc-47778). Les membranes ont été développées en utilisant Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, catalogue n° RPN2232). Un imageur western blot iNTAS (iNTAS Science Imaging) a été utilisé pour l'imagerie de la membrane.

Les cellules dTHP1 ont été ensemencées à une densité de 5 × 105 cellules par puits dans une plaque à 12 puits. Les cellules ont été pré-incubées avec les traitements pendant 12 h, infectées par IAV (multiplicité d'infection de 1) et incubées avec du milieu frais contenant les traitements. Les niveaux de ROS mitochondriaux ont été mesurés 12 h après l'infection. Les cellules ont été incubées pendant 5 min avec un milieu contenant 5 μM de MitoSox Red (indicateur de superoxyde mitochondrial; ThermoFisher Scientific, n° de catalogue M36008) puis lavées avec du PBS. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans du PBS froid et les niveaux de ROS mitochondriaux ont été mesurés via le canal de la phycoérythrine à l'aide d'un cytomètre en flux BD LSR-II.

Des cellules HaCaT (1,5 × 105) ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits pendant une nuit, puis traitées avec les concentrations indiquées d'itaconate, de mésaconate et de citraconate pendant 16 ou 17,5 h. Les cellules ont ensuite été lavées dans un tampon, culottées et l'ARN a été extrait pour les mesures d'ARNm par RT – qPCR à l'aide des séquences d'amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. La stabilisation de NRF2 a été évaluée par immunoblot (voir ci-dessus).

Quelques 2,5 × 104 cellules THP1 ont été ensemencées dans une plaque 96 puits (Falcon) puis différenciées en macrophages adhérents. Les cellules doivent être confluentes entre 80 % et 100 % avant de commencer le test. Le stock de réactifs MTT (Life Technologies, catalogue n° M6494; 5 mg ml-1 dans du PBS) a été dilué au 1/10 dans un milieu complexe RPMI à 37 °C. Après élimination du surnageant, 50 µl de la dilution préparée ont été ajoutés aux cellules et incubés à 37 ° C pendant 20 à 60 min tout en observant périodiquement la couleur des cellules. Le réactif a été retiré une fois la coloration terminée et 50 ul de diméthylsulfoxyde (Merck) ont été ajoutés. Après mélange sur un agitateur pendant 5 à 15 min (jusqu'à ce que la solution soit homogène), le changement de couleur a été quantifié par un lecteur de dosage immuno-enzymatique (BioTek Synergy 2), en utilisant 540/570 nm comme longueur d'onde de mesure et 630 nm comme longueur d'onde de mesure. longueur d'onde de référence.

Le modèle de souris a été réalisé essentiellement comme décrit dans la réf. 35, à partir duquel des parties du texte suivant ont été utilisées : "Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université du Luxembourg et par les agences gouvernementales appropriées. Le travail sur les animaux de la présente étude a été mené et rapporté conformément à l'ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) pour améliorer la conception, l'analyse et la notification des recherches utilisant des animaux, en maximisant les informations publiées et en minimisant les études inutiles Des souris mâles et femelles C57BL/6N âgées de trois à quatre mois ont été obtenues des Laboratoires Charles River (France). Les souris ont été hébergées dans un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec de la nourriture stérile et de l'eau ad libitum. Les souris étaient exemptes d'agents pathogènes spécifiques, hébergées dans des cages ventilées individuellement à un maximum de 5 par cage et maintenues à un température de 22 °C et une humidité relative de 55 %. Ils ont été maintenus sur une litière de rafles de maïs autoclavées et nourris avec des régimes SAFE irradiés à une min de 25 kGy. Le système d'abreuvement consistait en de l'eau osmosée avec 2 ppm de chlore. Les souris ont été traitées avec une seule injection intrapéritonéale de LPS (4 μg de LPS/g de poids corporel) ou de PBS comme véhicule témoin. Les souris ont été profondément anesthésiées avec une combinaison de kétamine (100 mg/mL ; Nimatek Vet) et de dorbène (chlorhydrate de médétomidine ; 1 mg/mL ; Dorbene Vet) 0, 12, 24 et 48 h après l'injection de LPS. Les rates ont été disséquées après perfusion transcardiaque avec du PBS glacé, recueillies dans du HBSS glacé (Gibco/Life Technologies) avec 1 M HEPES (Gibco/Life Technologies) et 0,5 % de D-(+)-glucose (Sigma-Aldrich) et puis stocké dans de l'azote liquide."

Les mesures ont été effectuées selon notre test validé de chromatographie liquide à haute performance et de spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS)5. En bref, les échantillons ont été extraits dans 1 000 µl de réactif d'extraction (méthanol/acétonitrile/eau avec un rapport final de 2:2:1 v/v/v ; dopés avec 0,1 µM 13C2-citrate et 13C5-itaconate, 0,2 µM 13C6-cis -aconitate et 13C4-succinate, et 1 µM 13C3-lactate comme étalons internes). Les suspensions ont été transférées dans des tubes de réaction à verrouillage sécurisé de 2 ml (Eppendorf, numéro de catalogue 0030120094), vortexées pendant 30 s et congelées à -20 ° C pendant la nuit pour compléter la précipitation des protéines. Préparation ultérieure de l'échantillon et dosage HPLC-MS/MS à l'aide d'une colonne en phase inverse Kinetex C18 (Phenomenex, n° de catalogue 00D 4462 Y0) sur un système de chromatographie Nexera (Shimadzu) couplé à un spectromètre de masse QTRAP5500 triple quadripôle/piège à ions linéaire (Sciex ) ont été essentiellement réalisées comme décrit5.

Les métabolites cellulaires ont été extraits comme décrit dans la réf. 36, en utilisant 6 × 106 cellules par échantillon. Les concentrations d'acides aminés (n = 20), de métabolites d'acides aminés (n = 30), d'amines biogènes (n = 9), de succinate et de lactate ont été mesurées sur un spectromètre de masse AB SCIEX 5500 QTrap (Ab Sciex), à l'aide du MxP Quant Kit 500 (Biocrates Life Sciences) selon les protocoles du fabricant (https://biocrates.com/mxp-quant-500-kit). Les ratios et les sommes d'analytes ("indicateurs de métabolites") ont été calculés à l'aide du logiciel MetaboIndicator (Biocrates).

Le taux de consommation d'oxygène a été déterminé à l'aide d'un analyseur Seahorse XF-96 (Agilent) et du kit Mito Stress Test (Agilent, catalogue n° 103015-100) en suivant les protocoles du fabricant. En bref, 2,5 × 104 cellules THP1 ont été étalées sur des microplaques de culture cellulaire Agilent Seahorse XF96 (référence 101085-004) et différenciées avec du phorbol 12-myristate 13-acétate comme décrit ci-dessus. Le jour du test, le milieu de culture cellulaire a été remplacé par du milieu Seahorse XF RPMI (Agilent, catalogue n° 103576-100) contenant 10 mM de glucose (Agilent, catalogue n° 103577-100), 1 mM de pyruvate (Agilent, catalogue n° 103578-100) et 2 mM de glutamine (Gibco, n° de catalogue 35050-038), et placés dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant 45 à 60 min avant le test. Lors du chargement dans l'analyseur Seahorse XF-96, une incubation séquentielle in situ des composants a été effectuée comme suit : mesure de base pendant 18 min, oligomycine 1,5 µM (Agilent) pendant 18 min, cyanure de carbonyle 1 µM-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (Agilent) pendant 18 min et roténone/antimycine A 0,5 µM (Agilent) pendant 18 min. Les données sur le taux de consommation d'oxygène ont été analysées avec le logiciel Wave v.2.2.1 (Agilent).

De l'acide itaconique, mésaconique ou citraconique (13,0 mg, 100 µM) ou de l'acide oxaloacétique (13,2 mg, 100 µM) ont été ajoutés en parallèle à un ensemble de quatre tubes Eppendorf de 2 ml contenant du l-glutathion réduit (30,7 mg, 100 µM). Les mélanges réactionnels ont été dissous dans de l'eau Milli-Q (1 ml) et ont été agités à température ambiante pendant 2 h. Des aliquotes de 10 µl ont été transférées dans des flacons LC-MS contenant de l'eau Milli-Q (490 µl), de l'acétonitrile (495 µl) et du chlorhydrate de diphenhydramine (5 µl de solution 10 µM dans de l'acétonitrile) comme étalon interne. Les flacons ont été bouchés, vortexés et soumis à une analyse par chromatographie liquide ultra-performante–spectrométrie de masse haute résolution à l'aide d'un système Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ focalisé/Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap LC–MS/MS (ThermoFisher Scientific). Ce système se compose d'une pompe Dionex UltiMate 3000 RS, d'un échantillonneur automatique RS, d'un compartiment de colonne RS, d'un détecteur à barrette de diodes et d'un spectromètre de masse quadripolaire-Orbitrap, ainsi que du logiciel standard Xcalibur v.4.4.16.14 pour le fonctionnement. Une colonne RP EC 150/2 NUCLEODUR C18 Pyramid, 3 µm (150 mm × 2 mm) (Macherey-Nagel) a été utilisée comme phase stationnaire, et un système de solvant binaire A et B (A = eau avec 0,1 % d'acide formique ; B = acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique) a été utilisé comme phase mobile. Dans un gradient, le pourcentage de B a été maintenu constant à une concentration initiale de 1 % de 0 à 2 min, puis augmenté de 1 % à 2 min à 60 % à 8,5 min, puis à 95 % à 9,5 min et maintenu à 95 % pendant 0,4 min. Le volume d'injection était de 2 μl, et le débit a été fixé à 250 μl min-1. La température de la colonne était de 40 °C et le tracé ultraviolet a été acquis à une longueur d'onde de 254 nm. Les données de spectrométrie de masse à haute résolution ont été enregistrées sur un système Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap. Les spectres de masse ont été acquis en mode positif de 100 à 1000 m/z. L'analyse MS par ionisation par électrospray chauffé a été effectuée à une tension de pulvérisation de 3800 V et à une température du tube de transfert d'ions de 350 ° C.

Tous les travaux de calcul ont été effectués à l'aide de Molecular Operating Environment (MOE), v.2020.09, Chemical Computing Group ULC, 910–1010 rue Sherbrooke Ouest Montréal, Québec, H3A 2R7, Canada. La procédure de calcul a été adaptée d'un protocole rapporté37 avec de légères modifications.

Les structures bidimensionnelles de l'acide itaconique, de l'acide mésaconique et de l'acide citraconique ont été esquissées à l'aide de ChemDraw Professional 19.0 et ont été importées dans la fenêtre MOE. Les composés ont été soumis à une minimisation d'énergie jusqu'à un gradient de 0,001 kcal mol-1 Å2 en utilisant le champ de force MMFF94x et le modèle de solvatation du champ R, puis enregistrés sous forme de fichier mdb. L'état de protonation prédominant des composés en milieu aqueux à pH 7 a été calculé via le calcul | molécule | commande wash dans la fenêtre de visualisation de la base de données. Structures cristallines aux rayons X de SDHA humain en complexe avec le cofacteur oxaloacétate (PDB ID : 6VAX)38, complexe respiratoire mitochondrial porcin II, contenant de l'oxaloacétate (PDB ID : 3SFD)39, ACOD1 humain (PDB ID : 6R6U)2 et ACOD1 de souris (PDB ID : 6R6T)2 ont été utilisés pour les études d'amarrage moléculaire. Le potentiel a été défini sur Amber10:EHT en tant que champ de force et champ R pour la solvatation. L'ajout d'atomes d'hydrogène, l'élimination des molécules d'eau de plus de 4,5 Å du ligand ou du récepteur, la correction des erreurs de bibliothèque et la minimisation de l'énergie attachée du site de liaison ont été effectuées via le module QuickPrep.

Le site de liaison a été défini sur des atomes factices qui ont été identifiés par la commande site finder. Les résidus d'acides aminés délimitant le site de liaison de l'oxaloacétate/succinate dans le site actif de la sous-unité SDHA ont été sélectionnés. Pour ACOD1, le site de liaison a été défini en fonction du site actif putatif2. Le placement d'amarrage était matcher de triangle avec une option de raffinement d'ajustement induit. La première fonction de notation était alpha HB avec 1 000 poses, suivie d'un score de raffinement London dG avec 10 poses.

Dans la fenêtre de visualisation de la base de données, les descripteurs moléculaires ont été calculés pour toutes les entrées en activant le panneau de calcul et en choisissant l'option de calcul des descripteurs. Les énergies (eV) de la plus basse orbitale moléculaire inoccupée et de la plus haute orbitale moléculaire occupée ont été calculées à l'aide de l'hamiltonien semi-empirique Austin Model 1 (AM1) par le programme de chimie quantique MOPAC v.7.0 inclus dans MOE.

Dans la base de données contenant les dicarboxylates, l'empreinte bidimensionnelle BIT_MACCS (166 clés structurelles MDL MACCS publiques, condensées en bits) a été calculée pour toutes les entrées. Le succinate a été sélectionné comme structure de requête et a été envoyé à la fenêtre MOE. Dans la fenêtre de visualisation de la base de données, la recherche de similarité a été effectuée en choisissant calculate | empreinte digitale | commande de recherche. Le système d'empreintes digitales a été défini sur BIT_MACCS et le coefficient de Tanimoto (TC) comme métrique de similarité. Les valeurs de TC vont de 0 (pas de similarité) à 1 (similarité complète). La recherche de similarité pour le cis-aconitate a été effectuée de la même manière en utilisant le piDAPH3 (pharmaphore à 3 points basé sur la conformation 3D, considérant le système pi, les propriétés atomiques du donneur et de l'accepteur) comme empreinte digitale et le cis-aconitate comme structure de requête.

La signification des différences entre plus de deux groupes a été évaluée avec une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Le test t non apparié a été utilisé pour évaluer la signification des différences entre deux groupes de n = 4 ou n = 3, le test U de Mann-Whitney pour la comparaison des médianes de données non distribuées normalement lorsque n ≥ 7. Nous avons ajusté pour tester de multiples hypothèses comme indiqué dans les légendes des figures. La signification a été définie comme une valeur P ou un taux de fausses découvertes ≤0,05 en utilisant les symboles suivants : *≤0,05, **≤0,01, ***≤0,001 et ****≤0,0001. Dans les expériences cellulaires, n désigne toujours des répliques biologiques, par exemple des cellules de la même lignée qui ont été cultivées dans un puits séparé mais soumises aux mêmes manipulations expérimentales que les autres répliques. Sauf indication contraire, les données sont présentées sous forme de moyennes, avec des barres d'erreur indiquant sd et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism v.9.3.1 (GraphPad Software). Pour PCA, les valeurs ont été transformées en log2 puis analysées avec MetaboAnalyst v.5.0 (https://www.metaboanalyst.ca). Les diagrammes de Venn ont été dessinés à l'aide de jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Les données sources sous-jacentes à l'analyse liée aux acides aminés présentées dans les données étendues de la Fig. 5 et les Figs supplémentaires. 3 et 4 sont disponibles dans les données supplémentaires 1. Les données brutes sous-jacentes à l'analyse multiplex cytokine/chimiokine illustrée à la Fig. 2 et les données étendues Fig. 6 sont disponibles dans les données supplémentaires 2. les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions Annette Garbe et Tarequl Nishad Islam pour l'assistance technique experte, et Djalil Coowar pour la supervision des soins aux animaux. Nous tenons à souligner le soutien de l'Association Helmholtz des centres de recherche allemands dans le cadre du projet Aging and Metabolic Programming (AMPro), de l'Initiative de l'Association Helmholtz sur la médecine personnalisée (iMed), du Fonds d'initiative et de mise en réseau de l'Association Helmholtz et du ministère fédéral allemand des Sciences et Prix ​​de l'éducation (BMBF) COVID-Protect (01KI20143C) (à FP). Un soutien supplémentaire a été fourni par le site partenaire du Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF) Giessen (à SP) et la Fondation Alexander von Humboldt (à MS).

Financement en libre accès fourni par le Helmholtz Center for Infection Research GmbH (HZI).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : WAM Elgaher, M. Winterhoff, K. Büssow.

Groupe de recherche Biomarqueurs pour les maladies infectieuses, Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections, Braunschweig, Allemagne

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon & F. Pessler

Groupe de recherche Biomarqueurs pour les maladies infectieuses, Centre TWINCORE de recherche expérimentale et clinique sur les infections, Hanovre, Allemagne

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon & F. Pessler

Institut Helmholtz pour la recherche pharmaceutique Sarre - Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections, Sarrebruck, Allemagne

WAM Elgaher & AKH Hirsch

Département de structure et de fonction des protéines, Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections, Braunschweig, Allemagne

K. Bussow, E. Graner et W. Blankenfeldt

Groupe de neuro-immunologie, Département de recherche sur le cancer, LIH Luxembourg Institute of Health, Luxembourg, Luxembourg

Y. Pires-Afonso & A. Michelucci

Faculté des Sciences, de la Technologie et de la Médecine, Université du Luxembourg, Esch-Belval, Luxembourg

Y. Pires-Afonso

Division de médecine moléculaire, Université de Dundee, Dundee, Royaume-Uni

L. Casares Perez & L. de la Vega

Institut Fraunhofer de toxicologie et de médecine expérimentale (ITEM), Hanovre, Allemagne

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Institut de chimie clinique et de pharmacologie clinique, University Medical Center Bonn, Bonn, Allemagne

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Institut d'immunologie, Philipps-University Marburg, Marburg, Allemagne

T. Zillinger

Institut de virologie médicale, Justus-Liebig-University Giessen, Giessen, Allemagne

M. Shehata & S. Pleschka

Centre national de recherche, Gizeh, Égypte

M. Shehata

Site partenaire du Centre allemand de recherche sur les infections Giessen, Giessen, Allemagne

S.Pleschka

Research Core Unit Metabolomics, Hannover Medical School, Hanovre, Allemagne

H. Bahre

Département d'immunologie de la transplantation, École de médecine de Hanovre, Hanovre, Allemagne

C. Falk

Luxembourg Centre for Systems Biomedicine, Université du Luxembourg, Esch-Belval, Luxembourg

A. Michelucci

Institut de biochimie, de biotechnologie et de bioinformatique, Université technique de Braunschweig, Braunschweig, Allemagne

W.Blankenfeldt

Département de pharmacie, Université de la Sarre, Sarrebruck, Allemagne

AKH Hirsch

Centre de médecine individualisée des infections, Hanovre, Allemagne

F.Pessler

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FC, MW, WAME, WB, AKHH, KB et FP ont conçu et conçu l'étude. FC, MW, FW, LCP et LdlV ont réalisé les expériences cellulaires. EG et KB ont effectué les essais in vitro. KB a identifié l'inhibition d'ACOD1 par le citraconate. WAME a effectué une modélisation ligand-cible, des calculs d'électrophilie et de similarité. FC, NS et TZ ont généré les cellules ACOD1-/-. MW, FC, HB, WAME et SS ont effectué la spectrométrie de masse. YP-A., FC et AM ont développé le modèle de souris LPS. LC a réalisé le modèle de poumon humain. MS et SP ont effectué le titrage du virus. CF a effectué les dosages de cytokines/chimiokines. FC, MW, WAME, KB et WZ ont analysé les données. FC, MW, WAME, KB et FP ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu la version finale du manuscrit et sont d'accord avec sa publication.

Correspondance à F. Pessler.

FP, FC, MW, KB, WB, AKHH et WAME sont co-inventeurs d'un brevet couvrant les applications médicales du citraconate, y compris l'utilisation immunomodulatrice, antioxydante et antivirale. UTILISATION DU CITRACONATE COMME MÉDICAMENT. Titulaire du brevet : Helmholtz Center for Infection Research. Inventeurs : Pessler F, Chen F, Winterhoff M, Büssow K, Blankenfeldt W, Hirsch AKA, Elgaher WM, PCT/EP2022/060682 (22 avril 2022).

Nature Metabolism remercie Luke O'Neill, Ping-Chih Ho, Jan Van den Bossche, Xavier Deup pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrice en chef de la manipulation principale : Isabella Samuelson, en collaboration avec l'équipe de Nature Metabolism.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Les cellules ont été incubées avec 25 mM de l'isomère respectif pendant 6 et 24 h et les concentrations des trois isomères ont ensuite été mesurées par HPLC-MS/MS dans les surnageants et les extraits de cellules lavées. a–f, concentrations intracellulaires. Les concentrations absolues sont indiquées en a–c, et les fractions des deux autres isomères par rapport à l'isomère ajouté au milieu en d–f. Il y a une augmentation dose-dépendante du mésaconate lorsque l'itaconate est ajouté au milieu (g) ​​mais une diminution de la fraction mésaconate/itaconate avec l'augmentation des concentrations d'itaconate (d). Les deux observations sont cohérentes avec la conversion intracellulaire d'une petite fraction d'itaconate en mésaconate par un processus saturable, vraisemblablement enzymatique. g–i, les concentrations d'itaconate restent stables dans les surnageants cellulaires. Les impuretés connues d'itaconate dans le mésaconate et le citraconate sont à nouveau détectées (voir également Fig. S1c – g supplémentaire). n = 3 répétitions biologiques, signifie ± SD.

a–h, l'accumulation de mésaconate culmine après l'accumulation d'itaconate dans l'inflammation induite par le LPS et dépend de la synthèse préalable d'itaconate dans les cellules dTHP1. a–d, les cellules dTHP1 ont été stimulées avec LPS/IFNγ et les concentrations intracellulaires des trois isomères ont été mesurées par HPLC-MS/MS aux moments indiqués. Le citraconate n'a pas été détecté. Ni l'itaconate ni le mésaconate n'ont été détectés dans les cellules ACOD1–/– dTHP1. La concentration maximale d'itaconate à 24 h était de 460 µmol/L. n = 3 répétitions biologiques, signifie ± SD. e–h, une inflammation systémique a été provoquée chez des souris C57BL/6N par injection intrapéritonéale de LPS, et les concentrations des trois isomères dans les homogénats de rate ont été mesurées par HPLC-MS/MS aux moments indiqués. n = 2 souris par instant. i–l, accumulation de mésaconate dans les cellules A549 surexprimant ACOD1. ACOD1 humain ou murin a été exprimé dans des cellules A549 par transfection transitoire, et les concentrations des trois isomères ainsi que des intermédiaires TCA sélectionnés et du lactate ont été mesurés par HPLC-MS/MS aux moments indiqués. Les valeurs

Analyse basée sur l'expérience illustrée à la Fig. 1, montrant en plus le point de temps de 24 h. La concentration de 0,125 mM d'itaconate a été utilisée pour imiter la contamination maximale d'itaconate trouvée dans du mésaconate 25 mM. a–g, Concentrations des analytes indiqués 6 h après traitement avec 5, 10 ou 25 mM, et 24 h après traitement avec 25 mM. h, rapport du succinate au fumarate, indiquant l'inhibition de la SDH. n = 3, moyenne ± ET. Test T non apparié. i, j, niveaux de succinate dans les cellules dTHP1 et A549 infectées par l'IAV, obtenus dans la même expérience que celle illustrée dans les données étendues Fig. 5d, e et une expérience indépendante. Seul l'ajout d'itaconate augmente les niveaux de succinate, et l'effet est plus prononcé dans dTHP1 que dans les cellules A549. n = 4 répétitions biologiques, moyenne ± SD. ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Valeurs P : * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001.

a–c, Structures des adduits GSH des isomères de l'itaconate. d, Classement des trois isomères en termes d'électrophilie. e – h, Prédiction par modélisation moléculaire de la liaison non covalente de l'itaconate et du mésaconate au site actif de la SDH. e, mode de liaison 3D de l'itaconate (jaune) par rapport à l'oxaloacétate (magenta) dans le site de liaison du succinate de la SDHA humaine (PDB ID : 6VAX)2. La liaison a été entièrement obtenue grâce à un réseau d'attractions électrostatiques, c'est-à-dire des liaisons hydrogène et des ponts salins (lignes pointillées) entre les groupes carboxyle C1 et C4 et les résidus de site actif (Thr308, Arg340, His407 et Arg451). Surface électrostatique de la protéine au site actif : positive (bleue), négative (rouge), neutre (blanche). Flavine adénine dinucléotide (FAD, vert). f, interactions ligand 2D de l'itaconate. g, mode de liaison potentiel du mésaconate (jaune) par rapport à l'oxaloacétate (magenta). Semblables à l'itaconate, les groupes C1 et C4-carboxyle du mésaconate sont les fragments exclusifs responsables de la liaison par des liaisons hydrogène et des interactions ioniques (lignes pointillées). Cependant, sa structure rigide et plane ne pouvait établir que des contacts partiels par rapport à l'itaconate. h, interactions ligand 2D du citraconate. i, Comparaison de l'inhibition de la SDH par l'itaconate, le mésaconate et le citraconate (dosage in vitro utilisant des mitochondries bovines). L'activité SDH a ​​été mesurée en présence de concentrations croissantes d'itaconate, de mésaconate, de citraconate et de l'inhibiteur témoin malonate (n = 3 dosages indépendants, moyenne ± ET). Parmi les isomères, l'itaconate était le plus puissant inhibiteur de SDH, il n'y avait pratiquement aucune inhibition par le citraconate.

Les cellules dTHP1 et A549 ont été laissées non traitées ou incubées avec de l'itaconate, du mésaconate ou du citraconate (20 mM) ou de l'itaconate de 4-octyle (4-OI, 125 µM), infectées avec IAV PR8M (MOI = 1), puis incubées avec du milieu frais contenant les traitements. La réplication a été mesurée dans les cellules dTHP1 12 h pi par l'expression de l'ARNm HA (RT-qPCR) et dans les cellules A549 24 h pi par la mesure de l'ARNm HA (RT-qPCR) et des titres viraux (test de formation de foyers). a, ARNm HA (cellules dTHP1). b, ARNm HA (cellules A549). c, titres IAV (cellules A549). n = 4 répétitions biologiques, signifie ± SD. ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Valeurs P : * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. Effets partagés et uniques des isomères de l'itaconate sur le métabolisme des acides aminés dans les cellules dTHP1 et A549 infectées par l'IAV. dg, même montage expérimental que ac, sauf que 4-OI (125 µM) a été utilisé comme traitement supplémentaire. Les concentrations de 20 acides aminés, 30 métabolites d'acides aminés et 9 amines biogènes ont été mesurées par HPLC-MS/MS (kit MxP Quant 500, Biocrates) après 12 h pour dTHP1, 24 h pour A549 (n = 4 par groupe). Des données supplémentaires, y compris les concentrations d'analytes individuels et les valeurs des indicateurs de métabolites, sont présentées dans les Fig. S3 et S4 supplémentaires. d, e, PCA basés sur les 59 analytes liés aux acides aminés. d, Dans les cellules dTHP1, l'infection n'entraîne que des modifications modestes, tandis que les trois isomères exercent des effets similaires mais clairement discernables, qui diffèrent profondément de l'impact de la 4-OI. e, Dans les cellules A549, l'infection exerce un impact beaucoup plus fort sur le métabolisme des acides aminés. f, diagrammes de Venn montrant des analytes qui sont différentiellement abondants (test T non apparié, FC> 1, 3, FDR ≤ 0, 05) dans les cellules infectées et non infectées par A549 et dTHP1. g, diagrammes de Venn pour les indicateurs de métabolites (66 sommes et rapports d'analytes fonctionnellement liés, calculés avec le logiciel Biocrates MetaboIndicatorTM). Données sources Le tableau 1 contient les données sources relatives à dg.

a,b, Expression de 14 gènes potentiellement inductibles par NRF2 dans les cellules WT et NRF2–/– HaCaT 17,5 h après l'administration d'isomères d'itaconate (20 mM). La plus grande différence entre l'expression dans les cellules WT et KO est observée lors de l'administration de citraconate. c – e, induction de l'ARNm de SLC7A11, GCLM et ME1 dans des cellules dTHP1 infectées par IAV par le citraconate mais pas le mésaconate. Les cellules ont été prétraitées avec des isomères d'itaconate (20 mM) pendant 12 h, incubées avec un milieu contenant le virus pendant 2 h (MOI = 1), puis incubées avec du milieu frais contenant des isomères d'itaconate pendant encore 10 h. f–q, Effets immunomodulateurs des isomères de l'itaconate. Expérience d'infection IAV identique à c–e. f–h, Expression des ARNm indiqués dans les cellules (RT-qPCR). i–q, Concentrations des cytokines/chimiokines indiquées dans les surnageants de culture (dosage multiplex sur microbilles). Le tableau de données source S2 contient les données brutes relatives à i–q. aq, n = 3 répétitions biologiques, signifie ± SD. Valeurs P : * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunnett.

a,b, essai sans cellule. Le mACOD1 recombinant a été incubé avec des concentrations croissantes de substrat (cis-aconitate) et d'inhibiteur (citraconate) et l'accumulation d'itaconate a été mesurée par HPLC. n = 3 essais indépendants, signifie ± SD. Données cinétiques relatives aux valeurs indiquées sur la figure 3c. La ligne représente une courbe ajustée à l'équation de Michaelis-Menten avec un inhibiteur compétitif. b, graphique Lineweaver – Burk des données présentées en a. c, Similitude avec le cis-aconitate (coefficient de Tanimoto) et les énergies de liaison des isomères de l'itaconate avec l'ACOD1 humain et murin. d, Mode de liaison putatif du citraconate (jaune) dans le site actif de la souris ACOD1 (PDB ID : 6R6T)1. Les groupes C1 et C4-carboxyle du citraconate se lient électrostatiquement via des liaisons hydrogène et des contacts ioniques (lignes pointillées) aux résidus du site actif (His103, His159, Lys207, Lys272 et Leu278). Surface électrostatique de la protéine au site actif : positive (bleue), négative (rouge), neutre (blanche). e, interactions ligand 2D du citraconate. f, superposition des modes de liaison putatifs du citraconate (jaune), de l'itaconate (cyan) et du mésaconate (vert) par rapport à celui du substrat cis-aconitate (magenta) dans le site actif de l'ACOD1 humain (PDB ID : 6R6U)1. Seul le citraconate peut adopter le même mode de liaison que le cis-aconitate, où les groupes carboxyle orientés cis sont pleinement impliqués dans les interactions avec les résidus du site actif (His159, Lys207, Lys272 et Leu278). En revanche, les groupes carboxyle de l'itaconate et du mésaconate interagissent partiellement, ce qui entraîne une affinité de liaison plus faible.

Une stimulation LPS / IFNγ et un traitement avec du citraconate ou de l'itaconate (1 mM ou 25 mM) ont été effectués comme sur la figure 4m-o. La respiration mitochondriale a été mesurée par le test Seahorse dans des cellules dTHP1 non stimulées ou après 12 h de stimulation. ac, graphiques à barres montrant le taux de consommation d'oxygène (OCR) dû à la respiration basale, à la respiration maximale (a et b) et à la capacité respiratoire de réserve (c). L'itaconate 25 mM a réduit de manière significative la respiration maximale et la capacité respiratoire de réserve dans les cellules dTHP1 induites par le LPS / IFNγ, alors qu'il y avait une tendance (p = 0, 076 et 0, 096 respectivement) du citraconate 1 mM à prévenir ce déclin, et il y avait une tendance de 25 mM itaconate pour normaliser la capacité respiratoire inutilisée (p = 0,082). Dans un (réplicats biologiques) étaient comme suit : non traité = 5 ; Citra 1 mM = 4; Citra 25 mM = 3; Ita 1 mM = 4; 25 mM Ita = 4. En bn étaient les suivants : non traité = 5 ; Citra 1 mM = 5; Citra 25 mM = 3; Ita 1 mM = 4; 25 mM Ita = 4. Les résultats en c sont calculés à partir de l'expérience illustrée en a et b et ont donc le même n que les traitements respectifs en a et b. Signifie ±SD ; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Valeurs P : * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. dh, courbes de sortie OCR qui forment la base des graphiques présentés dans ac. d, cellules non stimulées par rapport aux cellules stimulées par LPS/IFNγ. e, traitement au citraconate, cellules non stimulées. f, traitement au citraconate, cellules stimulées par le LPS/IFNγ. g, traitement Itaconate, cellules non stimulées. h, traitement Itaconate, cellules stimulées par LPS/IFNγ. Les résultats en dh sont calculés à partir de l'expérience illustrée en a et b et ont donc le même n que les traitements respectifs en a et b. Signifie ±ET. Valeurs P : * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. Abréviations : FCCP = cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone ; Oligo = oligomycine ; Pourriture = roténone ; AA = Antimycine A.

Fig. supplémentaires. 1 à 6 et tableaux 1 et 2.

Données sources de l'analyse des acides aminés LC-MS/MS concernant les données étendues Fig. 5 et les Figs supplémentaires. 3 et 4.

Données sources de l'analyse multiplexe des cytokines/chimiokines par microbilles relatives à la Fig. 2 et aux données étendues de la Fig. 6.

Transferts de données sources pour la Fig. 6b supplémentaire.

Images membranaires non recadrées d'immunoblots, Fig. 2a, j et k.

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Chen, F., Elgaher, WAM, Winterhoff, M. et al. Le citraconate inhibe la catalyse ACOD1 (IRG1), réduit les réponses d'interféron et le stress oxydatif, et module l'inflammation et le métabolisme cellulaire. Nat Metab 4, 534–546 (2022). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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Reçu : 20 mai 2021

Accepté : 20 avril 2022

Publié: 02 juin 2022

Date d'émission : mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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