Caractérisation systématique de la salle blanche

Nov 09, 2023

Microsystèmes & Nanoingénierie volume 8, Numéro d'article : 54 (2022) Citer cet article

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Les vannes intégrées permettent un contrôle automatisé dans les systèmes microfluidiques, car elles peuvent être appliquées à des fins de mélange, de pompage et de compartimentation. Une telle automatisation serait très utile pour les applications dans les systèmes d'organes sur puce (OoC). Cependant, les systèmes OoC ont généralement des dimensions de canal de l'ordre de centaines de micromètres, ce qui est un ordre de grandeur supérieur à celui des vannes microfluidiques typiques. Le processus de fabrication le plus utilisé pour les vannes intégrées en polydiméthylsiloxane (PDMS) normalement ouvertes nécessite une résine photosensible de refusion qui limite la hauteur de canal réalisable. De plus, les faibles volumes de course de ces vannes rendent difficile l'obtention de débits de microlitres par minute, qui sont généralement requis dans les systèmes OoC. Ici, nous présentons une « macrovalve » mécanique fabriquée par lithographie douce multicouche à l'aide de moules directs microbroyés. Nous démontrons que ces vannes peuvent fermer des canaux arrondis jusqu'à 700 µm de haut et 1000 µm de large. De plus, nous avons utilisé ces macrovalves pour créer une pompe péristaltique avec un débit de pompage allant jusqu'à 48 µL/min et un dispositif de mélange et de dosage qui peut réaliser le mélange complet d'un volume de 6,4 µL en seulement 17 s. Une première expérience de culture cellulaire a démontré qu'un dispositif avec des macrovalves intégrées est biocompatible et permet la culture cellulaire de cellules endothéliales sur plusieurs jours sous perfusion continue et rafraîchissement automatisé du milieu.

Les organes sur puces (OoC) sont généralement définis comme des dispositifs de culture cellulaire microfluidique contenant deux canaux parallèles adressables indépendamment qui sont séparés par une membrane poreuse. Différents types de cellules peuvent être cultivés des deux côtés de la membrane, ce qui donne lieu à une interface tissu-tissu complexe, spécifique à un organe1,2. Les dispositifs OoC sont considérés comme une alternative puissante aux modèles conventionnels in vitro et animaux3. Cependant, effectuer des expériences de culture cellulaire sur puce n'est pas anodin. Les OoC peuvent être laborieux et difficiles à utiliser, car ils nécessitent une expérience à la fois en microfluidique et en culture cellulaire4,5.

Pour traduire les OoC des dispositifs de preuve de concept en systèmes commerciaux, par exemple, le dépistage des médicaments et la médecine personnalisée, il est crucial que les systèmes OoC aient un débit plus élevé. Les OoC multiplexés sont une approche prometteuse pour augmenter le débit des expériences OoC5,6. Au cours des dernières années, plusieurs systèmes microfluidiques ont été présentés avec un niveau de parallélisation ou de débit plus élevé, mais chacun d'eux a ses propres inconvénients. Par exemple, Mimetas OrganoPlate® est un système avec 40 à 96 puits de culture indépendants ou OoCs7. Cependant, il nécessite de nombreuses étapes de pipetage pour remplir chaque puce individuelle, la zone de culture cellulaire est petite et la configuration nécessite l'utilisation d'un hydrogel (comme barrière semi-perméable et/ou comme substrat cellulaire). Zakharova et al. a montré un exemple de conception avec une entrée commune et huit sorties parallèles qui peuvent être utilisées pour atteindre des niveaux de débit plus élevés, mais de nombreuses manipulations manuelles sont encore nécessaires8.

Les systèmes avec vannes microfluidiques intégrées sont souvent utilisés pour réduire le besoin de manipulation manuelle des liquides, comme ceux montrés par Vollertsen et al.9,10. Ces systèmes utilisent souvent des vannes intégrées normalement ouvertes11, car les vannes sont à la fois faciles à fabriquer et ont un faible encombrement par rapport à la largeur des canaux par rapport à celles des vannes normalement fermées12,13. En 2000, Unger et al. ont présenté une vanne PDMS normalement ouverte qui est actuellement souvent utilisée, également connue sous le nom de vannes de type Quake12. Ces microvalves sont un outil essentiel pour le contrôle automatisé en microfluidique, car elles peuvent être appliquées à des fins de mélange, de pompage et de multiplexage dans une large gamme d'applications9,10,14,15. Bien que ces systèmes d'intégration microfluidique à grande échelle (mLSI) permettent un débit plus élevé, ils ne sont pas compatibles avec les grandes dimensions de canal nécessaires pour accueillir les cultures cellulaires pertinentes dans les OoC.

Le processus de fabrication original des vannes de type Quake repose sur une résine photosensible de refusion pour obtenir des canaux arrondis pour l'étanchéité complète des vannes, limitant son application à des hauteurs de canal jusqu'à des dizaines de micromètres12. Cela rend les vannes inadaptées à la plupart des applications OoC, car les OoC contiennent souvent des canaux de centaines de micromètres de haut et de large16,17,18,19,20. De plus, les systèmes de culture cellulaire 3D, tels que les sphéroïdes cellulaires dans une puce PDMS, nécessitent souvent des dimensions de canal de centaines de micromètres21. De plus, les pompes péristaltiques fabriquées à l'aide d'une résine photosensible à refusion ne peuvent généralement atteindre que des débits de 0,05 µL/min à 0,15 µL/min12,14,22,23,24. Cependant, les débits généralement utilisés dans les OoC sont d'un ordre de grandeur plus élevé, entre 0,5 µL/min et 3,3 µL/min16,17,18,19,20,25, qui peuvent être encore plus élevés dans les vaisseaux sanguins sur puces pour obtenir des contraintes de cisaillement physiologiquement pertinentes. Pour transférer les avantages de la technologie des puces mLSI dans la technologie OoC, de nouvelles méthodes de fabrication pour les vannes PDMS normalement ouvertes sont nécessaires.

Bien que l'utilisation du PDMS soit en débat13,26,27, il reste le matériau de choix pour de nombreux groupes de recherche :28 il est facile à utiliser dans les procédés de fabrication (pour le moulage, le revêtement de surface et le collage au PDMS ou au verre), perméable aux gaz (permettant à l'oxygène de se diffuser vers les cellules), à faible coût, et il a une grande élasticité (permettant la possibilité de vannes de type Quake)13,26,29. Auparavant, de nouvelles méthodes de fabrication utilisant la photolithographie et l'impression 3D ont été explorées pour créer des vannes capables de fermer des canaux de plusieurs centaines de micromètres de haut. Freitas et al.30 ont montré une méthode pour fabriquer une valve de type Quake en utilisant la photolithographie avec une hauteur et une largeur maximales d'environ 250 et 400 µm, respectivement. Cependant, leur méthode nécessite des étapes de lithographie extra douces et la mise sous pression des canaux pendant le durcissement du PDMS, ce qui complique le processus de fabrication. L'impression 3D offre également une alternative à la photolithographie pour la fabrication de vannes de type Quake, comme le montrent Lee et al.31 et Glick et al.32. Cependant, ces vannes sont entièrement imprimées en 3D et non fabriquées à partir de PDMS, ce qui signifie que les vannes ne peuvent pas être directement intégrées dans un PDMS OoC31. Glick et al. et Compera et al. les deux montrent une vanne de type Quake, fermant respectivement un canal de 500 µm de haut et de 200 µm de haut, fabriqué par des moules directs imprimés en 3D32,33. Cependant, l'impression 3D de moules pour la lithographie douce PDMS pose des défis en termes de compatibilité des matériaux, de finition de surface et d'incapacité à polir à la vapeur, de limite de résolution, de répétabilité, de facilité d'utilisation et de vitesse de fabrication34, et l'utilisation d'un photoréticulant, qui peut interférer avec le durcissement du PDMS35,36.

Le microfraisage est une technique de prototypage rapide qui émerge rapidement pour fabriquer des moules microfluidiques qui offre un ensemble unique d'avantages par rapport à l'impression 3D et à la photolithographie. Le micro-fraisage est une méthode de fabrication rapide, polyvalente, sans salle blanche et donc peu coûteuse, permettant des géométries 3D complexes dans un seul moule37. Un moule microbroyé fait d'un plastique, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), est plus solide et donc plus résistant que les maîtres de résine photosensible fragiles, qui sont particulièrement vulnérables lorsque des structures de résine photosensible relativement grandes sont obtenues. En outre, le micro-fraisage des moules demande moins de main-d'œuvre que la fabrication de moules par le procédé conventionnel de photolithographie utilisant un photorésist par refusion, qui nécessite également de l'expérience pour obtenir des résultats reproductibles. Bien que des moules microbroyés pour macrovalves en PDMS aient déjà été rapportés21,38, les méthodes de fabrication correspondantes nécessitent un moule négatif et une double coulée de PDMS sur PDMS21, ou une étape de coulée en polyéthylène téréphtalate (PET)38. De plus, les dimensions de ces canaux arrondis sont limitées par la disponibilité d'outils de fraisage en forme de cône21,38.

À notre connaissance, nous sommes les premiers à décrire une méthode dans laquelle le microfraisage est utilisé pour fabriquer directement un moule positif pour une macrovalve PDMS de type Quake avec des dimensions de l'ordre de centaines de micromètres. Notre méthode proposée nous permet de créer un moule avec une structure verticale avec n'importe quelle forme (par exemple, cylindrique ou elliptique) et taille (hauteur et largeur) comme vous le souhaitez, sans être limité par les formes et tailles des broyeurs à billes ou à cônes disponibles. Ces moules positifs directs facilitent et simplifient le processus de fabrication et minimisent l'erreur potentielle causée par le retrait du PDMS par rapport aux méthodes de double coulée21,38. En résumé, les moules directs microbroyés proposés pour la fabrication de vannes de type Quake permettent une approche plus facile pour la commercialisation des moules et le multiplexage des PDMS OoCs.

Dans cet article, nous montrons une méthode de fabrication entièrement sans salle blanche pour les « macrovalves » PDMS de style Quake en utilisant le micro-fraisage pour fabriquer des moules positifs directs. Les canaux de contrôle peuvent former à la fois des ponts à traverser ainsi que des vannes pour obturer des canaux d'écoulement arrondis. De plus, nous proposons un guide de conception des vannes en caractérisant systématiquement les hauteurs, largeurs et pressions d'actionnement du pont et du canal de la vanne. Les macrovalves peuvent fermer des canaux arrondis jusqu'à 700 µm de haut et 1000 µm de large. Une conception de macrovalve (pour fermer un canal arrondi de 400 µm de haut et 1000 µm de large) a été utilisée pour d'autres expériences. En créant à la fois une pompe péristaltique et un dispositif de mélange et de dosage, nous avons démontré l'efficacité de la macrovalve. La pompe péristaltique peut atteindre un débit de pompage allant jusqu'à 48 µL/min, et le dispositif de mélange et de dosage peut atteindre le mélange complet d'un volume de 6,4 µL en seulement 17 s. Une deuxième conception de valve (pour fermer un canal de 200 µm de haut et 1000 µm de large) a été utilisée pour une expérience de culture cellulaire de preuve de concept montrant la culture de cellules endothéliales sur plusieurs jours sous flux péristaltique dans un dispositif PDMS, démontrant sa biocompatibilité. Cette expérience démontre également le potentiel des macrovalves à appliquer dans les OoC multiplexés et permet l'automatisation de la culture cellulaire dans les OoC, ce qui est extrêmement pertinent pour obtenir une recherche OoC à plus haut débit et réduire simultanément le besoin de manipulation manuelle des liquides.

Les dispositifs fabriqués avec des macrovalves intégrées (Fig. 1) se composaient tous de trois couches (Fig. 1g): une lame de verre, une fine couche de PDMS contenant des canaux de contrôle recouverts d'une membrane PDMS flexible (couche de contrôle) et une couche de PDMS avec un canal d'écoulement arrondi (couche d'écoulement). La figure 1a, b montre un canal de contrôle traversant un canal d'écoulement arrondi de 1 mm de large et 400 µm de haut. Le canal d'écoulement était rempli de colorant alimentaire bleu. Si la section transversale du canal de commande avec le canal d'écoulement était suffisamment large, la membrane du canal de commande s'est déviée lors de la pressurisation dans le canal d'écoulement et l'a fermée (Fig. 1b, c), fermant ainsi la vanne. Le processus de fabrication (simplifié) est illustré sur les Fig. 1d–g. Des moules microbroyés directement ont été utilisés pour couler le PDMS pour la couche d'écoulement et enduire par centrifugation le PDMS pour la couche de contrôle. Après prédurcissement des deux couches, elles peuvent être alignées et collées sur une lame de verre basée sur Unger et al.12.

a, b Images microscopiques en vue de dessus : aa couche de contrôle avec une vanne ouverte et un pont, b canal de contrôle sous pression avec une vanne fermée et un pont, ne fermant pas le canal d'écoulement. Les canaux d'écoulement arrondis contiennent du colorant alimentaire bleu et les canaux de contrôle contiennent de l'eau. c Illustration schématique d'une valve ouverte et d'une valve fermée à partir d'une vue en coupe transversale sur le site de la valve. En pressurisant le canal de commande (P ↑ ), la vanne se ferme. d–g Illustration simplifiée du processus de fabrication. d Un moule micromoulé avec une structure verticale et arrondie est utilisé pour couler le PDMS en tant que couche d'écoulement. e Un moule micromoulé avec des structures rectangulaires (canaux de contrôle) est utilisé comme couche de contrôle. Le PDMS peut être enduit par centrifugation sur le moule, ce qui donne une fine membrane PDMS entre le canal de contrôle et le canal d'écoulement. f Le PDMS peut être prédurci et les deux couches peuvent ensuite être alignées. g La couche de contrôle est collée sur une lame de verre. Le dispositif fabriqué final se compose de trois couches ; une lame de verre, la couche de contrôle et la couche d'écoulement

Pour obtenir l'étanchéité complète de la vanne, le canal d'écoulement doit avoir un profil arrondi, idéalement lisse. Des images de microscopie électronique à balayage (SEM) ont été prises, montrant une structure en forme d'escalier dans le moule en PMMA (Fig. 2a, b) à la suite du fraisage de cette structure arrondie en saillie. Avec un profilomètre Dektak (Veeco), le profil de surface de la structure fraisée et arrondie dans le moule en PMMA a été mesuré (Informations complémentaires S.2). Les marches verticales de la structure en escalier ont été mesurées à 10 µm. Une coupe transversale d'un moulage PDMS du canal d'écoulement est illustrée à la Fig. S1. Pour réduire la rugosité de surface du canal, un traitement au chloroforme de 5 minutes des moules en PMMA a été effectué sur la base d'Ogilvie et al.39. (Information complémentaire S.1, Solution 1B). Les images SEM (Fig. 2c, d) montrent l'effet de lissage du traitement au solvant sur la surface de la structure saillante arrondie. Cet effet de lissage a également été observé dans une mesure Dektak du moule traité (informations supplémentaires S.2, Fig. S3). Nous avons constaté que les vannes étaient sans fuite lorsqu'elles étaient fermées (limite de détection : 10 nL/min) et utilisables pour le pompage, quelle que soit l'étape de lissage supplémentaire. Ainsi, nous n'avons pas utilisé de traitement au chloroforme pour les puces de caractérisation systématique, la pompe péristaltique ou le dispositif de mélange et de dosage. Le lissage est effectué sur les moules de la puce de recirculation utilisée pour la culture cellulaire.

Images MEB du moule PMMA pour le canal d'écoulement arrondi : avant (a, b) et après (c, d) traitement au solvant chloroforme

une vue de dessus schématique de la puce pour la caractérisation. Cette puce est fabriquée en 4 versions, chacune avec une largeur de canal d'écoulement fixe (250, 500, 750 ou 1000 µm). La hauteur du canal d'écoulement varie en % de la largeur du canal d'écoulement, indiquée par le dégradé bleu. La hauteur du canal de contrôle est fixe par version de puce et la largeur du canal de contrôle varie en % de la largeur du canal d'écoulement. b Fabrication de 4 versions de la puce, avec la largeur de canal d'écoulement fixe indiquée. c Fermetures des vannes des 4 versions de puces à différentes pressions d'actionnement (indiquées par les 4 barres verticales en bas à droite : 1, 1,25, 1,5, 1,75 bar) (par bar, n = 9 à 12). Les fermetures de valve pour les versions de puce séparées (largeur de canal d'écoulement de 250, 500, 750 et 1000 µm) peuvent être trouvées dans les informations supplémentaires S.5

Une caractérisation systématique des vannes avec différentes dimensions et/ou pressions de ligne de contrôle fournit un outil de conception utile pour la fabrication de dispositifs PDMS avec diverses dimensions et applications. Cette caractérisation systématique détermine la largeur de canal de commande requise pour des plages de largeurs et de hauteurs de canal d'écoulement à différentes pressions d'actionnement. Quatre puces de caractérisation (contenant chacune 25 sections transversales entre un canal de contrôle et un canal de flux) ont été conçues et fabriquées. Pour chaque puce, la largeur du canal d'écoulement arrondi était fixe (250, 500, 750 ou 1000 µm de large ; voir Fig. 3a, b). Une gamme de hauteurs pour les canaux d'écoulement, qui sont données en pourcentage (%) de la largeur du canal d'écoulement, a été examinée. En outre, cinq canaux de contrôle avec une gamme de largeurs, également tous exprimés en pourcentage (%) de la largeur du canal d'écoulement, ont été examinés. Les coupes transversales des moulages PDMS des moules micromoulus peuvent être trouvées dans les informations supplémentaires S.3 et S.4 pour les canaux d'écoulement et de contrôle, respectivement.

Les canaux d'écoulement ont été remplis de colorant alimentaire bleu et une gamme de pressions d'actionnement (1, 1,25, 1,5 et 1,75 bar) a été appliquée aux canaux de contrôle. Les sections transversales du canal de contrôle/d'écoulement ont été observées au microscope pour la présence de colorant alimentaire bleu dans le canal d'écoulement (comme illustré à la Fig. 1b). La figure 3c montre le pourcentage de fermeture de vanne moyen pour les 4 versions de puce aux différentes pressions d'actionnement. La figure 3c montre que notre méthode de fabrication proposée a fonctionné pour fermer différentes tailles de canaux d'écoulement, avec des hauteurs allant jusqu'à 70 % de la largeur. Avec un canal de contrôle étroit (largeur de 10 à 12 % de la largeur du canal d'écoulement), le pontage d'un canal d'écoulement n'a jamais été un problème tant que la hauteur du canal d'écoulement était supérieure à 20 % de la largeur. Pour la fermeture, un canal de contrôle aussi large que le canal d'écoulement semblait être le plus robuste, même s'il présentait l'inconvénient d'un encombrement important. Lorsqu'un faible encombrement est préféré, une largeur de canal de commande de 60 % de la largeur du canal d'écoulement suffit également à des pressions d'actionnement plus élevées.

Comme les OoC ont souvent un canal de 1 mm de large avec une hauteur variant de 150 µm à 1 mm16, 17, 18, 19, 20, 25, nous avons choisi d'examiner plus en détail une valve adaptée à ces dimensions OoC. Dans la suite de cet article, nous avons examiné la fermeture de la valve d'un canal de 1000 µm de large et 400 µm de haut, ci-après dénommée « macrovalve ».

Le comportement de fermeture de la macrovalve a été examiné en appliquant différentes pressions aux canaux d'écoulement et de contrôle. Deux régulateurs de pression ont été utilisés pour appliquer une pression différentielle (dP) à l'entrée et à la sortie du canal d'écoulement, et un régulateur de pression a été utilisé pour appliquer la pression au canal de contrôle. Un capteur de débit, en série avec la vanne, a été utilisé pour mesurer le débit à différentes pressions (voir Fig. 4a). En appliquant plus de 900 mbar à la conduite de commande, la vanne pouvait être fermée pour les quatre pressions d'entrée allant de 2,5 mbar à 10 mbar.

a Comportement de fermeture de la macrovanne. Lignes de guidage visuel. dP = pression différentielle entre les pressions d'entrée et de sortie du canal d'écoulement, qui sont variées et indiquées par les différentes couleurs (n = 1). b Débit de pompage de la pompe péristaltique à différentes fréquences et pressions d'actionnement avec un schéma à 6 phases (101, 100, 110, 010, 011, 001). Une relation linéaire est observée entre le débit de pompage et les fréquences d'actionnement pour les trois pressions d'actionnement. 1 barre, R2 = 0,9999 (n = 3) ; 1,2 bar, R2 = 0,9997 (n = 1) ; 1,5 bar, R2 = 0,9998 (n = 1). c Illustration schématique du schéma d'actionnement en 6 phases de la pompe péristaltique

Les fuites de soupape ont également été examinées et sont présentées dans les informations supplémentaires S.6. En termes simples, la fuite moyenne de la vanne est de l'ordre de nL/min, soit seulement 0,1 % du débit avec une vanne ouverte, ce qui nous permet de conclure que la fuite d'une vanne fermée est négligeable pour nos applications.

Trois vannes consécutives ont été utilisées pour créer une pompe péristaltique. Le débit de pompage de la pompe péristaltique a été examiné par l'actionnement des vannes avec un schéma à 6 phases (101, 100, 110, 010, 011, 001 ; illustré schématiquement sur la Fig. 4c) à différentes fréquences. La figure 4b montre la réponse linéaire entre la fréquence d'actionnement et le débit de pompage pour chaque pression d'actionnement. À une fréquence de 20 Hz, un débit de pompage maximal de 47,9 µL/min a été atteint (voir Fig. 4b). Les mesures dans une pompe étaient reproductibles, comme indiqué par les petites barres d'erreur presque invisibles pour les mesures à 1 bar. Une autre pompe péristaltique, illustrée à la Fig. S2, a également montré une réponse linéaire. Les fréquences supérieures à 20 Hz n'ont pas été examinées, car elles ne peuvent pas être atteintes avec la configuration du collecteur de vannes utilisée, qui avait une fréquence de commutation maximale de 20 Hz.

Le dispositif de mélange et de dosage, représenté schématiquement sur la figure 5a, contenait deux entrées, deux sorties et une pompe péristaltique sur puce. Le dispositif de mélange et de dosage était caractérisé par le mélange de colorant alimentaire et d'eau dans les canaux d'écoulement de la puce. Pendant le mélange, des images des fluides dans la puce ont été capturées, qui ont ensuite été converties en concentrations à l'aide de courbes d'étalonnage, comme expliqué plus en détail dans la section Matériels et méthodes.

a Vue de dessus schématique de l'appareil avec indication du site où l'intensité a été mesurée. b Image de la voie avant mixage. La largeur du canal (indiquée par les lignes pointillées) est de 1 mm. c Image de la voie après mixage. Veuillez noter que ce canal est arrondi. Par conséquent, l'intensité aux coins est plus faible, tandis que la concentration réelle est constante ; voir Informations supplémentaires S.7 pour l'étalonnage correspondant.d Efficacité du mélange dans le temps. Les périodes de mélange et de rinçage ultérieur sont indiquées. Après 17 s de mélange, l'efficacité du mélange approche les 90 %. e, f Concentration calculée sur la largeur du canal (distance x) avant (e) et après (f) mélange. Une efficacité de mélange moyenne de 90,4 ± 3,32 % a été observée après 17 s de mélange (n = 3). Dilution de 100 % de colorant alimentaire (Entrée B) avec de l'eau (Entrée A). g Vue de dessus schématique de l'appareil avec une indication (boîte rouge) du site où l'intensité a été mesurée. h Image de l'appareil de mélange et de dosage au début de l'expérience. i Concentration calculée du colorant alimentaire dans le canal après avoir dilué 100 % de colorant alimentaire avec de l'eau pendant 5 cycles. Une diminution exponentielle de la concentration de colorant alimentaire est observée avec un ajustement exponentiel de y = 102,69e−0,561x avec R2 = 0,999 (n = 3 mesures)

La quantité de mélange peut être quantifiée comme la différence entre les profils de concentration après mélange et le cas parfaitement mélangé. Lorsque cela est pris comme une fraction de la différence entre un profil complètement non mélangé (une fonction en escalier) et le même cas parfaitement mélangé, nous arrivons à la formulation précédemment rapportée de l'efficacité du mélange :40

où N est le nombre de rangées de pixels, cmeasured est la concentration mesurée le long du canal, \(\bar c\) est la concentration moyenne le long du canal et c0 est le profil de concentration complètement non mélangé le long du canal. Pour ce profil c0, nous prenons une fonction en escalier de 0 pour la moitié de la largeur du canal à 2\(\bar c\) pour l'autre moitié de la largeur du canal comme référence pour l'état non mélangé, comme décrit par Johnson et al.40 .

La figure 5a montre schématiquement le site où l'intensité a été mesurée et la concentration a été calculée. La figure 5b, c montre les images réelles avant et après le mélange, avec la concentration calculée le long de la distance x illustrée sur la figure 5e, f. L'efficacité du mélange s'est améliorée de 3,46 ± 1,61 % avant le mélange à 90,4 ± 3,32 % après 17 s de mélange. L'efficacité du mélange a également été calculée dans le temps, comme le montre la figure 5d. Un enregistrement vidéo du processus de mélange peut être trouvé dans les informations supplémentaires S.8.

Le dispositif de mélange et de dosage a également été utilisé pour effectuer une série de dilutions (Fig. 5g – i). Tout d'abord, les canaux d'écoulement du dispositif illustré à la Fig. 5g ont été remplis de colorant alimentaire, et après qu'une vanne a fermé la boucle de mélange, le canal principal a ensuite été rincé avec 100 % d'eau (Fig. 5g, h). Cette eau a été mélangée pendant 17 s avec le colorant alimentaire présent dans la boucle de mélange, diluant le colorant alimentaire, ce qui a été répété 5 fois, indiqué en cycles de dilution. Un enregistrement vidéo de la performance de la série de dilution peut être trouvé dans les informations supplémentaires S.9. La concentration dans le canal a été calculée avec la même méthode que celle utilisée pour les expériences de mélange (expliquées plus en détail dans les matériaux et méthodes et informations supplémentaires S.7). La concentration dans le canal est tracée par cycle de dilution sur la figure 5i. La série de dilution montre un ajustement exponentiel (R2 = 0,999), comme prévu, puisque pour chaque cycle, environ 37 % du volume total de la boucle est remplacé.

La contrainte de cisaillement et l'exposition constante aux facteurs de signalisation paracrine jouent un rôle important dans l'intégrité de l'endothélium cultivé in vitro. Ces deux facteurs peuvent être atteints par la recirculation du milieu de culture cellulaire dans une puce via une pompe hors puce41 ou une pompe sur puce composée de microvalves24,42. Le dispositif de mélange et de dosage présenté permet une recirculation du milieu en boucle fermée. La « puce de recirculation » a une conception similaire à celle de la puce de mélange et de dosage (Fig. 6a), mais les vannes ont une largeur de 1 mm et le canal d'écoulement a une largeur de 1 mm et une hauteur de 200 µm43. La puce de recirculation est utilisée pour une expérience de preuve de concept pour cultiver des cellules endothéliales pendant 96 h sous flux péristaltique, en appliquant une contrainte de cisaillement aux cellules. Pendant ces 96 h, les macrovalves de la pompe péristaltique ont été allumées/éteintes plus de 3 × 106 fois au total. La pompe péristaltique a été programmée pour fonctionner à 10 Hz avec un schéma d'actionnement triphasé (011-101-110), ce qui a donné un débit de pompage de 3,7 µL/min (Fig. 6c, ligne pointillée). Ce modèle a été utilisé pour les expériences de culture cellulaire initiales afin d'assurer un volume constant de milieu recirculant dans la boucle pendant le pompage, car il y a le même nombre de vannes fermées à chaque étape du modèle de pompage. La même puce a également pu atteindre des taux de pompage plus élevés avec le schéma d'actionnement à 6 phases (Fig. 6c, ligne continue). Les cellules endothéliales ont formé une couche de cellules confluentes dans le canal d'écoulement 96 h après l'ensemencement (Fig. 6b, d).

a Vue de dessus schématique de l'appareil avec indications de la pompe péristaltique (rouge) et de la chambre cellulaire (vert). Les flèches blanches indiquent la boucle de recirculation moyenne. b Image microscopique à contraste de phase des HUVEC (passage numéro 7) cultivées sur puce pendant 96 h sous flux péristaltique constant. La barre d'échelle représente 1 mm. c Taux de pompage mesuré de la pompe péristaltique sur puce à différentes fréquences avec des modèles d'actionnement triphasés et 6 phases (pour les deux, n = 1). d Image de fluorescence des HUVEC exprimant la GFP (vert) avec des noyaux cellulaires colorés (NucBlue) et de la F-actine (rouge). La barre d'échelle représente 1 mm43

Notre méthode de fabrication proposée (brièvement illustrée sur la Fig. 1d – g et décrite en détail dans la section Matériels et méthodes) fournit une approche pour la fabrication d'une macrovalve à l'aide de deux moules positifs avec une seule étape de lithographie douce. Cette méthode repose entièrement sur le micro-fraisage, qui offre plusieurs avantages par rapport au processus de photolithographie conventionnel avec un photorésist par refusion. Le micro-fraisage donne au concepteur une grande liberté, car il permet différentes hauteurs dans un moule, ce qui serait beaucoup plus encombrant pour les maîtres de la photolithographie, car cela nécessiterait des masques et des étapes de fabrication supplémentaires. De plus, notre méthode proposée est complètement sans salle blanche et les moules micro-usinés ne nécessitent pas d'apprêt ou de revêtement après la fabrication. Le temps nécessaire pour le micro-fraisage des deux moules dépend de la taille du moule et de la quantité et de la complexité des structures dans le moule. Pour la pompe péristaltique et le dispositif de mélange et de dosage démontrés ici, le fraisage des deux moules pour un dispositif a pris respectivement 1,5 h et 2 h. C'est 3 fois plus rapide que le processus de fabrication de la technique de photolithographie avec un photorésist par refusion, qui nécessite au moins 6 h pour fabriquer les deux tranches.

Les dimensions plus importantes de notre macrovalve permettent une plus grande marge d'erreur pour l'alignement des deux couches que celles des vannes microfluidiques typiques. L'alignement peut être effectué à l'aide d'un simple stéréomicroscope, voire à l'œil nu, et il n'est pas nécessaire que l'utilisateur soit extrêmement précis ou expérimenté. Les dimensions (hauteur et largeur) des canaux et des vannes sont toutes supérieures d'un ordre de grandeur (10x) à celles couramment obtenues avec la méthode conventionnelle de photorésist par refusion.

Les marches verticales «en escalier» de la structure arrondie en PMMA (Fig. 2a, b) ont été mesurées à 10 µm, ce qui peut être réglé par un paramètre spécifique dans le logiciel HSMworks (expliqué plus en détail dans les informations supplémentaires S.1, Solution 1A) . Une plus grande précision devrait être possible mais nécessite plus de puissance de calcul et donc plus de temps de calcul (et de fraisage). Une autre approche pour lisser la structure arrondie est un traitement au solvant chloroforme basé sur Ogilvie et al.39 (Informations supplémentaires S.1, Solution 1B). La figure 2 montre un net lissage de la surface du moule en PMMA dû à ce traitement au solvant chloroforme. Cependant, l'effet du traitement au solvant chloroforme peut dépendre de plusieurs facteurs, tels que le volume de la boîte de Pétri utilisée, le volume et la concentration de chloroforme utilisé et la distance entre le niveau de liquide chloroforme et la surface du moule en PMMA. Il en résulte que le traitement au solvant nécessite une optimisation avant de pouvoir être utilisé, ce qui complique le processus de fabrication. Nous avons constaté que les deux options de lissage supplémentaires n'étaient pas nécessaires pour fermer complètement le canal d'écoulement.

La caractérisation systématique effectuée (Fig. 3 et informations supplémentaires S.3–S.5) fournit un outil de conception précieux pour la fabrication de vannes de différentes tailles et/ou applications. Veuillez noter que cette fermeture de valve dépend fortement de l'épaisseur de la fine membrane PDMS entre les couches de contrôle et d'écoulement. Lorsqu'une vitesse de rotation, un rapport PDMS, un moule de taille ou une viscosité PDMS différents sont utilisés, cette épaisseur peut être différente, entraînant des différences dans les caractéristiques de la vanne (voir Informations supplémentaires S.1 Problème 2–4). Nous recommandons d'utiliser la technique de fabrication proposée pour fermer les canaux arrondis d'une largeur de 500 µm ou plus, car la couche de contrôle et la couche d'écoulement de la puce de 250 µm présentent des écarts en pourcentage très élevés dans leurs largeurs et leurs hauteurs (informations supplémentaires S. 3–S.5).

La fuite de la vanne lors de l'application d'une pression de 20 mbar au canal d'écoulement et d'une pression de 1,5 bar au canal de contrôle est de l'ordre de nL/min, ce qui représente seulement 0,1 % du débit avec une vanne ouverte et en dessous de la limite de détection (10 nL/min) du capteur de débit utilisé. Le temps de réponse à 90 % d'une vanne ouverte à une vanne fermée à 90 % était inférieur à 0,5 s (Fig. S6). Après ces 0,5 s, le capteur de débit n'est plus assez sensible pour effectuer une mesure précise. Cependant, le débit est mesuré à l'extérieur de la puce PDMS avec une macrovalve, ce qui peut entraîner un retard dans le temps de réponse en raison de l'inertie du fluide. A des fins de compartimentation dans les applications OoC, ce temps de réponse et l'étanchéité de la vanne sont suffisants.

La figure 4b montre que le débit de pompage augmente au fur et à mesure que la fréquence d'actionnement augmente, jusqu'à une fréquence de 20 Hz, qui est la fréquence de commutation maximale du collecteur de vannes commandant les vannes de la pompe péristaltique44. Le débit le plus couramment utilisé pour les OoC est de 0,5 µL/min18,19,25 ou 1 µL/min16,17, qui peut facilement être obtenu par la pompe péristaltique présentée. Nous rapportons un taux de pompage maximal de 48 µL/min, ce qui est beaucoup plus élevé que les taux de pompage signalés pour les pompes péristaltiques fabriquées par la méthode conventionnelle de résine photosensible à refusion. Les débits de pompage généralement atteints par ces pompes vont de 0,05 µL/min à 0,15 µL/min12,14,22,23. Des débits de pompage de 7,5 µL/min pour les dispositifs utilisant des vannes classiques de type Quake sont documentés45. Cependant, ces pompes nécessitent des fréquences très élevées (300 à 400 Hz) pour obtenir ces débits de pompage, qui ne peuvent pas être obtenus par le collecteur d'électrovannes externes utilisé dans cette recherche. Des électrovannes à grande vitesse, telles qu'utilisées par Goulpeau et al., pourraient résoudre ce problème. Cependant, le temps de pressostat atteignable est également limité par les volumes d'actionnement (c'est-à-dire les volumes de la tubulure et du canal de commande)45.

La figure 4b montre la réponse presque parfaitement linéaire de la fréquence d'actionnement et son taux de pompage résultant. Des pompes séparées présentent des débits de pompage légèrement différents à différentes fréquences et pressions d'actionnement, mais la linéarité susmentionnée facilite l'étalonnage. En fonction du débit souhaité, la pompe péristaltique peut être calibrée en déterminant une pression et une fréquence d'actionnement appropriées, décrites dans les informations complémentaires S.1, Solution 4 (Fig. S2). Dans une puce de pompe, le tracé débit-fréquence s'avère très reproductible (Figs. 4b, 1 bar).

Nous avons montré que nous pouvions améliorer l'efficacité du mélange de 3,46 ± 1,61 % avant mélange à 90,4 ± 3,32 % après 17 s de mélange (Fig. 5). En comparaison, Kondapalli et al. ont montré un dispositif de mélange et de dosage avec l'application du repliement d'une protéine sur puce24, où ils ont signalé un temps de mélange requis de 45 s pour mélanger complètement. Cependant, l'efficacité du mélange n'a pas été rapportée quantitativement.

Une efficacité de mélange supérieure à 90 % est considérée comme indiquant une distribution uniforme le long du canal46. Cependant, dans la littérature, les mélangeurs microfluidiques sont des mélangeurs passifs avec une structure de canal spécifique provoquant le mélange et ont donc une seule efficacité de mélange pour un débit donné. L'efficacité du mélange dans notre système est difficile à comparer à celle des mélangeurs passifs de la littérature pour deux raisons : premièrement, le mélange est activement réalisé via la recirculation, et deuxièmement, la boucle de mélange contient un volume mort qui est également recirculé pendant le mélange. Les deux effets provoquent une modification de l'efficacité du mélange au fil du temps. Le premier effet signifie que nous pouvons simplement recirculer indéfiniment pour atteindre des rendements de plus en plus meilleurs. Le deuxième effet signifie qu'il y a initialement des oscillations dans l'efficacité de mélange mesurée lorsque le volume mort recircule. Pour pallier cela et pouvoir encore faciliter la comparaison avec la littérature, nous avons plutôt caractérisé le temps nécessaire à l'extinction des oscillations pour que l'efficacité du mélange atteigne 90%. Sur la figure 5d, nous voyons que les oscillations s'éteignent après 10 s de recirculation et qu'une efficacité de mélange d'environ 90 % est atteinte après 17 s.

La série de dilutions illustrée à la Fig. 5g – i montre un ajustement exponentiel, ce qui est attendu, puisque le colorant a été dilué avec la même quantité d'eau à chaque cycle. L'ajustement montre un facteur de dilution de 0,561, qui se rapproche du facteur de dilution attendu de 0,584 obtenu en calculant les volumes des canaux dans la boucle de mélange (Informations complémentaires S.10). D'autres facteurs de dilution peuvent être obtenus en ajustant le rapport volumique dans la puce.

Avec l'expérience de culture cellulaire de preuve de concept, nous avons montré que le dispositif est biocompatible et permet la culture cellulaire de cellules endothéliales sur plusieurs jours. Au cours des premières expériences à long terme, nous avons découvert que la liaison entre la couche de contrôle et la lame de verre n'était pas suffisamment forte pour résister à l'actionnement pendant plus de 24 h. Pour résoudre ce problème, nous avons ajouté une couche PDMS supplémentaire sous la couche de contrôle, qui est décrite plus en détail dans la section Matériels et méthodes. Dans notre expérience initiale de culture cellulaire, nous avons démontré qu'il est possible d'actionner les vannes pendant 96 h, pendant lesquelles nous avons activé/désactivé les vannes plus de 3 × 106 fois.

La pompe péristaltique a généré une contrainte de cisaillement d'environ 0,01 Pa lorsqu'elle est actionnée à 10 Hz selon un schéma triphasé (calculé à l'aide d'une approximation de la contrainte de cisaillement de la paroi dans des canaux rectangulaires47). Ce n'est pas encore une contrainte de cisaillement physiologiquement pertinente pour les vaisseaux sanguins (> ~ 0,5 Pa)48,49,50 ; cependant, cela peut être résolu en réduisant les dimensions de la chambre cellulaire ou en utilisant le modèle à 6 phases qui a été montré pour atteindre des taux de pompage beaucoup plus élevés. Pour d'autres applications d'organes sur puce, telles que les boyaux sur puces, la contrainte de cisaillement générée est déjà suffisante25.

Le processus de fabrication sans salle blanche présenté basé sur le microfraisage d'un moule positif direct pour les macrovalves PDMS de style Quake est une méthode qui, à notre connaissance, n'a pas été décrite auparavant. Nous montrons que nous pouvons former à la fois des ponts pour traverser et des vannes pour fermer des canaux arrondis jusqu'à 700 µm de haut et 1000 µm de large. Une caractérisation systématique des dimensions de la vanne et du pont est effectuée, ce qui est un outil de conception précieux pour les dispositifs dont les dimensions sont de l'ordre de centaines de micromètres (250–1000 µm) qui ne peuvent pas être obtenues avec la méthode conventionnelle de photorésistance à refusion généralement utilisée pour produire Quake soupapes de style. Les dimensions sont spécifiquement réglées pour les OoC, et les résultats d'une première expérience de culture cellulaire étayent la conclusion que les cellules peuvent être cultivées avec un rafraîchissement moyen automatisé pendant au moins plusieurs jours en utilisant cette technologie de valve. De plus, les grands volumes de course des macrovalves nous permettent d'atteindre des débits de pompage allant jusqu'à 48 µL/min en utilisant le pompage péristaltique. L'intégration de ces macrovalves permettra le multiplexage et le contrôle automatisé des conditions de culture cellulaire dans les OoCs. Ces paramètres sont essentiels pour obtenir des OoC à haut débit tout en réduisant le besoin de manipulation manuelle.

Pour chaque conception, deux moules en PMMA ont été conçus dans un logiciel de CAO 3D (SolidWorks®, 2018) pour les couches de contrôle et d'écoulement. Les dimensions des structures en saillie dépendaient de la conception de la puce. Les entrées et sorties étaient sur une grille correspondant aux normes ISO Workshop Agreement 23:201651.

HSMworks, logiciel de CAO/FAO intégré à SolidWorks®, a été utilisé pour programmer les étapes de fraisage. Plus précisément, les paramètres de tolérance et de lissage dans la conception de la couche d'écoulement étaient essentiels pour obtenir une structure en saillie lisse et arrondie (voir Informations supplémentaires S.1, Solution 1A). Le matériau de base en PMMA a été microbroyé (Datron Neo, Allemagne) pour obtenir les moules positifs. Pour la couche d'écoulement, un broyeur de 1 mm de diamètre a été utilisé, et pour les plus petites caractéristiques de la couche de contrôle, un broyeur de 0,4 mm de diamètre a été utilisé. Un traitement facultatif au solvant chloroforme de 5 minutes des moules en PMMA basé sur Oglivie et al.39 peut être effectué (Informations complémentaires S.1, Solution 1B). Après le micro-fraisage, la poussière peut être éliminée en rinçant les moules à l'eau (l'utilisation d'un bain à ultrasons pour éliminer les éventuelles bavures et poussières est facultative) et en les séchant à l'aide d'un pistolet à azote. Les moules en PMMA n'ont pas besoin d'apprêt ou de revêtement et peuvent être directement utilisés pour la coulée de PDMS.

Le processus de fabrication des dispositifs PDMS, illustré à la Fig. 7, est basé sur Unger et al.12. Le PDMS (RTV 615, Permacol BV, Pays-Bas) a été mélangé (1:7 (w/w)) pour la couche d'écoulement et (1:20 (w/w)) pour la couche de contrôle, puis dégazé pendant 1,5 h. Le PDMS (1:7 (w/w)) a été coulé sur le moule pour la couche d'écoulement. Pour la couche de contrôle, du PDMS (1:20 (w/w)) a été enduit par centrifugation sur le moule en PMMA microbroyé pendant 60 s, ce qui a donné une membrane d'environ 60 µm d'épaisseur au niveau du site de la valve. La vitesse de rotation requise pour cette membrane de 60 µm d'épaisseur dépendait de la taille du moule et de la hauteur de la couche de contrôle. Les vitesses de rotation utilisées pour les différentes puces sont résumées, ainsi que d'autres paramètres pertinents pour le protocole de fabrication, dans les informations supplémentaires S.11 (tableau S6). La couche témoin a été placée sur une surface plane après centrifugation pendant 20 minutes à température ambiante, après quoi les deux couches ont été prédurcies pendant 45 minutes à 60°C. Après prédurcissement, les entrées du canal d'écoulement ont été perforées avec un poinçon de biopsie de 1 mm (Ted Pella, Inc., USA). Ensuite, les deux couches ont été alignées et pressées ensemble pour se lier et durcir pendant une nuit à 60 ° C. Ensuite, les entrées des canaux de contrôle ont été perforées avec un poinçon de biopsie de 0, 75 mm (Harris Uni-core) et la couche de contrôle a été collée au plasma sur une lame de verre. Les dispositifs finaux se composaient de trois couches : deux couches de PDMS (flux et contrôle) et une couche de verre.

Illustration schématique des processus de fabrication des dispositifs PDMS. * Veuillez noter que la vitesse de rotation à l'étape 3b dépend de la taille du moule de la couche de contrôle PMMA

Lors de l'utilisation des vannes pour la culture cellulaire pendant des jours, un délaminage de la couche de contrôle de la lame de verre a été observé. Pour résoudre ce problème pour la puce de recirculation, une couche PDMS supplémentaire a été ajoutée à la lame de verre. Le PDMS a été mélangé (1:10 (p/p), kit d'élastomère de silicone Sylgard 184, Dow corning), dégazé et enduit par centrifugation sur une lame de verre à 300 tr/min. Cette couche a été prédurcie pendant 14 minutes à 60 ° C, après quoi la couche de contrôle et la lame de verre revêtue de PDMS ont été traitées au plasma d'oxygène. Après le collage, la puce a été complètement polymérisée à 60 °C. Les résultats préliminaires utilisant une méthode alternative, comme décrit dans les informations supplémentaires S.1, problème 5, ont montré une amélioration prometteuse de la fiabilité et de la stabilité des dispositifs. Cette méthode de fabrication sera explorée plus en profondeur dans le futur.

La figure 8a montre la configuration expérimentale pour tester le comportement de fermeture de la vanne. Deux régulateurs de pression (Fluigent, série LINEUP™) ont été utilisés pour appliquer des pressions à l'entrée et à la sortie du canal d'écoulement, et la différence entre ces pressions est la pression différentielle (dP). Un régulateur de pression (Fluigent, série LINEUP™) a été utilisé pour appliquer la pression au canal de contrôle. En série avec la vanne, un capteur de débit (Fluigent, FRP taille L) a été placé.

Montages expérimentaux pour a tester le comportement de fermeture de la vanne, b mesurer le débit de pompage généré par la pompe péristaltique et c mesurer l'efficacité de mélange et la série de dilution

Pour la caractérisation systématique, les canaux d'écoulement ont été remplis d'un colorant alimentaire bleu (JO-LA) et la fermeture de la valve a été observée à l'aide d'un microscope avec une caméra CCD couleur (FLIR Grasshopper 3, U23S6C) pour enregistrer les images. Un système sur mesure (Convergence Industry BV, Pays-Bas) a été utilisé pour l'actionnement des canaux de commande.

La figure 8b montre la configuration expérimentale pour mesurer le taux de pompage péristaltique. Pour l'actionnement des trois vannes, la pression aux canaux de commande a été appliquée via un collecteur de vannes (Festo), qui a une fréquence de commutation maximale de 20 Hz et est contrôlé par un module Easyport (Festo). La pompe péristaltique a été actionnée à une certaine fréquence et pression pendant 5 ou 10 minutes. L'écoulement a été recueilli dans des tubes Eppendorf, qui ont été pesés (Balance SX64, Mettler Toledo) avant et après le pompage.

Pour le dispositif de mélange et de dosage (Fig. 8c), un système sur mesure (Convergence) a été utilisé pour l'actionnement des canaux de commande. Les canaux de commande ont été actionnés avec une pression de 1,5 bar. Pour le mélange, les trois vannes ont également été actionnées avec un schéma en 6 pendant 20 cycles à une fréquence de 10 Hz. Avec un régulateur de pression (Fluigent, série LINEUP™), une pression a été appliquée aux deux entrées du dispositif de mélange et de dosage. Les images ont été prises à l'aide d'une caméra à niveaux de gris (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M, caméra Point Grey).

Le traitement et l'analyse des images ont été effectués à l'aide de MATLAB (2017b). Tout d'abord, une correction de fond a été effectuée pour corriger les variations d'intensité globales (Informations complémentaires S.7). Une séance d'étalonnage a été menée au cours de laquelle les canaux d'écoulement du dispositif de mélange et de dosage ont été remplis de concentrations connues de colorant alimentaire dilué dans de l'eau pour obtenir une courbe d'étalonnage (Fig. S7). La figure S7a montre que lorsque le canal d'écoulement est rempli de colorant alimentaire, l'intensité mesurée diffère sur la largeur du canal (distance x sur les figures 5b, c) en raison du profil arrondi du canal d'écoulement. Pour résoudre ce problème, une courbe d'étalonnage a été établie par rangée de pixels. Trois courbes d'étalonnage à différents sites le long de la largeur du canal sont illustrées à la Fig. S7b – d, où (I0 / I) est tracé en fonction de la concentration. Toutes les courbes d'étalonnage ont suivi un ajustement polynomial du second ordre. En utilisant ces courbes d'étalonnage, la concentration inconnue le long du canal a pu être calculée (Fig. 5). En analysant les images séparées du processus de mélange, l'efficacité du mélange a été calculée dans le temps (Fig. 5d). La concentration moyenne (\(\bar c\)) a été calculée par image, qui a été utilisée pour calculer l'efficacité du mélange à cette image/point temporel spécifique.

Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) (Angio-Proteomie, États-Unis) ont été cultivées dans un milieu de croissance endothélial (EGM) (Cell Applications, Inc., CA, États-Unis) dans un T75 recouvert de collagène. flacon (CELLCOAT®, Greinder Bio-One). Avant la culture cellulaire, la puce de recirculation a été stérilisée en effectuant un traitement au plasma d'oxygène (40 s, 50 Watt, Femto Science, Cute), et les canaux d'écoulement ont été rincés avec de l'éthanol à 70 % (Boom, Pays-Bas) puis avec du phosphate. solution saline tamponnée (PBS, Sigma-Aldrich). Les HUVEC exprimant la GFP (passage numéro 7) ont été ensemencées dans la chambre cellulaire à une densité d'ensemencement de 4 × 106 cellules/mL. La pompe péristaltique sur puce a été programmée pour exécuter un modèle d'actionnement triphasé (011-101-110) à 10 Hz. Le milieu de culture cellulaire dans la boucle a été partiellement remplacé toutes les 2 h automatiquement. Les vannes à l'entrée 1 et à la sortie ont été ouvertes et la chambre cellulaire fermée (Fig. 6a), tandis que la pompe sur puce a pompé du milieu frais dans la puce pendant 1 minute.

L'expérience de culture sur puce a été réalisée en plaçant le dispositif dans un système d'incubation sur mesure9 pendant 96 h.

Pour l'analyse par microscopie à fluorescence, les HUVEC ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (Sigma Aldrich) dans du PBS puis perméabilisées avec du Triton-X à 0,3 % (Sigma Aldrich) dans du PBS. Les cellules ont été colorées avec 15 µL/mL d'AcinRed (Thermo Fisher Scientific) et de NucBlue (Thermo Fisher Scientific) dans du PBS pour visualiser les filaments de F-actine et les noyaux cellulaires, respectivement. Des images fluorescentes et à contraste de phase ont été capturées à l'aide d'un système d'imagerie cellulaire EVOS FL.

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Les auteurs remercient Ing. Johan Bomer pour avoir pris les images SEM et effectué les mesures de profilage de surface Dektak. Ce projet a été financé par une subvention Building Blocks of Life de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), subvention no. 737.016.003 et par l'Entreprise Commune Initiative Médicaments Innovants 2 sous la convention de subvention no. 853988. Cette entreprise commune a reçu le soutien du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne, de l'EFPIA et de JDRF International.

BIOS Lab on a Chip Group, MESA+Institute, Technical Medical Center, Max Planck Institute for Complex Fluid Dynamics, Université de Twente, Enschede, Pays-Bas

Elsbeth GBM Bossink, Anke R. Vollertsen, Joshua T. Loessberg-Zahl, Loes I. Segerink & Mathieu Odijk

Groupe des technologies appliquées aux cellules souches, Centre médical technique, Université de Twente, Enschede, Pays-Bas

Anke R. Vollertsen & Andries D. van der Meer

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L'EGBMB a réalisé les expériences, fabriqué les conceptions et contribué à l'analyse des données et à la rédaction du manuscrit. ARV a réalisé les expériences et contribué à la conception expérimentale, à la configuration expérimentale et à la rédaction du manuscrit. JTZ a contribué à l'analyse des données, au post-traitement et à la rédaction du manuscrit. ADvdM a contribué à la rédaction, à l'édition et à la supervision du manuscrit. LIS et MO ont contribué à l'analyse des données, à la rédaction du manuscrit et à la supervision du projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Elsbeth GBM Bossink ou Mathieu Odijk.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Bossink, EGBM, Vollertsen, AR, Loessberg-Zahl, JT et al. Caractérisation systématique de macrovalves fabriquées sans salle blanche, démontrant des pompes et des mélangeurs pour la manipulation automatisée des fluides adaptés aux applications d'organes sur puce. Microsyst Nanoeng 8, 54 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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Reçu : 13 janvier 2022

Accepté : 18 mars 2022

Publié: 23 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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