Hydrogel

Jan 11, 2024

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17781 (2022) Citer cet article

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Les dispositifs microfluidiques qui combinent un environnement de matrice extracellulaire, des cellules et une perfusion physiologiquement pertinente sont avantageux en tant que plates-formes de culture cellulaire. Nous avons développé une plate-forme de culture cellulaire microfluidique à base d'hydrogel en chargeant des cellules de glioblastome U87 encapsulées dans un hydrogel de polyéthylène glycol (PEG) dans des puits recouverts d'une membrane dans du polydiméthylsiloxane (PDMS). Le système de culture cellulaire microfluidique multicouche combine des caractéristiques de conception précédemment signalées dans une configuration qui charge et perfuse de manière biomimétique un réseau 2D de chambres de culture cellulaire. Une dimension du réseau est alimentée par un générateur de gradient de concentration microfluidique (MCGG) tandis que la dimension orthogonale fournit des canaux de chargement qui remplissent des rangées de chambres de culture cellulaire dans une couche séparée. Contrairement aux mélangeurs MCGG arborescents typiques, une dilution en série fractionnaire de 1, ½, ¼ et 0 de la concentration initiale de soluté est obtenue en adaptant les largeurs de microcanaux d'entrée. Les hydrogels sont chargés de manière efficace et reproductible dans tous les puits et les cellules sont uniformément réparties dans l'hydrogel, maintenant > 90 % de viabilité jusqu'à 4 jours. Dans un test de dépistage de médicaments, la diffusion du témozolomide et de la carmustine dans les cellules U87 encapsulées dans un hydrogel à partir de la solution de perfusion est mesurée et des courbes dose-réponse sont générées, démontrant leur utilité en tant que mime in vitro du microenvironnement du glioblastome.

Près de 97 % des médicaments développés pour les interventions en oncologie échouent au cours des essais cliniques en raison du recours à des modèles de médicaments inadéquats, en particulier des modèles de culture cellulaire bidimensionnels (2D) in vitro1. Bien que les modèles de culture cellulaire 2D in vitro soient pratiques à utiliser, ils ne représentent pas correctement le microenvironnement complexe de la tumeur car le comportement cellulaire est affecté par la morphologie plate du plastique rigide et planaire généralement utilisé2,3. Pour répondre aux préoccupations concernant les modèles de culture cellulaire 2D, il y a eu une évolution vers des modèles de culture de cellules cancéreuses tridimensionnelles (3D) en tant qu'imitateurs plus physiologiquement pertinents du microenvironnement tumoral4. Dans l'ensemble, les modèles de tumeurs 3D peuvent prendre de nombreuses formes, telles que des sphéroïdes, des organoïdes ou des cultures et co-cultures matricielles pour n'en nommer que quelques-unes5,6. Pour ajouter de la complexité et améliorer la pertinence physiologique, les modèles de tumeurs 3D peuvent être combinés avec des dispositifs microfluidiques pour permettre la perfusion ou imiter la vascularisation7. Les systèmes microfluidiques qui combinent des cellules, une matrice extracellulaire et une perfusion sont de bons imitateurs du microenvironnement tumoral in vivo et sont peu coûteux et reproductibles, permettent l'utilisation de petits volumes de culture et ont une conception contrôlable qui peut être optimisée pour une application souhaitée8, 9. Les systèmes de culture cellulaire basés sur la perfusion fournissent des nutriments aux cellules et éliminent les déchets métaboliques de manière à imiter le transport de masse in vivo et à maintenir les facteurs solubles près des concentrations biologiques10. De plus, des gradients temporels et spatiaux peuvent être générés dans les systèmes microfluidiques, augmentant encore leur valeur en tant que plateformes de criblage de médicaments8. Cependant, la conception et l'exploitation d'un système de perfusion microfluidique robuste pour la culture 3D de cellules de mammifères adhérentes est un défi3. Les défis peuvent être liés à la conception de l'appareil, comme le choix de la configuration de culture appropriée, des matériaux ou de la fabrication du réseau microfluidique, ou purement techniques, comme la stérilisation, l'ensemencement cellulaire dans l'appareil, l'optimisation du transport de masse et des contraintes de cisaillement du flux pour maximiser la viabilité cellulaire, et éviter les bulles d'air dans les canaux de perfusion.

Des mélangeurs à gradient ont été développés pour les systèmes microfluidiques qui peuvent être utilisés pour fournir un mélange sur puce afin de fournir des concentrations discrètes de facteurs solubles aux systèmes de culture cellulaire qui peuvent être utilisés pour maintenir les cellules, différencier les cellules souches ou répondre à diverses questions biologiques11. Beaucoup de ces mélangeurs microfluidiques utilisent des structures arborescentes avec plusieurs étapes qui nécessitent un mélange complet avant la fin de chaque étape8,12,13, similaire à la conception utilisée ici. La formation de gradient sur puce élimine la possibilité d'erreurs de pipetage, diminue les risques de contamination et permet moins d'entrées microfluidiques qui simplifient la configuration par rapport aux dispositifs microfluidiques avec des gradients générés de manière externe14,15.

Reconnaissant la pertinence physiologique accrue des systèmes de culture cellulaire 3D de perfusion, un nombre croissant de recherches s'est concentré sur les dispositifs de culture cellulaire microfluidique pour les applications de dépistage de médicaments en mettant l'accent sur les modèles de tissus hépatiques et cancéreux16,17. Par exemple, des modèles de sphéroïdes tumoraux ont été cultivés dans des micropuits de culture cellulaire connectés à un générateur de gradient de concentration dans des puces microfluidiques et utilisés dans des applications de dépistage de médicaments18,19. Ces systèmes 3D n'incorporaient pas de mime de matrice extracellulaire et s'appuyaient sur la capture cellulaire pour remplir les chambres de culture cellulaire. Utilisant une conception intelligente, un réseau de cellules microfluidiques 3D incorporait à la fois des cellules cancéreuses et des cellules endothéliales pour émuler l'environnement tumoral7. La couche inférieure avait des microchambres avec des cellules cancéreuses incorporées dans l'hydrogel, séparées d'une couche supérieure de microcanaux de cellules endothéliales à travers une membrane perméable avec des pores groupés, et le dispositif n'incluait pas de générateur de gradient de concentration. Les auteurs ont ensuite comparé les réponses aux médicaments dans leur système aux réponses aux médicaments dans une culture 3D statique et ont noté une réponse retardée peut-être due à l'endothélium formé dans les microcanaux supérieurs, servant de barrière à la pénétration des médicaments. Un autre dispositif microfluidique basé sur la force capillaire pour la culture cellulaire 2D et 3D incorporant des couches de cellules endothéliales et cancéreuses a été développé pour des applications de dépistage de médicaments, où un gradient pourrait être généré sans avoir besoin d'équipement spécialisé20. Toh et al. ont développé une puce de matrice de cellules microfluidiques 3D pour tester l'hépatotoxicité des médicaments, où les hépatocytes ont été cultivés et exposés à des doses de médicaments en gradient21. Le microenvironnement 3D a été généré par coacervation de collagène et de terpolymère et maintenu avec un réseau de micropiliers. Dans l'ensemble, les dispositifs de culture cellulaire microfluidique peuvent combiner plusieurs fonctionnalités utiles telles qu'un imitateur de matrice extracellulaire, des cellules et des co-cultures cellulaires, une perfusion physiologiquement pertinente, des chambres de culture cellulaire multiplexées et des générateurs de gradient de concentration ou de dilution, ce qui les rend attrayants pour des applications telles que les médicaments. dépistage22.

Ici, nous décrivons un dispositif microfluidique conçu pour les cultures cellulaires 3D à base d'hydrogel et présentons son utilité avec deux matrices d'hydrogel différentes et construisons des courbes dose-réponse avec deux agents chimiothérapeutiques. Le réseau 2D de chambres de culture cellulaire est perfusé par un MCGG en forme d'arbre qui crée une dilution fractionnée en série qui fournit des taux de dilution de 1, ½, ¼ et 0. Les cellules et la solution de précurseur de gel sont facilement chargées dans l'appareil et les hydrogels forme après photoinitiation ou addition de type Michael sans occlusion des canaux de perfusion ni accumulation de pression pouvant affecter la viabilité cellulaire. À l'aide de ce système microfluidique, nous avons cultivé des cellules de glioblastome dans des hydrogels à base de polyéthylène glycol (PEG) 3D et mesuré l'administration de médicaments par perfusion et la viabilité cellulaire après traitement au témozolomide (TMZ) et à la carmustine (BCNU).

Le kit d'élastomère de silicone Sylgard™ 184 (appelé polydiméthylsiloxane ou PDMS) a été obtenu auprès de Dow Silicones Corporation (Midland, MI). Les filtres à membrane en polyester (PETE) (transparents, taille de pores de 0,2 um, épaisseur de 12 um, 2e6 pores/cm2) provenaient de Sterlitech Corporation (Kent, WA). Les lames de verre ordinaire pré-nettoyées de 75 mm × 50 mm × 1 mm provenaient de Corning Incorporated (Corning, NY). Les tubulures en polyéthylène (PE) INTRAMEDIC (ID 1,40 mm, OD 1,90 mm ; et ID 1,14 mm, OD 1,57 mm) provenaient de Clay Adams. Les tranches de silicium (SI) provenaient de University Wafer Inc (Boston, MA). Le photorésist SU-8 2025 et le révélateur SU-8 (acétate de 1-méthoxy-2-propyle à 98–100 %) provenaient de Kayaku Advanced Materials Inc (Westborough, MA). La feuille MIL PRF 131k Classe 1, de 150 µm d'épaisseur (MarvelSeal® 470) provenait de Berry Global (Evansville, IN). Le cadre A1, un film polymère mince (film imperméable à l'eau pour jet d'encre A4) provenait de CisInks (South El Monte, CA). Le diacrylate de polyéthylène glycol (PEGDA; 5 kDA), le poly(éthylène glycol)-acrylate à 4 bras (PEG-Ac à 4 bras; 10 kDa) et le poly(éthylène glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3,4 kDa) provenaient de Laysan Bio Inc. (arabe, AL). Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 X, pH 7,4), du bleu Trypan (0,4 %), des billes de polystyrène fluorescentes (Fluoro-Max™ Fluorescent Red, 542/612 nm, d = 2 µm) et du témozolomide (TMZ) provenaient de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Irgacure 2959 provenait de la société BASF (Florham Park, NJ). Le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline/streptomycine (P/S) provenaient de Hyclone (Logan, UT). Le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 et 0,05 % de trypsine/0,02 % d'acide éthylènedinitrilotétraacétique (EDTA) provenaient de Coring (Coring, NY). L'acridine orange (AO) et la carmustine (BCNU) provenaient de Millipore Sigma (St Louis, MO). L'iodure de propidium (PI) provenait de MP Biomedical LLC (Solon, OH). La coloration cellulaire au perchlorate de 3,3'-dioctafécyloxacarbocyanine (DiOC) provenait de Life Technologies (Carlsbad, CA). Le bleu brillant FCF (numéro CAS : 3844-45-9) a été acheté sous forme de colorant alimentaire bleu dans une épicerie locale. Les cellules U87 de glioblastome cérébral d'Homo sapiens provenaient de l'ATCC (Manassas, VA). Glycine–Arginine–Cystéine–Acide aspartique–Arginine–Glycine–Acide aspartique–Sérine (GRCD-RGDS), Glycine–Arginine–Cystéine–Acide aspartique–Arginine–Glycine–Acide aspartique–Sérine–FITC (GRCD-RGDS-FITC), et les peptides acide aspartique-arginine-cystéine-glycine-valine-proline-méthionine-sérine-méthionine-arginine-glycine-cystéine-arginine-acide aspartique (DRCG-VPMSMR-GCRD) provenaient de Genic Bio (Shanghai, Chine).

Le dispositif microfluidique a été fabriqué en assemblant une lame de microscope en verre de support (75 mm × 50 mm × 1 mm), deux couches de PDMS à motifs (couche de perfusion supérieure et couche inférieure de chambres de culture cellulaire avec canaux de chargement cellulaire), seize membranes PETE (coiffage les seize micropuits de culture cellulaire) et trois tubes - deux tubes d'entrée (tube PE ; ID 1,14 mm, OD 1,57 mm) et un tube de sortie (tube PE ; ID 1,40 mm, OD 1,90 mm) (Fig. 1, Fig. S1). La couche de perfusion supérieure avait une épaisseur de 3 mm et la couche inférieure des micropuits de culture cellulaire avait une épaisseur de 250 µm. La hauteur des canaux de perfusion et de chargement des cellules était de 50 µm. Une profondeur de puits de 250 µm a été choisie pour être plus grande qu'une cellule individuelle tout en permettant l'imagerie à travers l'ensemble de l'échantillon. La plupart des canaux de perfusion avaient une largeur de 150 µm avec les principales exceptions de 50 µm et 75 µm, qui ont été incorporées dans la conception pour obtenir des séries de dilutions fractionnées. Ces canaux de dilution fractionnée ont été utilisés pour produire un gradient de concentration de 100 %, 50 %, 25 % et 0 % de la concentration initiale du soluté. Les canaux de chargement des cellules sur la couche inférieure avaient également une largeur de 150 µm.

Conception de dispositifs microfluidiques. (A) Photo du dispositif microfluidique avec le tube d'entrée (côté gauche de l'image) et de sortie (côté droit de l'image). La barre d'échelle noire représente 1 cm. (B) Largeurs de canal des microcanaux et les dilutions de concentration générées avec ces largeurs de canal. (C) Vue latérale des dispositifs microfluidiques fabriqués affichant les tubes d'entrée (à gauche), les chambres de mélange (rouge), les chambres de culture cellulaire (vert) et le tube de sortie (à droite).

Les couches PDMS supérieure et inférieure ont été fabriquées via le durcissement du précurseur PDMS sur des maîtres Si à motifs (fabriqués par la procédure de photolithographie standard SU-8 2025 : https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4-3 .pdf) à 75 °C pendant la nuit. En bref, une résine photosensible SU-8 2025 de 50 µm d'épaisseur a été enduite par centrifugation sur une tranche de Si à 1700 tr/min (spinner SP-100, BidTec) et cuite doucement sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 3 min, puis à 95 °C pendant 9 min. Les motifs sur les masques pré-imprimés ont été transférés sur la couche de résine photosensible par rayonnement UV (160 mJ/cm2 avec Flood Exposure Model 60, ABM-USA, Inc., San Josa, Californie, USA), post-exposition cuite (sur un plaque chauffante à 65 ° C pendant 6 min, puis à 95 ° C pendant 7 min) et développé par un processus standard illustré à la Fig. S2 supplémentaire. Le rayonnement UV a réticulé le SU-8 exposé et le révélateur SU-8 a dissous le SU-8 non réticulé, ne laissant que les motifs SU-8 réticulés.

La couche PDMS de culture cellulaire inférieure a été préparée de la même manière avec une modification pour contrôler l'épaisseur (Fig. S3 supplémentaire). Pour obtenir une épaisseur de 250 µm pour la couche inférieure de PDMS, un espaceur de cadre en aluminium de 150 µm a été utilisé. Après avoir versé le précurseur PDMS sur le maître Si et le cadre Al, un film polymère mince et une lame de verre rigide ont été placés sur le dessus. Le film polymère flexible a été ajouté pour éviter le contact du précurseur PDMS et de la lame de verre, sinon la lame de verre rigide ne pourrait pas être retirée après le durcissement du PDMS. Un poids de 5 livres a été ajouté sur le dessus pour assurer une épaisseur uniforme de la couche de PDMS, et le PDMS a été durci à 80 ° C pendant la nuit. L'épaisseur a été mesurée par un profilomètre Alpha-Step IQ (KLA-TENCOR Alpha D500, KLA Corp., Milpitas, Californie, USA). Notez que la couche de PDMS était plus épaisse que l'entretoise car tout le PDMS en excès n'a pas été extrudé à travers les bords avant la polymérisation en raison de la viscosité élevée du précurseur de PDMS.

Une fois les couches de PDMS durcies, 16 chambres cellulaires (ID de 2 mm), 2 entrées (ID de 1,5 mm) et 1 sortie (ID de 2 mm) ont été coupées avec des poinçons de biopsie. Seize membranes PETE circulaires (taille des pores 0,2 µm), coupées avec un poinçon de biopsie de 3 mm de diamètre, ont été placées individuellement sur chacun des micropuits de culture cellulaire ID de 2 mm pour séparer les deux couches de PDMS et empêcher les cellules et le matériel dans les chambres de culture de s'échapper dans les canaux de perfusion. Des morceaux de membrane individuels ont été choisis par opposition à une seule pièce pour permettre une meilleure adhérence entre les deux couches de PDMS (couches supérieure et inférieure de l'appareil), pour éviter les fuites et pour assurer la stabilité dans le temps. Les pièces individuelles empêchent également la diaphonie entre les puits, ce qui pourrait se produire avec une couche de membrane monobloc. Les membranes de 3 mm de diamètre sont légèrement plus grandes que les puits ID de 2 mm, de sorte que les bords des membranes entrent en contact avec les surfaces lisses du PDMS, y adhèrent spontanément et restent stables pendant le plasma d'oxygène et l'alignement suivants. Un dispositif de traitement corona de laboratoire (modèle BD-20AC, Electro-Technic Products, Chicago, IL, USA) a ensuite été utilisé pour traiter les deux surfaces PDMS avec du plasma pendant 1 min pour les oxyder. Les deux couches de PDMS ont été alignées avec quatre marques d'enregistrement sur les coins à l'œil nu. Après que les deux couches de PDMS ont été pressées ensemble avec des membranes PETE entre les deux, les surfaces de la lame de verre et l'assemblage de PDMS ont été encore oxydés avec du plasma pendant 1 min pour améliorer la fixation. Les entrées et les tubes de sortie ont été insérés dans les entrées et les emplacements de sortie et scellés avec du PDMS non durci. Les appareils ont été chauffés à 75 ° C pendant au moins 2 h pour améliorer l'étanchéité et durcir le PDMS. Un schéma détaillé de l'assemblage du dispositif est illustré à la Fig. S4 supplémentaire.

Pour la perfusion, les fluides de perfusion ont été placés dans des seringues de 3 ml dans une pompe à double seringue (New Era Pump Systems Inc, Farmingdale, NY) afin que les entrées des deux côtés des mélangeurs aient le même débit. Les seringues ont été connectées aux orifices d'entrée du dispositif avec des aiguilles (21 G) et des tubulures (tubulure PE ID 1,14 mm, OD 1,57 mm). Les débits volumétriques testés étaient de 1, 1,5, 2, 5 et 10 µL/min. Pour étudier l'efficacité du mélange, une solution de Brilliant Blue FCF (pour faciliter la visualisation) a été dissoute dans du PBS pour une concentration finale de 25 μM (mesurée selon la loi de Beer-Lambert)23 et utilisée en combinaison avec du PBS ordinaire pour déterminer la performance du micromélangeurs. À l'aide d'un microscope inversé (Zeiss, Axiovert 200 M, Oberkochen Allemagne) à un grossissement de 5X, des images ont été capturées dans trois régions - entrée, milieu et sortie - des micromélangeurs pendant la perfusion (Fig. 2B). Le logiciel ImageJ24 a ensuite été utilisé pour séparer les canaux RVB et mesurer l'intensité du canal RVB bleu dans les micromélangeurs (en fonction de la largeur du micromélangeur) à l'aide de la fonction « Plot Profile ». Les valeurs ont été normalisées de 0 à 1 pour chaque ensemble d'images, une valeur de gris de 1 étant attribuée à la couleur bleue et une valeur de gris de 0 attribuée à la couleur de fond de la puce microfluidique. L'indice de mélange absolu (AMI) a été calculé comme suit :

où Ii est l'intensité locale des pixels, < I > est l'intensité moyenne des pixels dans la section transversale et NI le nombre total de pixels25.

Mise en place du chargement et de la perfusion. (A) Schéma du chargement de la solution de précurseur d'hydrogel dans les micropuits à membrane de la couche de chargement inférieure de l'appareil via les orifices de chargement à l'aide d'une aiguille à insuline. (B) Schéma de l'installation de perfusion dans laquelle le tube relie les seringues de 3 ml contenant les fluides de perfusion aux orifices d'entrée du dispositif microfluidique. Les cercles rouges indiquent où les images ont été prises dans le micromélangeur pour l'analyse de mélange (entrée, milieu et sortie). Les cercles bleus indiquent où les images ont été prises à la fin du micromélangeur pour l'analyse du gradient de concentration.

De plus, pour déterminer le gradient de concentration généré par le dispositif microfluidique aux débits volumétriques définis, des images ont également été capturées à la fin de chaque micromélangeur et le logiciel ImageJ a ensuite été utilisé pour comparer l'intensité moyenne du colorant produit par les micromélangeurs.

Modélisant les molécules sous forme de sphères dures, nous avons utilisé l'équation de Stokes-Einstein pour calculer le coefficient de diffusion des molécules :

où D est le coefficient de diffusion, \(k\) est la constante de Boltzmann, \(\mu\) est la viscosité dynamique de l'eau à 37 °C et \(r\) est le rayon hydrodynamique de la particule. En supposant que le volume moléculaire de la particule correspond à une forme sphérique, le rayon hydrodynamique de chaque molécule a été calculé comme suit :

où MW est le poids moléculaire de la particule (fourni par la Royal Society of Chemistry), NA est le nombre d'Avogadro et \(\rho\) est la densité de la particule (fournie par la Royal Society of Chemistry). Le temps nécessaire à une molécule pour diffuser sur toute la largeur du canal a ensuite été calculé comme suit :

où \(t\) est le temps nécessaire à la diffusion et \(x\) est la distance de diffusion.

Des cellules de glioblastome humain U87 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS et de 1 % de P/S et incubées dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2. Les cellules ont été passées par une exposition de 5 min à la trypsine/EDTA une fois qu'une confluence d'environ 80 % a été atteinte, et le milieu a été changé tous les 2 jours. Les passages cellulaires 10 à 20 ont été utilisés pour les expériences. Les cellules ont été cultivées avec du DiOC (20 μM) pendant 24 h pour colorer toutes les cellules avant toute autre expérimentation.

Des hydrogels PEGDA non dégradables et non adhésifs ont été préparés par photopolymérisation UV. En bref, pour préparer une solution mère du photoinitiateur, 1 % w/v Irgacure 2959 a été dissous dans de l'eau déminéralisée (eau DI), soniqué (Branson, modèle #2800, 40 kHz) pendant 90 min et stocké à température ambiante, à l'abri de la lumière jusqu'à 2 semaines. Une solution de précurseur d'hydrogel PEGDA (250 µL) de 20 % p/v et 0,1 % p/v dans Irgacure a été préparée dans du PBS et vortexée pendant 30 s pour assurer un mélange complet. La solution de précurseur d'hydrogel a été chargée dans les micropuits de culture cellulaire du dispositif microfluidique à travers les orifices de chargement à l'aide d'une aiguille à insuline (Fig. 2A). Chaque micropuits contenait environ 0,2 µL de la solution de précurseur d'hydrogel ; par conséquent, 3,14 µL de solution ont été nécessaires pour remplir les 16 micropuits. La quantité excessive de solution de précurseur était nécessaire pour s'assurer que la solution atteignait les micropuits au lieu de rester dans les canaux de chargement. Des canaux de décharge ont été incorporés dans la conception de la couche de chargement du dispositif pour permettre à la solution de précurseur en excès de sortir du dispositif au lieu de pousser contre la membrane coiffant les micropuits. Les hydrogels ont ensuite été polymérisés sous lampe UV (4,81 mW cm2, 1 W, 365 nm ; lampe de banc UV Blak-Ray® XX-15L, UVP, Upland, CA) pendant 10 min26. Ces gels sont appelés PEGDA partout.

Des hydrogels PEG-Ac à 4 bras dégradables et adhésifs ont été préparés par addition de type Michael. Tout d'abord, le PEG-RGDS à 4 bras a été préparé selon un protocole précédemment développé27. Nous avons modifié en moyenne l'un des groupes acrylate de chaque PEG-Ac à 4 bras avec RGDS (efficacité de modification de 80 %) et stocké le produit lyophilisé sous argon dans un récipient desséché à - 20 ° C pendant 6 mois maximum. Des hydrogels ont ensuite été formés à l'aide d'un mélange de PEG-Ac à 4 bras et de PEG-RGDS à 4 bras (0,8 mM dans RGDS) et d'un mélange de réticulant 50:50 de PEG-diSH et d'un réticulant peptidique dégradable par voie enzymatique DRCG-VPMS ↑ MR- GCRD. Pour tous les gels, des solutions mères à 20 % p/v de PEG-Ac à 4 bras, de PEG-diSH et de PEG-RGDS à 4 bras ont été préparées dans du tampon TEA pH 8 immédiatement avant utilisation. Les solutions mères ont été mélangées et l'agent de réticulation peptidique a été ajouté sous forme de poudre pour donner une solution de précurseur d'hydrogel avec un rapport molaire acrylate sur thiol de 1: 1 et une concentration finale en polymère de 10% p/v et une concentration finale en agent de réticulation peptidique de 7, 8 mM. La solution de précurseur d'hydrogel a été mélangée par pipetage pendant 30 s, injectée dans le dispositif microfluidique comme décrit ci-dessus et laissée gélifier pendant 20 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2. Ces gels sont appelés PEG-Ac à 4 bras.

Pour évaluer la reproductibilité de l'hydrogel et du chargement cellulaire dans les micropuits de culture cellulaire du dispositif microfluidique, des cellules U87 colorées au DiOC ont été ajoutées à la solution de précurseur d'hydrogel PEGDA à 106 cellules/mL. La solution de précurseur a ensuite été chargée dans les micropuits à l'aide d'une aiguille à insuline et gélifiée sous UV comme décrit ci-dessus. Des images de chaque puits ont été prises à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé et ImageJ a été utilisé pour compter le nombre d'ells dans chaque puits. La distribution des cellules marquées par fluorescence dans l'hydrogel a été imagée à l'aide d'un microscope confocal (Leica Confocal SP8, Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL) à un grossissement × 10 et traitée à l'aide du logiciel Fiji (téléchargement gratuit http://fiji.sc) . Pour l'imagerie confocale, l'hydrogel a également été rendu fluorescent en incorporant de manière covalente un peptide GRCD-RGDS-FITC fluorescent comme nous l'avons décrit précédemment27.

Une solution de précurseur d'hydrogel contenant 20 % p/v de PEGDA, 0,1 % v/v d'Irgacure et 106 cellules/mL (cellules U87 colorées au DiOC) a été injectée et polymérisée dans les micropuits de culture cellulaire du dispositif microfluidique comme décrit ci-dessus pour préparer les non- hydrogels PEGDA dégradables et non adhésifs. Immédiatement après la gélification, le milieu RPMI additionné de 10 % de FBS et de 1 % de P/S a été perfusé à travers le dispositif pendant 48 h. À 48 h, le milieu de perfusion a été remplacé par un milieu supplémenté contenant 0, 2 μg / ml de PI (coloration des noyaux de cellules mortes) dans les deux entrées et 2 mM TMZ ou 10 μM BCNU dans une entrée et perfusé à travers le dispositif pendant 48 h. De même, des hydrogels PEG-Ac à 4 bras dégradables et adhésifs contenant 106 cellules / ml de cellules U87 colorées au DiOC ont été préparés comme décrit ci-dessus, cultivés pendant 48 h et exposés au TMZ pendant 48 h. Les cellules encapsulées ont été imagées à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé Axiovert 200 M à un grossissement × 10. La viabilité cellulaire a été calculée comme suit :

où NL représente le nombre de cellules vivantes et ND représente le nombre de cellules mortes.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS ; microscope à fluorescence Zeiss LSM 510, Zeiss, Allemagne) a été utilisée pour mesurer la diffusivité in situ d'un fluorophore modèle (Atto 655) dans une dalle d'hydrogel PEGDA à 20 % p/v. Des hydrogels ont été formés comme décrit ci-dessus, avec la modification que Atto 655 (0,5 nM) a été ajouté aux solutions de précurseur d'hydrogel. Pour les mesures de FCS, des hydrogels (150 µL) ont été préparés dans une lamelle couvre-objet à 8 chambres avec un fond de borosilicate allemand #1. Les hydrogels ont ensuite été trempés pendant une nuit dans un milieu DMEM sans rouge de phénol et contenant 0, 5 nM d'Atto 655 pour éviter la diffusion axée sur la concentration d'Atto 655 de l'hydrogel dans le milieu environnant. Atto 655 (0,5 nM) dans de l'eau désionisée a également été utilisé pour calibrer le volume confocal de l'instrument FCS. Un laser pulsé de 633 nm ps a été utilisé pour six mesures de 300 s pour chaque emplacement d'échantillon. Une fonction d'autocorrélation G(τ) a été obtenue pour chaque mesure :

où N est le nombre de particules fluorescentes, p = ro/zo est une constante instrumentale, ro est le rayon et zo est la longueur axiale du faisceau laser focalisé, τd est le temps de diffusion du soluté, T est l'amplitude de l'état triplet, et τT est la durée de vie du triplet. La fonction d'autocorrélation a été ajustée à l'aide d'un modèle triplet pour tenir compte de l'excitation possible des états moléculaires triplet à des intensités laser plus élevées. Enfin, la fonction d'autocorrélation a été normalisée comme suit :

où G(τD) est la valeur de l'Eq. (6) à chaque instant et G(τ0) est la valeur de l'Eq. (6) au moment initial. Le coefficient de diffusion efficace du traceur pour chaque protéine en solution a été calculé à partir de τD comme :

En supposant que les diffusivités de TMZ et d'Atto 655 étaient similaires en raison de leurs poids moléculaires relativement similaires (194 g/mol et 887 g/mol, respectivement), nous avons ensuite modélisé la concentration anticipée de TMZ dans les gels en fonction de la profondeur et du temps du gel. La concentration de TMZ a été calculée via la deuxième loi de diffusion de Fick pour la géométrie 1-D (une dalle mince) avec les conditions aux limites suivantes : c(x = 0) = 2 mM TMZ et c(x = ∞) = 0 mM TMZ à t = 0 h, où c est la concentration de TMZ, x est l'emplacement du gel et t est le temps :

Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes (± SD) déterminées à partir de 3 à 4 expériences indépendantes. L'analyse statistique pour l'analyse du gradient de concentration et la reproductibilité du chargement a été réalisée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec les tests de comparaison multiple de Holm – Sidak ou Dunn à l'aide de GraphPad Prism 6®. L'analyse statistique de la pente du profil d'intensité par rapport au débit volumétrique a été réalisée à l'aide d'une analyse de régression linéaire à l'aide de GraphPad Prism 6®. Un p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Ici, nous avons conçu un dispositif microfluidique qui nous a permis de charger des cellules encapsulées dans un hydrogel dans des micropuits de culture cellulaire recouverts d'une membrane pour être perfusés avec des fluides contenant les biomolécules souhaitées ou des médicaments de concentrations variables (Fig. 1, Fig. S1 supplémentaire). Le dispositif a une combinaison de plusieurs caractéristiques qui en font un bon choix pour la culture cellulaire de perfusion à base d'hydrogel 3D : (i) il s'agit d'une structure fermée avec des canaux de chargement cellulaire ; (ii) il existe un réseau 2D de chambres de culture cellulaire coiffées d'une membrane pour empêcher la contamination ou l'échappement de cellules dans les couches de perfusion ; (iii) les cellules sont chargées dans un hydrogel pour la culture cellulaire 3D biomimétique ; (iv) la conception inversée permet une imagerie par le bas ; et (v) le MCGG utilise la largeur du canal par opposition à la longueur pour faire varier les rapports de mélange.

Le dispositif microfluidique a été construit avec du PDMS, qui est couramment utilisé dans les applications microfluidiques car il est simple à fabriquer, inerte, non cytotoxique, perméable aux gaz et adapté à l'imagerie par fluorescence3,28,29. Fait important pour notre conception, le PDMS est une plainte et a permis l'utilisation d'une aiguille à insuline pour charger les cellules et les gels dans les micropuits. Le système microfluidique se composait de deux couches de canaux microfluidiques, séparées par des membranes pour sceller les canaux inférieurs de chargement des cellules. La couche de perfusion supérieure (Figs. 1, 2B) contient les micromélangeurs serpentins menant aux canaux de perfusion qui fournissent un écoulement sur la membrane pour alimenter les cellules dans les chambres de culture ci-dessous. Les micromélangeurs à deux étages ont des largeurs de canal d'alimentation de 150/75/150/150 μm en amont du premier étage et de 150/50/150/50/150 μm en amont du deuxième étage pour produire la série de dilutions à concentration fractionnaire de 1:½ :¼:0 (Fig. 1B). Les canaux de perfusion adressent fluidiquement les chambres de culture cellulaire en parallèle pour éviter la diaphonie. L'appareil offre un fonctionnement stable sur plusieurs jours, consomme < 1,5 mL/jour et perfuse les cellules avec du milieu frais pour éviter la cytotoxicité. Au débit volumétrique de 1 μL/min, la vitesse linéaire est d'environ 1,1 mm/s dans le canal d'alimentation vers la couche de perfusion au-dessus de la chambre de culture cellulaire, ce qui est similaire au débit in vivo à travers les capillaires30. Par exemple, Giulitti et al. ont démontré que si la perfusion est trop lente (par exemple 0,6 µL/h), les cellules en aval peuvent subir une cytotoxicité due à la distribution hétérogène des nutriments (concentration plus élevée en amont) et des déchets (concentration plus élevée en aval)31. Des débits plus élevés (par exemple 30 à 60 μL/h, similaires au 1 μL/min utilisé dans cette étude) entraînent une culture cellulaire plus homogène dans l'ensemble du dispositif microfluidique. Selon la conception de l'appareil, des débits trop élevés (par exemple 40 μL/min) pourraient également entraîner un mélange incomplet ou une cytotoxicité induite par la contrainte de cisaillement32.

Des microcanaux pour charger les cellules dans les chambres de culture ont été incorporés dans la couche inférieure. Chaque rangée de chambres de culture cellulaire est chargée à partir d'une seule entrée. Si la même solution contenant des cellules est chargée dans chaque entrée, quatre répliques biologiques sont créées comme effectué dans cette étude. Le chargement est le plus cohérent lorsque chaque chambre de culture cellulaire a la même longueur de passage du microcanal (la somme de la longueur du canal de l'entrée au micropuits et du micropuits à la sortie) pour permettre aux micropuits d'être remplis en parallèle simultanément ( figure 2A). Les canaux de chaque micropuits de culture cellulaire à la sortie ont agi comme un canal de décharge d'échantillon pour faciliter le processus de chargement et réduire la pression requise lors du chargement de la solution de précurseur d'hydrogel dans les micropuits. Les canaux de secours empêchent les cellules encapsulées dans l'hydrogel de s'échapper dans la couche de perfusion et de bloquer la perfusion lors de la gélification sous une pression de charge excessive. Chaque puits de culture cellulaire était recouvert d'une membrane PETE (taille des pores de 0,2 µm), qui permettait l'échange de nutriments et de déchets entre les cellules et les fluides de perfusion, mais restreignait les grosses particules, les bactéries et les cellules, garantissant qu'aucune contamination ne pouvait se produire en raison de la perfusion. Enfin, les cellules contenues dans la matrice de gel ont été protégées de la contrainte de cisaillement hydrodynamique des fluides de perfusion en circulation pour une meilleure récapitulation du système in vivo. L'emplacement des chambres de culture par rapport au flux de perfusion est important car les cellules situées directement dans le trajet d'écoulement sont soumises à une contrainte de cisaillement hydrodynamique, qui peut affecter la morphologie cellulaire, l'organisation du cytosquelette, la prolifération, les voies de signalisation cellulaire et les gènes et protéines. expression3.

Ici, contrairement à un MCGG typique, une dilution en série fractionnée est obtenue en faisant varier les largeurs des canaux d'alimentation. Les mélangeurs à base de diffusion ont une vitesse maximale à laquelle un mélange complet est obtenu, par conséquent, la variation de la largeur des canaux d'alimentation par opposition à la longueur permet une structure de mélange plus compacte. Auparavant, un paramètre non dimensionnel a été créé pour déterminer la longueur de mélangeur requise pour diverses géométries33. La vitesse maximale pour le mélange de gradient est mesurée expérimentalement à l'aide d'un microscope dans nos canaux serpentins à coin carré de 18,5 mm de long, comme indiqué sur la figure 2B. Les images qui mesurent le mélange à l'entrée, au milieu et à la fin du canal à des débits de 1, 5 et 10 μL/min sont présentées (Fig. 3A). Au total, cinq débits volumétriques (1, 1,5, 2, 5 et 10 µL/min) ont été utilisés pour déterminer l'étendue du mélange à la sortie du canal de mélange. Le mélange complet est indiqué par une concentration de solution homogène sur toute la largeur du microcanal, ce qui donne une pente de zéro pour un tracé d'intensité en fonction de la distance. Sur la figure 3B, un AMI de 0 indique un mélange complet. À un débit de 1 μL/min, la valeur AMI calculée était de 0,012 à un débit de 1 μL/min. À des débits plus élevés, l'AMI a augmenté, indiquant un mélange incomplet, où l'ampleur du mélange diminue à mesure que le débit augmente. Globalement, le mélange est linéairement dépendant du débit volumétrique (R2 = 0,93). Compte tenu de cette longueur de mélange fixe sur l'appareil, la dépendance du mélange sur le débit a été mesurée pour assurer un mélange adéquat à 1 μL/min, comme illustré à la Fig. 3B.

Efficacité du mélange. (A) Images de microscopie représentatives montrant la progression du mélange de PBS et de Brilliant Blue FCF dans du PBS à l'entrée, au milieu et à la sortie des régions d'intérêt dans les canaux de mélange à 10, 5, 2, 1,5 et 1 µL/min. (B) La pente du profil d'intensité pour indiquer l'efficacité de mélange à la région de sortie du canal de mélange en fonction du débit volumétrique de perfusion. Indice de mélange absolu calculé (AMI) à la région de sortie du canal de mélange en fonction du débit volumétrique de perfusion. Une valeur AMI de zéro indique un mélange complet.

Étant donné que le mélange dépend de la diffusion, on s'attend à ce que l'efficacité du mélange en fonction du débit dépende de la taille de la molécule, où MW et la taille déterminent la diffusivité moléculaire34. Nous avons utilisé le Brilliant Blue FCF, qui a un poids moléculaire (MW) de 792,9 g/mol pour caractériser le mélange, qui est plus grand que la plupart des agents chimiothérapeutiques, comme indiqué dans le tableau 1. Le mélange complet du Brilliant Blue FCF dissous dans du PBS a été réalisé à 1 µL/min et le temps nécessaire à la diffusion était de 34,0 s. Le coefficient de diffusion et le temps requis pour la diffusion sur toute la largeur du canal ont également été calculés pour plusieurs agents chimiothérapeutiques approuvés par la FDA : témozolomide, paclitaxel, doxorubicine, carmustine et lomustine. Par exemple, selon nos calculs, le témozolomide, qui a un diamètre plus petit et une diffusivité plus élevée que le Brilliant Blue FCF, diffuserait sur la largeur du canal presque 2 fois plus vite. Ce résultat implique qu'un débit volumétrique supérieur à 1 µL/min pourrait encore conduire à un mélange complet. D'autre part, le paclitaxel, qui est similaire en taille et en diffusivité au Brilliant Blue FCF, devrait nécessiter un temps similaire pour diffuser sur toute la largeur du canal (31,2 s). Par conséquent, un débit volumétrique de 1 µL/min doit être utilisé pour obtenir un mélange complet. Dans l'ensemble, étant donné que toutes les molécules considérées étaient plus petites que le Brilliant Blue FCF utilisé, nous prévoyons que le débit volumétrique physiologique de 1 µL/min serait suffisant pour obtenir un mélange complet pour la plupart des expériences visant à produire une dilution de concentration de petites molécules, telles que les produits chimiothérapeutiques. .

Les concentrations générées par le MCGG ont été mesurées en perfusant 25 μM de Brilliant Blue FCF dans du PBS dans « l'entrée 100 % » et du PBS dans « l'entrée 0 % » à 1 µL/min (Fig. 4A), ce qui a produit des concentrations de 100 % : 51 % : 26 % : 0 % (Fig. 4B), similaire à la dilution attendue de 100 %, 50 %, 25 % et 0 %. Les fractions de dilution ont été interpolées en utilisant les intensités des microcanaux 100 % et 0 % avant la séparation (Fig. 4C). L'intensité dans le canal A (le plus proche de l'entrée contenant du bleu brillant FCF dans du PBS) a été réglée sur 100 %, tandis que l'entrée contenant du PBS (canal D) a été réglée sur 0 %. La dilution de concentration générée expérimentalement était comme la dilution de concentration théorique prévue (Fig. 1B), avec une valeur R2 de 0,99, démontrant en outre que le mélange complet des deux fluides de perfusion a été obtenu à 1 µL/min.

Génération dégradée. (A) Schéma indiquant les canaux A–D, où le gradient de concentration généré a été mesuré. (B) Concentrations mesurées à un débit de 1 µL/min, où le canal A contient 100 % de la concentration initiale de Brilliant Blue FCF et le canal D contient 0 % de Brilliant Blue FCF. (C) Images représentatives du gradient de concentration dans chaque canal à un débit de 1 µL/min.

La reproductibilité de chargement des hydrogels dans les micropuits, ainsi que la similitude de chargement dans tous les puits de l'appareil ont été caractérisées. Le chargement constant des cellules est facilité par la conception à flux continu des canaux de chargement. La densité numérique des cellules et leur emplacement doivent être stochastiques, le bruit de tir étant la principale source de variabilité de chargement sans source de biais systématique. Avec la conception à écoulement continu des canaux de chargement, la concentration des cellules doit être la même que dans la solution originale mélangée de manière homogène en l'absence d'accumulation ou d'épuisement des cellules. Pour mesurer la reproductibilité du chargement, des hydrogels PEGDA avec des cellules colorées au DiOC encapsulées ont été chargés dans les micropuits à l'aide d'une aiguille à insuline, puis exposés à la lumière UV pour la gélification. Comme les quatre micropuits d'une colonne ont été chargés simultanément (Fig. 5A), la densité moyenne des cellules dans les puits d'une colonne a été comparée (Fig. 5B). Nos résultats indiquent que la reproductibilité de chargement était similaire entre les 4 colonnes car il n'y avait pas de différence significative dans la densité cellulaire médiane pour chaque colonne (Fig. 5C).

Reproductibilité du chargement des cellules. (A) Dispositif schématique des ports et des canaux de chargement et des micropuits de culture cellulaire, où chaque colonne de chambres de culture cellulaire est codée par couleur, en commençant par la colonne 1 en bleu. (B) Images fluorescentes des chambres de culture cellulaire chargées d'hydrogels avec des cellules U87 piégées colorées avec DiOC. Barre d'échelle = 200 µm. (C) Densité des cellules dans les micropuits de culture cellulaire de chaque colonne. (D) Images du bas, d'un tiers, des deux tiers et du haut d'un hydrogel lorsqu'il est chargé dans un micropuits de culture cellulaire. Les hydrogels sont marqués avec une fluorescence verte via la fixation de ligands modifiés par FITC au PEG-Ac à 4 bras. Barre d'échelle = 500 µm.

Dans une expérience distincte, nous avons utilisé du PEG fluorescent (vert) chargé de billes fluorescentes rouges, pour déterminer si l'hydrogel occupait l'ensemble du puits de manière uniforme et si les billes étaient uniformément réparties sur toute la profondeur de l'hydrogel. Les images capturées sur toute la profondeur du puits ont indiqué que l'hydrogel remplissait les micropuits et que les perles fluorescentes restaient bien réparties dans l'ensemble de l'hydrogel (Fig. 5D). Cependant, le gel vert apparaît non polymérisé près de la paroi PDMS et de la membrane, qui sont des régions à forte exposition à l'oxygène pendant la polymérisation. Il est connu que l'oxygène inhibe la polymérisation UV35 et qu'il a une concentration élevée en PDMS36. De plus, de petites molécules hydrophobes telles que le photoinitiateur utilisé ici se diffusent facilement dans le PDMS, épuisant éventuellement leur concentration dans la solution de précurseur de gel, ce qui pourrait également expliquer le « halo » observé à proximité des parois du PDMS. Cette forme de structure d'hydrogel augmente la surface à travers laquelle l'échange de soluté peut se produire mais ne modifie pas la quantité totale de soluté qui peut être échangée, qui est déterminée par le débit volumétrique à travers la couche de perfusion. En fonction de l'application exacte, cette forme d'hydrogel peut être bénéfique ou préjudiciable. Les travaux futurs étudieront les méthodes pour abaisser la concentration d'oxygène dans le PDMS avant la polymérisation en utilisant des méthodes non cytotoxiques. Nous avons développé des méthodes pour polymériser complètement les bouchons d'hydrogel dans les microcanaux PDMS mais n'avons pas testé la cytotoxicité de ce protocole. Notez que lorsqu'un gel PEG-Ac à 4 bras, qui polymérise via une addition de type Michael, a été chargé dans les puits de culture cellulaire, il s'est complètement polymérisé, y compris à proximité immédiate des parois du PDMS (Fig. S5 supplémentaire) car la polymérisation via L'addition de type Michael n'est pas affectée par l'oxygène et ne dépend pas d'un initiateur de petite molécule. Ces données ont également montré qu'une variété de matrices d'hydrogel peut être logée avec le dispositif actuel.

Un défi des cellules de chargement dans les dispositifs microfluidiques en général consiste à éliminer les bulles d'air qui peuvent être piégées dans les micropuits pendant le chargement. Pour éviter les bulles d'air, d'autres ont d'abord rempli le système d'eau puis l'ont dégazé38. Nous avons choisi de charger le dispositif à sec (non pré-rempli d'eau) pour éliminer la dilution de la solution de précurseur de gel avec de l'eau. Les bulles d'air sont un phénomène courant dans les dispositifs microfluidiques39,40. Bien que nous montrons que dans notre système, les bulles n'ont pas eu d'impact négatif sur la viabilité cellulaire (voir Fig. S7 supplémentaire), elles pourraient créer des différences entre les chambres de culture cellulaire répliquées. Une amélioration qui pourrait être envisagée à l'avenir consisterait à modifier la géométrie des microcanaux à l'intérieur du dispositif39 pour supprimer l'angle vif entre les canaux de chargement et les réservoirs. Les angles vifs actuels présents à la fois dans les couches de chargement et de perfusion pourraient piéger l'air, car l'angle de l'angle est inférieur à celui de l'angle de contact du liquide de remplissage, créant une situation de mouillabilité inférieure.

Tout d'abord, nous avons déterminé le temps qu'il faudrait pour qu'une petite molécule (par exemple chimiothérapeutique) soit perfusée pour diffuser dans l'hydrogel et atteindre la même concentration que le canal de perfusion. Pour mesurer cette diffusion, nous avons utilisé un fluorophore Atto 655 (887 g/mol) pour modéliser la diffusivité d'une petite molécule médicamenteuse comme le TMZ (194 g/mol) ou le BCNU (214 g/mol), ce qui nous a permis de mesurer la diffusion coefficient in situ et en temps réel à l'aide de FCS (Fig. S6 supplémentaire). Les coefficients de diffusion du fluorophore Atto 655 dans les milieux, ainsi que dans les hydrogels PEGDA ont été mesurés respectivement à 4,25 × 10–6 et 2,55 × 10–6 cm2/s. Comme prévu, le coefficient de diffusion dans les milieux était significativement plus élevé que celui dans l'hydrogel, ce qui pourrait s'expliquer par une obstruction physique, comme nous l'avons montré précédemment41. Avec les coefficients de diffusion mesurés, nous avons ensuite utilisé la loi de diffusion de Fick pour déterminer si TMZ ou BCNU étaient capables de pénétrer l'hydrogel et combien de temps il faudrait pour que les médicaments atteignent la concentration souhaitée à l'intérieur du gel. Nous avons modélisé la concentration de TMZ (à une concentration initiale de 2 mM) et la concentration de BCNU (à une concentration initiale de 10 µM) en fonction du temps (jusqu'à 48 h) à une profondeur d'hydrogel de 250 µm (l'épaisseur du gel à l'intérieur du micropuits). La concentration de médicament s'est avérée > 1,9 mM en 1 h et > 1,95 mM en 4 h après l'ajout de TMZ et > 9,5 µM en 1 h après l'ajout de BCNU, ce qui indique que pendant 48 h d'exposition, toutes les cellules doivent être également exposées aux deux médicaments .

Nous avons ensuite testé la sensibilité des cellules U87 à deux médicaments différents, à savoir TMZ et BCNU, dans deux hydrogels PEG différents. Le TMZ est la norme de soins actuelle et le BCNU est utilisé comme adjuvant ou en association avec le TMZ. Les deux médicaments sont approuvés pour le traitement du glioblastome et tous deux sont des agents alkylants connus pour induire l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose42. Les deux gels étaient le PEGDA et le gel PEG-Ac à 4 bras modifié par RGD, dégradable par voie enzymatique. Le gel PEGDA, formé par photopolymérisation UV, est non dégradable et inerte, les cellules ne devraient donc pas interagir avec lui. Il servait uniquement d'échafaudage et les cellules qui y étaient encapsulées jusqu'à 4 jours conservaient une viabilité élevée (> 90%) (Fig. S7A supplémentaire) mais restaient rondes (Fig. S7B supplémentaire). Le gel PEG-Ac à 4 bras est dégradable et adhésif cellulaire, et les cellules ont pu interagir avec l'hydrogel et le remodeler au fil du temps, comme en témoigne la propagation cellulaire au jour 4 et la viabilité cellulaire> 95% (Fig. S7 supplémentaire).

Après traitement avec 0, 0,5, 1 et 2 mM de TMZ, les cellules U87 encapsulées dans du PEGDA se sont avérées avoir des viabilités de 86,4 ± 1,9 %, 75,0 ± 1,2 %, 34,0 ± 7,7 % et 15,8 ± 5,7 %, respectivement (Fig. 6A, B). La CE50 (concentration efficace nécessaire pour tuer 50 % des cellules) a été estimée à ~ 0,61 mM TMZ, calculée par un ajustement de courbe sigmoïde (R2 = 0,983). Les cellules étaient moins sensibles au TMZ lorsqu'elles étaient encapsulées dans l'hydrogel dégradable et adhésif PEG-Ac à 4 bras (Fig. 6C, D). La viabilité cellulaire était de 95,6 ± 1,2 %, 83,9 ± 12,9 %, 59,1 ± 6,1 % et 44,0 ± 8,2 % pour 0, 0,5, 1 et 2 mM de TMZ, respectivement, et la CE50 était d'environ 1,8 mM (R2 = 0,901). Ce résultat n'était pas surprenant car la liaison de l'intégrine a déjà été impliquée dans la résistance aux médicaments des cellules de glioblastome43,44,45, et nous avons déjà montré des résultats similaires pour les sphéroïdes de glioblastome46. L'EC50 pour les cellules U87 encapsulées dans un hydrogel PEGDA et traitées avec BCNU était d'environ 8, 2 µM (R2 = 0, 952) (Fig. 6E, F). Comme prévu pour toutes les conditions, l'EC50 estimée était plus élevée par rapport à la culture monocouche 2D, mais similaire à ce qui a été rapporté par d'autres pour les cellules GBM encapsulées dans un hydrogel2. Les cellules mortes étaient visibles dans tout le gel après 48 h d'exposition pour toutes les conditions, ce qui suggère que le microenvironnement dans les gels était homogène (Fig. 6A, C, E).

Réactivité aux médicaments. (A) Images vivantes/mortes de cellules U87 représentatives lors du traitement TMZ, et (B) viabilité cellulaire en fonction de la concentration de TMZ (n = 3) pour les cellules ensemencées dans un gel PEGDA non dégradable et non adhésif. (C) Images vivantes/mortes de cellules U87 représentatives lors du traitement TMZ, et (D) viabilité cellulaire en fonction de la concentration de TMZ (n = 3) pour les cellules ensemencées dans un gel PEG-Ac adhésif dégradable à 4 bras. (E) Images vivantes/mortes représentatives des cellules U87 lors du traitement BCNU, et (F) viabilité cellulaire en fonction de la concentration BCNU (n = 3) pour les cellules ensemencées dans un gel PEGDA non dégradable et non adhésif. Toutes les cellules ont été colorées avec DiOC (vert) et les cellules mortes ont été colorées avec PI (rouge). La barre d'échelle est de 200 µm.

Nos résultats suggèrent que le dispositif pourrait être utilisé pour tester l'effet des interactions cellule-matrice sur la réactivité cellulaire aux facteurs solubles, tels que la chimiothérapie, où la thérapeutique pourrait facilement et de manière homogène pénétrer les hydrogels ensemencés par les cellules. Bien qu'il ne soit pas exploré ici, le dispositif pourrait être adapté pour être utilisé avec différentes cellules et co-cultures cellulaires et cribler leurs réponses à différentes molécules solubles. Étant donné que la conception comprend des cellules encapsulées dans un hydrogel, elle pourrait être utilisée pour étudier l'effet des interactions cellule-matrice et cellule-cellule sur la réactivité cellulaire aux facteurs solubles, tels que la thérapeutique dans un environnement physiologiquement pertinent qui comprend la perfusion et permet la formation de concentration dilutions.

Dans cette étude, nous avons conçu un dispositif microfluidique de criblage de médicaments incorporant des micropuits remplis de cellules encapsulées dans un hydrogel. L'appareil comportait des canaux de décharge pour permettre un chargement d'hydrogel transparent et des puits recouverts d'une membrane pour éviter la contamination et le blocage des canaux de perfusion. Nous avons caractérisé l'efficacité de mélange de l'appareil à l'aide de PBS ordinaire et de bleu brillant FCF et avons déterminé qu'un 1 µL/min physiologique était le débit optimal pour obtenir un mélange complet. En utilisant l'équation de Stoke et la deuxième loi de diffusion de Fick, nous avons déterminé le temps nécessaire à la diffusion des agents chimiothérapeutiques couramment utilisés sur la largeur du canal de mélange. Au débit optimal, la dilution de concentration générée dans le dispositif était comparable à la dilution de concentration attendue. Nous avons en outre déterminé que les procédures de chargement étaient hautement reproductibles car la densité médiane des cellules encapsulées dans l'hydrogel pour chaque colonne de puits était similaire pour les quatre puits et les cellules restaient bien réparties dans l'hydrogel. Nous avons testé deux types d'hydrogel, un PEGDA réticulable aux UV et un PEG-Ac à 4 bras réticulable par addition de type Michael, indiquant qu'une variété de mécanismes de gélification peuvent être adaptés avec le dispositif. Un test de dépistage de médicaments a été mis en évidence en générant une courbe dose-réponse pour les cellules de glioblastome U87 traitées avec du témozolomide et de la carmustine, des chimiothérapies de référence. Une limitation de l'appareil actuel est qu'il contient un réseau 4 × 4 de puits de culture cellulaire, mais un réseau 8 × 8 pourrait être utilisé à l'avenir pour tester plusieurs conditions en même temps et obtenir 7 dilutions (y compris un sans médicament/soluble contrôle moléculaire) pour construire des courbes dose-réponse robustes. Les dispositifs microfluidiques, comme celui développé ici, qui incorporent des cellules, une matrice et une perfusion, sont une imitation proche des environnements cellulaires natifs et représentent une technique simple et peu coûteuse qui permet le dépistage multiplexé des médicaments.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Département de génie biomédical, Université Saint Louis, St Louis, MO, 63103-2010, États-Unis

Allison Clancy, Joseph Bruns, Jahnavi Nadella, Samuel Stealey et Sylvia P. Zustiak

Département de bioingénierie, biochimie et biophysique, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Dayi Chen, Yanjia Zhang et Aaron Timperman

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AT et SZ ont conçu l'idée, conçu le projet, supervisé et financé la recherche. AC et SZ ont rédigé la première ébauche du manuscrit. Des dispositifs microfluidiques ont été fabriqués par DC sous la direction d'ATJB et AC ont préparé les Figs. 1, 5 et Fig. S5 supplémentaire. DC, AC et YZ ont préparé la Fig. 2 et les Figs supplémentaires. S1–S4. AC, JN et SS préparés Figs. 3 et 4. SS préparé Fig. S6. JB a préparé la figure S7. Tous les auteurs ont contribué et révisé le texte principal du manuscrit.

Correspondance à Aaron Timperman ou Silviya P. Zustiak.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Clancy, A., Chen, D., Bruns, J. et al. Dispositif microfluidique à base d'hydrogel avec culture cellulaire in vitro 3D multiplexée. Sci Rep 12, 17781 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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Reçu : 01 juin 2022

Accepté : 14 octobre 2022

Publié: 22 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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