Un nouveau système de virus inactivé (InViS) pour une évaluation rapide et peu coûteuse de la désintégration virale

Oct 23, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 11583 (2022) Citer cet article

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La pandémie de COVID-19 a suscité un intérêt considérable dans le monde entier pour les surfaces antivirales, et il y a eu une augmentation spectaculaire de la recherche et du développement de systèmes de matériaux innovants pour réduire la transmission du virus au cours des dernières années. Les normes 18 184 et 21 702 de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) sont deux méthodes standard pour caractériser les propriétés antivirales des surfaces poreuses et non poreuses. Cependant, au cours des dernières années de la pandémie, un besoin de caractérisation plus rapide et peu coûteuse du matériel antiviral a été identifié. Par conséquent, une méthode complémentaire basée sur un système de virus inactivé (InViS) a été développée pour faciliter le développement précoce de technologies antivirales et la surveillance de la qualité de la production de matériaux antiviraux de manière sûre et efficace. L'InViS est chargé d'un colorant fluorescent auto-éteint qui produit une augmentation mesurable de la fluorescence lorsque l'enveloppe virale se désintègre. Dans le présent travail, la sensibilité d'InViS à la désintégration virale par des agents antiviraux connus est démontrée et son potentiel pour caractériser de nouveaux matériaux et surfaces est exploré. Enfin, l'InViS est utilisé pour déterminer le sort des particules virales dans les couches des masques faciaux, ce qui en fait un outil intéressant pour soutenir le développement de systèmes de surface antiviraux pour des applications techniques et médicales.

Ce qui a commencé comme une maladie pulmonaire mystérieuse et inconnue à Wuhan en décembre 2019 s'est transformé en une grave pandémie similaire à la "grippe espagnole": COVID-19. Le déclencheur est le bêta-coronavirus SARS-CoV-2, qui est responsable de divers symptômes tels que l'inflammation de la gorge et des voies respiratoires, la toux, l'essoufflement, la fatigue, la fièvre, la myalgie, la conjonctivite, la perte de l'odorat et l'altération du goût. Dans les cas graves, elle peut entraîner une insuffisance pulmonaire aiguë, une défaillance multiviscérale et la mort1.

En juin 2022, le nombre de cas confirmés de COVID-19 dans le monde avait atteint 529 millions et le nombre de décès était passé à plus de 6 millions2. Bien que des vaccins efficaces et de meilleures stratégies de traitement aient été développés entre-temps, de nouvelles mutations hautement contagieuses et de faibles taux de vaccination dans les pays pauvres continuent de pousser les systèmes de santé à leurs limites. Par conséquent, les interventions non pharmaceutiques telles que la réduction des contacts, l'hygiène et les masques faciaux restent importantes pour empêcher la propagation du virus3.

L'objectif global de ces mesures est de ralentir la transmission des maladies entre les personnes. La COVID-19 se propage principalement par les gouttelettes respiratoires chez les personnes qui sont en contact étroit les unes avec les autres4. Cependant, d'autres mécanismes de transmission de la maladie sont également possibles. Par exemple, la transmission par aérosol peut se produire à l'intérieur dans des espaces surpeuplés et mal ventilés, et il est également possible d'attraper le COVID-19 indirectement en touchant des surfaces ou des objets contaminés par le virus de personnes infectées, puis en touchant les yeux, le nez ou la bouche (fomite transmission)4. Il a été démontré que le SARS-CoV-2 est stable de quelques heures à quelques jours selon la chimie de la surface sur laquelle le virus est déposé. Par exemple, van Doremalen et al. ont démontré que le SARS-CoV-2 restait stable sur les surfaces en plastique et en acier inoxydable pendant plusieurs heures. Le virus viable a pu être détecté jusqu'à 72 h après l'application sur ces surfaces, et la demi-vie du SARS-CoV-2 a été estimée à 5,6 h sur l'acier inoxydable et à 6,8 h sur le plastique5. En revanche, aucun virus viable n'a pu être détecté sur les surfaces en carton après 24 h, et les surfaces en cuivre avaient tendance à inactiver le virus dans les 4 heures5. Chin et al. ont confirmé que le SARS-CoV-2 est plus stable sur les surfaces lisses et hydrophobes. Alors qu'aucun virus infectieux n'a pu être récupéré à partir des papiers d'impression et de culture tissulaire après 3 h, un virus viable et infectieux était toujours présent sur les surfaces lisses traitées (verre et billets de banque) après 2 jours, sur l'acier inoxydable et le plastique après 4 jours et sur l'extérieur hydrophobe. couche d'un masque chirurgical après 7 jours6.

Étant donné que cette stabilité de surface élevée augmente le risque d'infection par frottis, il serait très bénéfique que les particules virales qui atteignent les surfaces vulnérables telles que les écrans tactiles, les poignées de porte, les filtres de ventilation, les textiles, les sièges de train ou les mains courantes puissent être inactivées immédiatement sans autre processus de désinfection. Il en va de même pour les particules virales déposées sur les masques faciaux, car la manipulation inappropriée des masques est un problème courant.

Par conséquent, le développement de matériaux antiviraux, de revêtements et de masques faciaux est d'une importance capitale non seulement pour lutter contre le COVID-19, mais également pour prévenir des épidémies ou des épidémies similaires à l'avenir.

Il existe plusieurs façons d'inactiver ou même de détruire les virus. Les plus connus sont les détergents ou les solutions d'éthanol qui désintègrent la structure lipidique et protéique du virus7,8,9,10, les rayonnements tels que la lumière ultraviolette avec une longueur d'onde comprise entre 200 et 300 nm (UVC)11,12,13, les traitements thermiques comme l'autoclavage14 ,15, oxydation16,17 ou charge de surface positive élevée18,19. Lorsque de nouveaux matériaux antiviraux sont développés, il est crucial d'étudier et de quantifier leur potentiel à piéger, inactiver et/ou tuer les virus. Actuellement, il existe deux normes ISO disponibles, qui réglementent la mesure de l'activité antivirale sur les plastiques et autres surfaces non poreuses (ISO 21702) et la détermination de l'activité antivirale des produits textiles (ISO 18184). Dans les deux normes, le titre de virus infectieux doit être déterminé soit par un test sur plaque, soit par la méthode de la dose infectieuse médiane de culture tissulaire (TCID50). Ces deux tests nécessitent de travailler avec le vrai virus infectieux et sont basés sur le principe que les effets cytopathiques causés par le virus peuvent être visiblement évalués in vitro. Bien que ces tests délivrent des résultats fiables et comparables sur l'activité antivirale des matériaux, ils présentent plusieurs inconvénients : travailler avec de vrais virus comme par exemple le SARS-CoV-2 nécessite une infrastructure particulière (par exemple des laboratoires équipés de niveau de biosécurité 3) et des employés formés. Cela empêche l'utilisation généralisée de ces analyses dans la plupart des environnements industriels et de recherche et retarde par conséquent le développement rapide de nouveaux matériaux antiviraux, comme observé pendant la pandémie actuelle de COVID. Par conséquent, de nouvelles méthodes de caractérisation sont nécessaires de toute urgence pour faciliter le pré-criblage rapide, bon marché et sûr d'un grand nombre de matériaux et de surfaces pour des propriétés antivirales potentielles.

Dans ce travail, un système de virus de la grippe A/Brisbane 59/2007 chargé d'octadécylrhodamine R18 inactivé (InViS) est exploité comme substitut d'un virus infectieux pour évaluer la désintégration virale par de simples mesures de fluorescence. Ce nouveau système viral permet d'étudier simplement les effets antiviraux de différents produits chimiques, agents de nettoyage et matériaux : la fluorescence augmente lorsque les particules virales se désintègrent, car la sonde fluorescente est auto-éteinte à l'intérieur de la structure lipidique intacte du virus (Fig. 1) .

InViS, une approche fluorescente pour détecter la désintégration de l'enveloppe virale causée par des matériaux antiviraux.

Dans cette étude, nous avons exploré et défini les domaines d'application, le pouvoir prédictif et les limites de ce nouvel InViS en tant que méthode de présélection alternative en analysant l'effet de produits chimiques antiviraux (70 % d'éthanol, acide citrique), différentes nanoparticules antivirales potentielles (NPs) et revêtements de surface. De plus, nous avons exploité l'utilisation d'InViS pour évaluer et quantifier le sort et la localisation des particules virales dans les couches du masque facial.

L'inactivation des virus et le chargement avec un colorant fluorescent20 sont des procédures établies appliquées dans la recherche sur les vaccins. Ici, nous explorons le potentiel d'un tel virus inactivé dans le domaine de la caractérisation antivirale. Le système de virus inactivé (InViS) utilisé dans ce travail consiste en une solution de virus de la grippe A/Brisbane/2007 marquée à l'octadécylrhodamine inactivée (R18), dont la fluorescence augmente lors de la rupture ou de la fusion de la membrane21.

La concentration virale mesurée était de 1,5 × 1013 (± 9,8 × 1010) particules mL−1 et les particules virales présentaient une taille très homogène de 110,6 ± 0,8 nm. L'étiquette fluorescente à l'intérieur du virus était auto-éteinte et la fluorescence du virus intact n'était que de 23% de celle après l'ajout du détergent octaéthylène glycol monododécyl éther (OEG) (Fig. 2A). Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont confirmé que le détergent endommageait les particules virales et conduisait à leur désintégration. Alors que le système InViS était monodispersé (indice de polydispersité (PdI) de 0,063 ± 0,023) avant l'administration du détergent, l'ajout d'OEG a donné un échantillon hautement polydispersé (PdI de 0,443 ± 0,048) avec des pics de plus en plus grands correspondant probablement à des fragments de virus, et structures virales agglomérées et micelles détergentes (Fig. 2B). Par conséquent, le système InViS pourrait être utilisé pour évaluer les propriétés de désintégration virale des produits chimiques et des matériaux par une lecture de fluorescence rapide et simple. La limite de détection (définie comme la concentration de particules à laquelle la désintégration virale n'est plus détectable par une augmentation de la fluorescence par rapport à la réponse de base de l'instrument) a été déterminée par des dilutions en série et était de 108 particules mL-1.

Effet de l'OEG sur InViS. (A) L'intensité de fluorescence d'InVis a été surveillée en continu pendant 300 s. Après 280 s, OEG a été ajouté à l'échantillon pour induire la désintégration virale et la libération du marqueur R18 fluorescent de la membrane virale. (B) Distribution granulométrique mesurée par DLS avant et après l'administration de détergent. L'InViS intact est hautement monodisperse. Au contact du détergent, le virus se désagrège, entraînant plusieurs populations d'agrégats résiduels et un indice de polydispersité plus élevé.

Pour vérifier qu'InViS n'est pas seulement sensible aux détergents, mais peut également détecter d'autres composés antiviraux connus avec une puissance antivirale différente, nous avons effectué d'autres expériences avec de l'éthanol à 70 % et de l'acide citrique (1 M). Les deux produits chimiques ont induit une augmentation significative de l'intensité du signal de fluorescence (Fig. 3). Cependant, l'agent antiviral doux acide citrique22 (pH 2,95) n'a induit qu'une libération partielle du marqueur R18, tandis qu'une libération presque complète similaire au contrôle détergent positif a été détectée lors de l'ajout d'éthanol à 70 %.

Intensité de fluorescence d'InViS après incubation avec de l'acide citrique (1 M) et de l'éthanol à 70 %. InViS dans du PBS et InViS traité avec OEG ont servi respectivement de contrôle négatif et positif. Les résultats représentent la moyenne et les écarts-types correspondants de trois expériences indépendantes avec deux répétitions chacune. $p < 0,01, £p < 0,001 par rapport aux témoins négatifs.

Différentes études ont montré que plusieurs NP dont l'oxyde de cuivre (CuO), l'oxyde de zinc (ZnO), le dioxyde de titane (TiO2), l'or (Au), l'argent (Ag), le sélénium (Se) et l'oxyde de graphène (GO) possèdent des propriétés antivirales23, 24,25,26,27,28,29, mais les mécanismes de toxicité sous-jacents ne sont souvent pas entièrement compris. Pour déterminer si les mécanismes antiviraux de ces types de NP peuvent inclure une désintégration virale, nous avons incubé l'InViS avec différentes concentrations de NP pendant 2 et 24 h et mesuré les intensités de fluorescence pour détecter la libération potentielle de l'étiquette fluorescente R18. Aucune des NP étudiées n'a été capable de détruire l'enveloppe InViS, car les niveaux de fluorescence n'ont pas augmenté et étaient comparables au contrôle négatif (InViS intact sans NP) (Fig. 4). À des concentrations croissantes de NP, il y avait même une diminution de l'intensité de fluorescence par rapport aux échantillons témoins non traités. Bien que les NP aient été éliminés par centrifugation avant les mesures de fluorescence pour éviter les réponses d'interférence potentielles, nous avons effectué d'autres études d'interférence, qui ont confirmé l'absence de signaux d'autofluorescence NP ou d'effets non spécifiques sur les mesures de fluorescence (données non présentées).

Intensité de fluorescence après incubation d'InViS avec des NP. Les suspensions de NP ont été incubées pendant 2 et 24 h avec une solution InViS et les suspensions ont ensuite été centrifugées pour éliminer les NP avant les mesures de fluorescence. Le contrôle négatif est InViS dans du PBS (0,4 % v/v) et le contrôle positif est InViS dans du PBS (0,4 % v/v) et OEG (1,25 mg mL-1). Les résultats représentent la moyenne et les écarts-types correspondants d'au moins trois expériences indépendantes avec deux répétitions techniques par expérience. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 et #p < 0,0001 par rapport au contrôle négatif.

Après avoir évalué le système InViS pour la détection des effets antiviraux des produits chimiques et des NP, nous avons en outre évalué son aptitude à détecter le potentiel antiviral des surfaces et des revêtements. Pour obtenir une surface antivirale plane et non poreuse, des plaques de culture cellulaire stériles ont été recouvertes d'une nouvelle solution de revêtement antiviral (numéro de brevet PCT/EP2021/06058030). L'InViS a été mis en contact avec la surface revêtue ou la forme liquide de la solution de revêtement et une augmentation significative de l'intensité de fluorescence a pu être détectée dans les deux cas (Fig. 5), indiquant clairement la désintégration de la capsule virale.

Intensité de fluorescence d'InViS après contact avec un revêtement antiviral. Les formes liquide et enrobée d'une solution d'enrobage antivirale (numéro de brevet PCT/EP2021/06058030) conduisent à une augmentation significative de la fluorescence, indiquant la désintégration de la capsule virale. Les niveaux de fluorescence de l'InViS intact dans du PBS et de l'InViS incubé avec de l'OEG ont servi de contrôle négatif et positif, respectivement. Les résultats représentent les écarts-types médians et correspondants de trois expériences indépendantes avec deux répétitions techniques. $p < 0,01 et £p < 0,001 par rapport au contrôle négatif.

Outre la détection de la désintégration du virus, nous avons émis l'hypothèse que le système InViS peut également être adapté pour détecter le sort et la localisation des particules virales dans les masques faciaux et les textiles multicouches, ce qui est une information très précieuse pour comprendre quelle(s) couche(s) doivent présenter une forte activité antivirale. Nous avons utilisé un système de test d'efficacité de filtration pour exposer les masques communautaires textiles, les masques chirurgicaux et les masques FFP2 (tel que défini dans la norme EN149, correspondant au respirateur N95 standard américain) à des aérosols contenant de l'InViS. À titre de comparaison, des tests d'efficacité de filtration ont également été effectués avec des solutions salines, ce qui représente la procédure standard européenne actuelle (EN13274-7) pour évaluer l'efficacité de filtration des textiles. Après les tests de filtration, les différentes couches de masque ont été décollées et la localisation des particules a été évaluée au microscope électronique à balayage (MEB) (sel et InViS ; masques communautaires textiles uniquement) et par des mesures de fluorescence (InViS uniquement ; tous les types de masques).

Des micrographies de la couche tissée externe (Fig. 6A, A ', B) et de la couche interne soufflée par fusion (Fig. 6C, C', D, D', F – H) d'un masque communautaire sont présentées avant et après les tests d'efficacité de filtration avec du sel ou des particules InViS. De plus, SEM d'InViS sur une grille TEM (Fig. 6E) a été inclus, pour faciliter l'identification des particules virales dans les couches de masque. Les particules d'InViS semblaient monodispersées avec une taille d'environ 100 nm, tandis que les cristaux de sel semblaient plus gros.

Localisation des particules NaCl et InViS dans les masques communautaires textiles après tests d'efficacité de filtration. Les micrographies après test d'efficacité de filtration avec NaCl montrent : (A) la couche tissée la plus externe d'un masque communautaire textile, (B) un pore de la couche tissée la plus externe après le test de filtration avec des particules de NaCl, (C) la couche de filtration interne soufflée par fusion et ( D) particules de sel filtrées par la couche de filtration interne soufflée à l'état fondu. (A'–D') représentent les grossissements du quadrant blanc dans (A–D) (sauf C' qui provient d'une autre zone non visible dans C). Les micrographies après le test d'efficacité de filtration avec InVIS montrent : (E) SEM imagé d'InViS sur le porte-échantillon de grille de microscope électronique à transmission (TEM), (F) et (G) la couche de filtration interne soufflée par fusion (les cristaux de sel et les particules InViS sont mis en évidence avec des têtes de flèche et flèches, respectivement). (H) est une fibre de référence de la couche interne soufflée à l'état fondu qui n'a pas subi d'expériences de filtration.

Au cours des expériences d'efficacité de filtration, l'air a d'abord traversé les pores de la couche tissée externe des masques, où une accumulation préférentielle de particules de sel à proximité des pores a été observée alors que la plupart des fibres de la couche externe étaient dépourvues de particules (Fig. 6B ,B'). Aucune particule d'InViS n'a été observée dans la couche tissée externe. Ensuite, l'air a atteint la couche interne soufflée par fusion, qui a montré une accumulation considérable de particules de sel (Fig. 6D) et d'InViS (Fig. 6F, G). Pour corroborer davantage la localisation préférentielle des particules InViS sur la couche interne soufflée par fusion de manière semi-quantitative, des mesures de fluorescence complémentaires ont été effectuées. Par conséquent, les différentes couches de masque ont été traitées avec de l'éthanol pour libérer la rhodamine de l'InViS adsorbé. L'intensité de fluorescence correspondant à chaque couche pour les masques chirurgicaux, textiles et FFP2 est illustrée à la Fig. 7A,B. Ce lavage a entraîné la désintégration d'InViS, mais a quand même permis la quantification des particules virales dans chaque couche car l'intensité de fluorescence est proportionnelle à la quantité de particules virales filtrées.

Intensité de fluorescence des différentes couches d'un masque textile, chirurgical (A) et FFP2 (B) après test d'efficacité de filtration avec InViS. Le flux d'air circulait de droite à gauche (de la couche externe à la couche interne). Le contrôle EtOH est la valeur de fluorescence de la solution d'éthanol uniquement. Les résultats représentent la moyenne et les écarts-types correspondants de trois expériences indépendantes avec deux répétitions techniques. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 et #p < 0,0001 par rapport aux témoins.

La grave pandémie de COVID-19 a radicalement changé la vie des gens au cours des 2,5 dernières années. Des choses qui étaient considérées comme allant de soi, comme un travail régulier au bureau, rencontrer des amis, assister à des événements culturels et voyager, n'étaient soudainement plus possibles. Les confinements ont forcé les gens du monde entier à rester chez eux et ont eu un impact négatif sur l'économie. Les systèmes de santé ont atteint leurs limites de capacité et de nombreuses personnes ont souffert ou sont même décédées d'une maladie grave. Pour lutter contre la pandémie, de nombreux chercheurs et cliniciens ont travaillé sous haute pression pour comprendre la maladie et développer des vaccins et des options de traitement efficaces. En parallèle, l'industrie textile a travaillé intensivement sur le développement de masques faciaux conviviaux, confortables et efficaces pour ralentir la transmission des maladies entre les personnes31.

Bientôt, il a été reconnu que le développement de matériaux et de surfaces antiviraux était reconnu comme un moyen efficace de ralentir la propagation du SRAS-CoV-2 et de prévenir les infections par contact direct. Cependant, le développement de matériaux antiviraux est un processus long et coûteux. L'un des principaux problèmes était que les propriétés antivirales des revêtements et des matériaux nouvellement développés ne pouvaient être évaluées qu'en effectuant des tests avec le vrai virus (ISO 21702 et ISO 18184). Cela nécessitait des employés formés et une infrastructure spéciale (par exemple des laboratoires équipés de niveau de biosécurité 3) qui étaient difficiles d'accès pour la plupart des développeurs de matériaux et retardaient considérablement le développement de matériaux antiviraux innovants.

Par conséquent, des méthodes de test alternatives qui sont peu coûteuses ainsi que faciles et sûres à manipuler sont très précieuses pour faciliter la présélection rapide de nouvelles conceptions de matériaux antiviraux afin de faire progresser l'innovation et d'identifier rapidement des candidats prometteurs pour des tests supplémentaires avec le vrai virus. Dans cette étude, nous présentons InViS, un nouveau système de virus alternatif qui permet une détection rapide, peu coûteuse et sûre de l'activité de désintégration virale des liquides, des composés et des matériaux par de simples mesures de fluorescence. Nous avons utilisé un virus Influenza A/Brisbane 59/2007 marqué à la rhodamine-18 inactivé qui présente des similitudes structurelles étroites avec le SRAS-CoV-2, à savoir constituant un virus à ARN enveloppé d'une taille d'environ 100 nm avec de l'hémagglutinine à sa surface. Le virus a été inactivé avec de la β-propiolactone, qui préserve la structure antigénique du virus, mais rend le virus non infectieux en raison de l'alkylation des bases d'acide nucléique, de la suppression de la réplication du génome, de l'induction de la dégradation du génome et de la réticulation des protéines et du génome32. La caractéristique la plus intéressante d'InViS est que la sonde fluorescente est auto-éteinte dans la membrane virale. En conséquence, la fluorescence d'InViS augmente de manière significative lorsque les particules virales se désintègrent et libèrent le colorant fluorescent.

On sait que l'éthanol peut désintégrer les particules virales par dissolution de la membrane lipidique et dénaturation des protéines33,34,35. De même, un pH bas peut entraîner une dégradation de la membrane36,37,38. Par conséquent, nous avons exposé InViS à 70 % d'éthanol et d'acide citrique pour tester sa sensibilité aux liquides antiviraux connus. En effet, les deux produits chimiques ont conduit à une augmentation significative de la fluorescence. Lorsque les particules InViS étaient en contact avec la solution d'éthanol, une désintégration virale complète s'est produite dans les 5 minutes. Dans le cas de la solution d'acide citrique, la désintégration virale est restée partielle, indiquant que le système InViS peut fournir des données (semi-)quantitatives sur la désintégration du virus.

Étant donné que certaines NP peuvent avoir des propriétés antivirales, elles sont largement explorées pour le développement de nouveaux matériaux et revêtements antimicrobiens16,23,39. Par conséquent, nous avons cherché à savoir si les NP d'Ag, Au, CuO, ZnO, TiO2 et d'oxyde de graphène étaient capables de désintégrer InViS. Bien que des effets antiviraux aient été décrits pour les types de NP étudiés, aucun des NP testés n'a induit la désintégration de l'enveloppe virale, même lors d'une exposition prolongée jusqu'à 24 h. Nous avons même observé une légère diminution des signaux de fluorescence avec l'augmentation des concentrations de NP, ce qui pourrait être dû à l'adsorption des particules et/ou à la pénétration de la surface de la capsule virale et à l'élimination ultérieure de l'échantillon liquide lors de l'étape de centrifugation. Cela serait conforme aux résultats publiés par Kim et al., où une co-précipitation des NP Au et du virus Influenza A pendant la centrifugation a été rapportée24.

Ces résultats pour les NP sont cohérents avec la littérature existante, qui suggère que les activités antivirales de la plupart des NP semblent reposer sur d'autres effets que la désintégration de la capsule. Par exemple, il a été démontré que les NP Ag se lient ou dénaturent la protéine de capside virale ou empêchent le virus de se lier aux récepteurs cellulaires, empêchant ainsi l'entrée du virus dans les cellules hôtes23. Les NP contenant du Cu pourraient catalyser la génération de radicaux via des réactions de type Fenton ou Fenton, oxydant les protéines de la capside et par conséquent bloquant l'infection virale à un stade précoce23. Il a été démontré que les AuNP oxydent les liaisons disulfure de la glycoprotéine hémagglutinine à la surface virale, provoquant son inactivation et empêchant ainsi la fusion membranaire du virus avec les cellules hôtes23. Les NP de TiO2 peuvent endommager les lipides et les glycoprotéines de l'enveloppe virale40. Les nanofeuilles de graphène ont pu interrompre les interactions protéine-protéine hydrophobes et l'oxyde de graphène a pu adsorber les particules virales, empêchant ainsi leur interaction avec la membrane cellulaire.

Avec cette connaissance, la plus grande limitation de notre système InViS devient évidente : la dissolution de la membrane n'est pas la seule méthode d'inactivation et, par conséquent, tous les matériaux antiviraux ne peuvent pas être caractérisés à l'aide d'InViS. Néanmoins, de nombreux matériaux antiviraux reposent sur la désintégration de l'enveloppe virale. L'objectif de l'InViS n'est pas de remplacer les tests ISO existants et homologués. Il a plutôt été conçu pour offrir une alternative simple, peu coûteuse et sûre pour évaluer la désintégration virale (qui empêche le développement potentiel d'une résistance) à un stade précoce de la recherche et du développement. Le système est particulièrement intéressant pour les chercheurs et industriels qui souhaitent évaluer l'efficacité de matériaux destinés à désintégrer l'enveloppe lipidique. Au cours de cette étude, nous avons évalué une telle solution de revêtement antiviral (numéro de brevet PCT/EP2021/06058030) avec InViS. Nous rapportons une forte augmentation de la fluorescence et confirmons que la solution de revêtement a bien entraîné une désintégration virale. Ces tests rapides peuvent être très bénéfiques dans le développement de liquides et de revêtements antiviraux. Par exemple, ils permettent le criblage d'un grand nombre de substances, compositions et concentrations différentes afin d'identifier la solution la plus prometteuse pour un développement ultérieur.

De plus, l'InViS peut être utilisé pour détecter le devenir et la localisation des NP dans les structures multicouches, les textiles et les masques faciaux. Nous avons introduit InViS dans un système d'efficacité de filtration, où les performances de différents types de masques faciaux ont été évaluées. Cela a permis l'utilisation d'aérosols contenant des particules virales biologiquement pertinentes au lieu de substances prescrites par les normes telles que le sel ou l'huile. En raison de la présence mixte de cristaux de sel et de particules virales, il n'a pas été possible de mesurer l'efficacité de filtration directement à partir de l'aérosol viral à l'aide de l'analyseur de particules. Néanmoins, nous avons obtenu des informations importantes concernant l'accumulation de particules virales dans les différentes couches de masque et la pertinence d'utiliser des particules de NaCl comme modèle pour les particules virales. L'imagerie par MEB des différentes couches a révélé que les particules de sel et de virus s'accumulaient préférentiellement dans la couche interne soufflée par fusion, suggérant que les aérosols de NaCl pourraient être représentatifs des particules virales malgré leurs caractéristiques différentes en termes de taille et de forme. Néanmoins, une adaptation du banc d'efficacité de filtration pourrait être mise en place pour réaliser des tests d'efficacité de filtration avec InViS. Il serait intéressant de quantifier l'efficacité de filtration en collectant les particules virales résiduelles ayant traversé les masques et filtres testés, par exemple avec un barboteur qui permet de collecter les particules virales restantes dans une solution liquide. En comparant la fluorescence résiduelle d'échantillons de masque avec des échantillons vierges, des variations d'efficacité de filtration peuvent être détectées. Cela permettrait une évaluation de l'efficacité de filtration des masques faciaux utilisant des particules virales et nous rapprocherait de la détermination des propriétés de filtration des systèmes de filtration médicaux et techniques contre de vrais virus dans un scénario d'exposition plus pertinent.

En conclusion, nous rapportons le développement d'une nouvelle méthode évaluant les composés antiviraux potentiels et les surfaces avec un système de virus inactivé (InViS) pour une évaluation rapide, peu coûteuse et sûre de la désintégration du virus par de simples mesures de fluorescence. InViS peut également être utilisé pour étudier le devenir et la localisation des particules virales sur des matériaux non poreux et poreux tels que les textiles techniques et médicaux, ce qui en fait un outil précieux pour soutenir le développement de nouveaux matériaux, revêtements et masques antiviraux.

Une solution de virus de la grippe monovalent A/Brisbane/59/2007 (H1N1) chimiquement inactivée et purifiée au grade GMP a été obtenue auprès de Seqirus (Melbourne, Australie) hémagglutinine (HA) (1,6 mg mL-1) déterminée par dosage d'immunodiffusion radiale unique, SRID. Le perchlorate d'ester octadécylique de rhodamine B (R18) a été acheté chez Merck KGaA (Pays-Bas) et dissous dans de l'éthanol anhydre de qualité HLPC à une concentration finale de 10 mM. Une solution R18 (40 µL) a été ajoutée à une solution grippale (1 mL) goutte à goutte à température ambiante (TA) sous agitation continue à 200 tr/min pendant 15 min. Le R18 non incorporé a été éliminé par séparation sur une colonne Sephadex G50 (Merck KGaA). La fraction de volume de vide a été collectée et caractérisée davantage.

La taille, la distribution et la concentration des particules ont été analysées par analyse de suivi des nanoparticules sur un instrument Malvern NanoSight LM10. L'échantillon a été dilué au 1:10 000 dans du tampon HNE (HEPES (10 mM) pH 7,4, NaCl (142,5 mM), EDTA (5 mM), filtré à travers un filtre seringue de 0,1 µm avant utilisation) et injecté dans la chambre d'analyse du 405 Module laser nm avec un flux constant de 70 unités à une température contrôlée de 25 °C et un réglage de viscosité de 0,975–0976 Cp. 5 captures ont été réalisées, chaque capture ayant une durée de 60 s. Le réglage de la caméra était de niveau 15 avec un seuil de détection de 3. La fluorescence R18 et l'activité de fusion ont été déterminées pour confirmer l'extinction de la fluorescence et la présence de HA à la surface du virus comme décrit20,41. Pour la fusion des virosomes de la grippe avec des fantômes d'érythrocytes, le milieu a été acidifié à pH 4,5. La fluorescence R18 a été mesurée en continu à des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 560 et 590 nm, respectivement. Pour l'étalonnage de l'échelle de fluorescence dans les expériences de fusion, la fluorescence initiale des membranes marquées a été fixée à zéro et la fluorescence à une dilution de sonde infinie à 100 %. Cette dernière valeur a été obtenue après addition d'OEG (Merck KGaA, Pays-Bas, concentration finale 1 mM). Pour confirmer que le virus est resté intact après l'expédition, des mesures DLS ont été effectuées pour déterminer le diamètre hydrodynamique des particules virales et leur indice de polydispersité dans du PBS avant et après l'ajout de l'OEG (Zetasizer Nanoseries, Nano-ZS90, Malvern, Worcestershire, Royaume-Uni , 1,25 mgmL-1). De plus, des mesures de fluorescence du virus dilué en série avec et sans OEG (1,25 mg mL-1, 5 min de temps d'incubation) ont été effectuées avec un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer pour établir la limite de détection.

De l'éthanol à 70 % (CAS 64-17-5) et de l'acide citrique (1 M ; CAS : 77-92-9) ont été incubés avec InVis (0,4 % v/v). Les échantillons ont été homogénéisés avec un mélangeur vortex et incubés pendant 5 min à température ambiante. Les mesures de fluorescence ont été réalisées à l'aide d'un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer. La longueur d'onde d'excitation était de 560 nm et les spectres d'émission ont été mesurés entre 580 et 650 nm. Une solution InViS dans du PBS (0,4 % v/v) a été utilisée comme contrôle négatif pour fournir l'intensité de fluorescence du virus intact. Comme contrôle positif, OEG (CAS : 3055-98-9 ; 2,5 % v/v) a été ajouté pour désintégrer le virus et indiquer l'intensité de fluorescence correspondante.

Pour étudier les effets antiviraux potentiels des NP, nous avons utilisé des particules qui ont été utilisées et entièrement caractérisées dans des études précédentes. Les propriétés les plus pertinentes des particules sont résumées dans le tableau 1.

Les particules disponibles sous forme de suspensions (Ag-COONa, Au-5-COONa) ont été diluées avec de l'eau ultrapure jusqu'à une suspension mère de 1 mg mL-1 et homogénéisées à l'aide d'un mélangeur vortex (1 min). Les particules disponibles sous forme de poudre (CuO, oxyde de graphène, TiO2 et ZnO) ont été mises en suspension dans de l'eau ultrapure jusqu'à une suspension mère de 1 mg mL−1 à l'aide d'un sonicateur à sonde fonctionnant à 230 V/50 Hz (Branson Sonifier 250, Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA, diamètre de sonde de 6,5 mm, amplitude crête à crête maximale de 247 μm) pendant 5 min à 13 W.

Différentes concentrations de particules (0,1, 1, 10 et 100 µg mL−1) ont été incubées avec une solution d'InViS dans du PBS (0,4 % v/v ; concentration stock d'InVis : 1,5 * 1013 particules mL−1) pendant 2 et 24 h . L'incubation a été réalisée à TA dans l'obscurité et sous agitation continue. Les suspensions ont été centrifugées pendant 10 min à 4500 xg pour éliminer les NPs. La fluorescence des surnageants a été mesurée avec un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer. Pour quantifier l'effet antiviral, la fluorescence a été comparée à la fluorescence d'une suspension virale dans du PBS (contrôle négatif) et d'une suspension virale traitée à l'OEG (1,25 mg mL-1 ; contrôle positif où toute la Rhodamine doit être libérée). Pour exclure l'autofluorescence ou l'extinction de la fluorescence des NP, la fluorescence des suspensions de NP pures (sans virus) et la fluorescence des NP incubées avec le virus et le détergent ont également été mesurées.

Une solution antivirale [numéro de brevet : PCT/EP2021/06058030] a été utilisée pour créer un revêtement antiviral. Dans un premier temps, les propriétés antivirales de la forme liquide ont été caractérisées par une incubation de 5 min avec une solution InViS (0,4% v/v) et des mesures de fluorescence. Pour caractériser les propriétés de la forme enrobée, un volume de 0,5 ml a été réparti uniformément dans des boîtes de Pétri jetables et incubé à température ambiante pendant 24 h. La norme ISO 21 702, qui couvre la caractérisation antivirale des matériaux non poreux, a été utilisée comme ligne directrice pour la préparation des échantillons. L'inoculum de virus, 0,4 mL pour chaque échantillon, était composé d'une solution mère InViS à 20 % v/v dans du PBS. Un inoculum avec InViS (20 % v/v) dans du PBS et un inoculum avec InViS dans du PBS (20 % v/v) et OEG (62,5 mg mL-1) dans des boîtes de Pétri vides ont été utilisés comme contrôle négatif et positif, respectivement . Un film de polymère inerte (polyéthylène basse densité (LDPE)) (40 mm × 40 mm) a été utilisé pour recouvrir l'inoculum. Le film a été doucement pressé pour former une structure en sandwich et maximiser la surface de contact entre l'inoculum et l'échantillon antiviral, tout en empêchant les fuites au-delà des bords du film inerte. Les échantillons ont été stockés pendant 24 h dans l'obscurité à TA. 20 ml de PBS ont été ajoutés à la boîte de Pétri et les boîtes ont été agitées pour assurer l'homogénéisation du PBS fraîchement ajouté et de l'inoculum restant. Après mélange, 2 ml du lavage ont été collectés et pipetés dans des cuvettes transparentes. Les spectres de fluorescence d'émission du lessivage ont été caractérisés à l'aide du Horiba FluoroMax SpectraFluorometer. La longueur d'onde d'excitation a été fixée à 560 nm et l'intensité d'émission a été mesurée entre 580 et 650 nm. Pour chaque échantillon, deux répétitions ont été analysées.

Pour évaluer le devenir et la localisation de l'InViS et des particules de sel dans les masques faciaux, la configuration d'efficacité de filtration présentée à la Fig. 8 a été utilisée. Grâce à l'utilisation d'un système de pompe, un débit d'air constant de 8 L min−1 a été généré à travers l'échantillon (basé sur EN13274-7), imitant le volume respiratoire humain lors d'un effort physique léger tout en maintenant une humidité relative dans l'aérosol final de 30 –40% à température ambiante. Une pièce circulaire d'un masque facial a été montée dans un porte-échantillon à l'intérieur d'une petite chambre de confinement et les particules diffusant à travers l'échantillon ont été quantifiées en temps réel à l'aide d'un analyseur de particules (Cambustion DMS500). Une solution d'InViS dans de l'eau ultrapure (1011 particules mL−1) ou du NaCl [2 g mL−1, concentration en aérosol entre 4 et 12 mgm−3 et taille médiane des particules entre 60 et 100 nm] a été introduite dans le générateur d'aérosol (AGK 2000 Palas). Comme la solution mère de virus était composée de virus dans du PBS, la solution aérosol contenait 1 % v/v de PBS. Par conséquent, non seulement InViS, mais également des résidus de PBS étaient présents dans l'aérosol.

Description schématique du banc d'efficacité de filtration. Le virus ou la solution de NaCl a été placé dans le générateur d'aérosol. Un flux d'air constant contenant des particules virales ou de sel a été généré à travers l'échantillon sur la base de la norme DIN 14683. La distribution granulométrique a été mesurée dans l'analyseur de particules.

Après des expériences d'efficacité de filtration, les couches de masque ont été décollées et analysées séparément pour localiser les particules InViS. Tout d'abord, des images de microscopie électronique à balayage (SEM) des couches interne et externe ont fourni une analyse qualitative de la présence de particules sur les fibres du masque. Pour cela, un SEM Hitachi S-4800 (Hitachi High-Technologies, Canada) a été utilisé. Avant l'imagerie, les couches de masque ont été montées sur des talons SEM avec un ruban de carbone double face conducteur et une pulvérisation recouverte de 7 nm d'or/palladium (LEICA EM ACE600) pour réduire les effets de charge des électrons. Les réglages pour l'imagerie SEM étaient une tension d'accélération de 2 kV et un flux de courant de 10 µA. Deuxièmement, la quantité de virus sur chaque couche a été évaluée par des mesures de fluorescence. Pour cela, les différentes couches de masque ont été placées dans 8 mL d'éthanol à 70% pendant une durée de 2h. Ensuite, 2 ml de la solution ont été pipetés dans des cuvettes transparentes et des mesures de fluorescence ont été effectuées avec un Horiba FluoroMax SpectraFluorometer (longueur d'onde d'excitation 560 nm, spectres d'émission entre 580 et 650 nm).

R a été utilisé pour les chiffres et les calculs statistiques. Les différences statistiques ont été évaluées à l'aide du test t de Student et les symboles suivants représentent les valeurs p correspondantes : *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 et #p < 0,0001.

Les données à l'appui de cette étude sont fournies sur demande raisonnable aux auteurs correspondants.

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Empa, Laboratoire fédéral suisse pour la science et la technologie des matériaux, Laboratoire pour les interactions particules-biologie, 9014, Saint-Gall, Suisse

Lea A. Furer, Pietro Clement, Tina Buerki-Thurnherr et Peter Wick

Empa, Laboratoire fédéral suisse pour la science et la technologie des matériaux, Laboratoire pour les membranes et textiles biomimétiques, 9014, Saint-Gall, Suisse

Gordon Herwig et René M. Rossi

Mymetics BV, 2333 CH, Leyde, Pays-Bas

Farien Bhoelan & Toon Stegmann

Mymetics SA, 1066, Epalinges, Suisse

Mario Amacker

Département de médecine pulmonaire, Hôpital universitaire de Berne, Université de Berne, 3012, Berne, Suisse

Toon Stegmann

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Correspondance avec Peter Wick.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Reçu : 25 avril 2022

Accepté : 24 juin 2022

Publié: 08 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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