Structure du photosystème cyanobactérien I complexé avec la ferrédoxine à une résolution de 1,97 Å

Oct 15, 2023

Communications Biology volume 5, Article number: 951 (2022) Citer cet article

2537 accès

4 Citations

23 Altmétrique

Détails des métriques

Le photosystème I (PSI) est une pompe à électrons pilotée par la lumière transférant des électrons du cytochrome c6 (Cyt c6) à la ferrédoxine (Fd). Une compréhension de ce processus de transfert d'électrons est entravée par un manque de détails structurels concernant l'interface PSI:Fd et les sites de liaison possibles de Cyt c6. Nous décrivons ici la structure cryo-EM haute résolution de Thermosynechococcus elongatus BP-1 PSI en complexe avec Fd et un Cyt c6 faiblement lié. Les interactions des chaînes latérales à l'interface PSI:Fd, y compris les molécules d'eau pontantes, sont visualisées en détail. La structure explique les propriétés des mutants de PsaE et PsaC qui affectent la cinétique de la liaison du Fd et suggère un interrupteur moléculaire pour la dissociation du Fd lors de la réduction. Les analyses thermodynamiques basées sur la calorimétrie confirment un site de liaison unique pour Fd et démontrent que la complexation PSI:Fd est purement motivée par l'entropie. Un cycle de réaction possible pour le transfert efficace d'électrons de Cyt c6 à Fd via PSI est proposé.

La photosynthèse oxygénique consiste en des réactions claires et sombres, dont la première part de l'absorption de photons et entraîne la chaîne photosynthétique de transport d'électrons provenant de l'eau jusqu'à la protéine porteuse d'électrons finale, la ferrédoxine1 (Fd). Quatre grands complexes de protéines membranaires, le photosystème II2, le cytochrome (Cyt) b6f3, le photosystème I4 (PSI) et le complexe de type NADH I5 (NDH-1) opèrent dans la chaîne de transport d'électrons au sein de la membrane thylakoïde. La plastoquinone, la plastocyanine (Pc), la Cyt c6 et la ferrédoxine (Fd) agissent comme des transporteurs d'électrons mobiles pour faire la navette entre ces complexes membranaires. Ces porteurs d'électrons forment des complexes transitoires avec leurs partenaires redox. Les événements de transfert d'électrons doivent être séquentiels, se produire avec un haut degré de spécificité et d'une manière cinétiquement efficace. En bref, le taux de transfert d'électrons est la clé des performances maximales de la réaction électrochimique complète. Les interactions intermoléculaires de molécules organiques lipophiles, analogues de la plastoquinone ou de la quinone, entre le photosystème II et la Cyt b6f ont été bien caractérisées par la cinétique6 et la cristallographie aux rayons X7. Cependant, les interactions protéine-protéine des transporteurs d'électrons solubles dans l'eau Pc et Fd avec Cyt b6f, PSI et NDH-1 sont difficiles à étudier en raison de la grande taille moléculaire des structures redox-dépendantes.

Le PSI exécute une séparation de charge rapide guidée par la lumière pour le transfert d'électrons à travers la membrane thylakoïde8. Avec un rendement quantique proche de 100 %, le PSI est le convertisseur d'énergie le plus efficace que l'on trouve dans la nature9. En utilisant l'énergie d'excitation qui lui est canalisée par les pigments d'antenne environnants dans le centre de réaction PSI, la séparation de charge a lieu au niveau d'une paire de molécules de chlorophylle a / chlorophylle a 'appelée P7004. L'électron activé est ensuite transféré à travers la chaîne de transfert d'électrons (ETC) et relayé via les clusters [4Fe-4S] FA et FB vers l'accepteur d'électrons soluble dans l'eau en aval Fd du côté stromal10. Le puissant réducteur Fd fournit des électrons à une variété de réactions en aval telles que la production de NADPH, l'assimilation d'azote et de soufre ou la désaturation des acides gras11. Le P700 oxydé est ensuite réduit par une protéine donneuse d'électrons luminale, Cyt c6 ou Pc, lançant le cycle suivant de transfert d'électrons12. Le PSI cyanobactérien est principalement un homotrimère, bien que des formes monomériques13 ou tétramériques14 soient présentes. Chaque protomère PSI comprend jusqu'à 12 sous-unités qui hébergent plus de 100 groupes prothétiques, qui représentent un tiers de la masse totale du complexe15. La structure aux rayons X du PSI cyanobactérien trimérique de Thermosynechococcus elongatus (anciennement Synechococcus elongatus) a été déterminée en 2001 à une résolution de 2,5 Å (PDB ID : 1JB04), et en 2018 celle de Synechocystis sp. PCC 6803 également à une résolution de 2,5 Å (PDB ID : 5OY016). Plus tard, plusieurs autres structures PSI, y compris des PSI de type plante verte complexées avec des protéines I de chlorophylle récoltant la lumière (LHCI), ont été révélées à une résolution plus élevée par cristallographie aux rayons X et également par microscopie électronique cryogénique (cryo-EM); à savoir, PSI-LHCI de pois à 2,4 Å (PDB ID : 7DKZ17), PSI-LHCI-LHCII (PDB ID : 7D0J18) d'algues vertes et deux complexes PSI-LHCI d'une diatomée à une résolution de 2,38 et 2,4 Å (PDB ID : 6LY519, 6L4U20). Après la révolution de la résolution21 en cryo-EM, deux autres structures cryo-EM de PSI cyanobactérien à une résolution légèrement plus élevée ont été publiées ; à savoir le PSI trimérique de Halomicronema hongdechloris C2206 à 2,35 Å (PDB ID : 6KMW22) et le PSI tétramérique d'un Anabaena sp. PCC7120 à 2,37 Å (ID PDB : 6K6114).

Pour mieux comprendre le mécanisme de transfert d'électrons transmembranaire lié au PSI, diverses méthodes telles que la co-cristallisation ou la réticulation chimique ont été appliquées au PSI avec son ou ses partenaires de transfert d'électrons. Fd:PSI a été cristallisé en 2002, bien qu'il s'agisse d'un complexe de transfert d'électrons non covalent23. En 2018, notre groupe a signalé la première structure aux rayons X d'un complexe Fd:PSI à une résolution de 4,2 Å24. La structure a confirmé les sites de liaison Fd du côté stromal du PSI, qui avaient été précédemment suggérés par mutagenèse dirigée25 et analyse cinétique26. Dans cette structure de rayons X Fd: PSI, la ferrédoxine substituée au gallium (Ga-Fd), dont la structure protéique est identique à celle du Fd27 natif, a été utilisée pour fixer l'état redox du Fd lié à la forme oxydée même lorsqu'il est éclairé par la lumière. . Récemment, plusieurs structures complexes de transfert d'électrons non covalentes de PSI déterminées par cryo-EM ont été signalées, telles que PSI: Fd (PDB ID: 7S3D28), le complexe PSI-IsiA avec de la flavodoxine liée (PDB ID: 6KIF29), et le triple complexe de Pc:PSI-LHCI:Fd (PDB ID : 6YEZ30). Cependant, la faible résolution locale des protéines porteuses mobiles liées a empêché une analyse détaillée au niveau des résidus, à l'exception du supercomplexe Pc: PSI-LHCI à 2, 74 Å (PDB ID: 6ZOO31) pour le mode de liaison du donneur d'électrons luminal Pc. Malgré des efforts considérables32 pour visualiser le complexe de transfert d'électrons de PSI : Cyt c6, jusqu'à présent, aucune structure aux rayons X ni cryo-EM du complexe PSI : Cyt c6 n'a été rapportée.

Des structures à plus haute résolution de PSI ainsi que ses donneurs et accepteurs d'électrons sous un état redox contrôlé sont nécessaires pour mieux comprendre les interactions protéine-protéine impliquées dans le système de relais d'électrons. Ici, avec des mesures thermodynamiques sur la liaison de Fd au PSI, nous décrivons la structure du PSI cyanobactérien de Thermosynechococcus elongatus BP-1 lié à ses partenaires de transfert d'électrons Fd et Cyt c6, analysé par cryo-EM à une seule particule à une résolution globale de 1,97 UN.

L'échantillon de trimère PSI purifié a été optimisé pour la cryo-EM à une seule particule par échange de détergent avec GDN33 et élimination de l'excès de détergent libre par GraDeR34, donnant une préparation hautement homogène à concentration élevée (Fig. 1a, b supplémentaires). Dans la première étape, les paramètres de préparation de la cryo-grille ont été optimisés pour l'imagerie haute résolution du trimère PSI seul. Une épaisseur de glace et une distribution de particules optimales ont été observées à une concentration de protéine trimère PSI de 30 mg/ml, tandis que la qualité de la cryo-grille s'est détériorée à des valeurs inférieures ou supérieures à cette concentration. Dans une deuxième étape, Ga-Fd a été ajouté au préalable pour une croissance cristalline optimisée pH légèrement basique de 8,0 et un rapport molaire de 1,0:1,1 (PSI:Fd)27, tandis qu'un rendement insuffisant pour la purification de Cyt c6 a limité son rapport molaire à 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6) résultant en un rapport molaire de 1,0:1,1:0,4 (PSI:Fd:Cyt c6) pour le triple mélange utilisé pour la préparation finale de la cryo-grille. Tout le criblage cryo-grille a été effectué à l'aide d'un cryo-TEM de 200 kV (Talos Arctica, TFS). Des cryo-grilles présentant de grandes zones d'épaisseur de glace vitreuse appropriée avec une densité de particules élevée (Fig. 2b supplémentaire) ont ensuite été transférées dans un cryo-TEM de 300 kV équipé d'un FEG froid, d'un filtre d'énergie Ω dans la colonne et d'un détecteur direct d'électrons K3 (CRYO BRAS 300, JEOL; Gatan). Le traitement d'image dans Relion 3.135 (Fig. 2 supplémentaire) a donné une carte de densité 3D finale calculée à partir de 207 142 particules à une résolution globale de 1,97 Å, qui était de qualité suffisante pour visualiser les densités de chaînes latérales et les molécules d'eau à l'interface de liaison PSI:Fd . Le tableau supplémentaire 1 décrit les statistiques de collecte, de raffinement et de validation des données cryo-EM. Les deux cartes post-traitées avec une symétrie C3 et C1 ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB36, numéro d'accession : EMD-31605). Les images brutes ont été téléchargées dans les archives d'images publiques de microscopie électronique (EMPIAR37, numéro d'accession : EMPIAR-10928).

Vu le long du plan de la membrane, le trimère PSI lié au Fd ressemble à la forme d'une feuille de trèfle avec un diamètre d'environ 200 Å et une masse totale de 1110 kDa (Fig. 1). Étant donné qu'aucune différence significative n'a été identifiée entre la carte de densité non symétrisée (C1) à 2, 07 Å et la carte symétrisée (C3) à une résolution de 1, 97 Å, cette dernière carte a été utilisée pour la construction du modèle atomique. La structure cristalline de PSI résolue à une résolution de 2, 5 Å (PDB ID 1JB04) et celle de Fd résolue à une résolution de 1, 5 Å (PDB ID 5AUI27) à partir d'allongements de T. ont été utilisées comme modèles de référence. Notre modèle (PDB ID: 7FIX) du complexe PSI: Fd a été affiné par rapport à la carte de densité finale déterminée à 1, 97 Å avec une symétrie triple stricte (C3) (Fig. 3 supplémentaire). Dans notre modèle, les 12 sous-unités de chaque protomère PSI de T. elongatus (PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, PsaI, PsaJ, PsaK, PsaL, PsaM et PsaX) ont été incluses en plus de trois Fds également liés à le côté stromal du trimère PSI à PsaA, PsaC et PsaE. Une vue rapprochée (Fig. 1a) montre le modèle atomique de Fd lié au PSI, qui correspond bien à la carte de densité correspondante. Le cluster [2Ga-2S] de Fd et le cluster [4Fe-4S] de FB dans la sous-unité PsaC, dessinés en forme de boule et de bâton, ont été positionnés à une distance bord à bord de 8, 9 Å.

Le modèle du complexe trimère PSI lié au Fd en symétrie C3 représenté avec chacun des trois protomères soit en surface grise, soit une surface colorée par les chaînes de sous-unités (PsaA-bleu, PsaB-rouge, PsaC-violet, PsaD-bleu clair, PsaE -vert, PsaF-jaune, PsaI-violet foncé, PsaJ-vert foncé, PsaK-rouge rosé, PsaL-blanc, PsaM-orange, PsaX-rose, Fd-cyan) ou coloré dans un style cartoon. Les ligands sont présentés séparément sous forme de sphère et de bâton, colorés en fonction de l'élément. a Vue rapprochée de l'interface de liaison de la ferrédoxine (Fd) et de la carte de densité correspondante pour Fd. b Chaînes d'acyle lipidique modélisées entre les protomères PSI et leur carte de densité correspondante.

La Fig. 4a supplémentaire montre la résolution locale de la carte de densité en vue de dessus et de côté. Pour chaque protomère PSI du côté luminal du trimère PSI du côté membrane de PsaB et à proximité de la région N-terminale de PsaF, une densité globulaire a été observée à un seuil de carte similaire à celui de la ceinture de détergent entourant le PSI. Les positions et les caractéristiques des trois densités sont identiques, elles étaient déjà présentes dans le modèle de novo initial (Fig. 2e supplémentaire) et proviennent très probablement de Cyt c6 faiblement lié. Ces trois densités n'ont pas amélioré la résolution ou la définition locale lorsqu'elles ont été soumises à une classification et à un raffinement 3D masqués. La modélisation à corps rigide de la structure cyanobactérienne Cyt c6 à l'aide de Phenix38 a montré que la densité était d'une taille suffisante pour Cyt c6 (Fig. 4b, c supplémentaires). Néanmoins, l'ambiguïté de son orientation nous a incités à ne pas modéliser le complexe ternaire de Fd:PSI:Cyt c6 dans nos coordonnées atomiques finales (7FIX) illustrées à la Fig. 1.

Le modèle complet contient un total de 39 chaînes polypeptidiques, 285 chlorophylle a, trois chlorophylle a′, 72 β-carotènes, six phylloquinones, neuf amas fer-soufre [4Fe-4S], trois ions Ca2+, neuf phosphatidylglycérols, trois digalactosyldiacylglycérols, 348 molécules d'eau et 51 lipides construits sans groupe de tête pour PSI, et trois polypeptides et trois clusters [2Ga-2S] pour Fd. Les différences notables par rapport à nos modèles de référence comprenaient l'identification du lipide II précédemment modélisé par le monogalactosyldiacylglycérol en tant que digalactosyldiacylglycérol, l'extension des chaînes acyle du lipide IV et un changement du résidu PsaL 143 d'une leucine à une sérine, qui correspond maintenant à l'entrée de la banque de données de séquence primaire pour PsaL. (UniProtKB - Q8DGB4). Notre carte nous a permis d'étendre les régions terminales de 39 résidus d'acides aminés, à savoir Lys11–Val12, Gly263–Ile265 dans PsaA, Gly740 dans PsaB, Thr5–Val19, Ala33, Pro44–Phe54, Gln78–Leu83 dans PsaK et Glu3 dans PsaL. . Nous n'avons observé aucune densité pour une chlorophylle liée à PsaM (CLA 1601 dans 1JB0), qui n'était pas incluse dans notre modèle. De plus, deux densités dans PsaK et PsaA ont été partiellement modélisées comme les β-carotènes nouvellement identifiés BCR102 de PsaK et BCR855 de PsaA. Cependant, étant donné que les deux densités ne montrent pas de bosses méthyliques claires de la chaîne polyène, nous ne pouvons pas exclure que ces densités proviennent d'autres espèces moléculaires similaires telles que les lipides. De plus, une nouvelle chlorophylle a été identifiée dans PsaJ et incluse dans notre modèle sous le nom de PsaJ CLA1307. Enfin, un total de 17 nouvelles chaînes acyles lipidiques pour chaque interface monomère-monomère pourraient être intégrées dans notre modèle (Fig. 1b). Tous les ajouts et modifications sont présentés dans la Fig. 5 supplémentaire avec des cartes et des modèles représentatifs (Fig. 6 supplémentaire).

Tous les composants de l'ETC, y compris [2Ga-2S] de Fd ainsi que leurs cartes de densité à l'exclusion de l'hème de Cyt c6, sont présentés à la Fig. 2 avec leurs distances intermoléculaires calculées soit en centre à centre (P700 à phylloquinone) ou bord à bord (phylloquinone à Fd [2Ga-2S]). Les branches A et B de l'ETC sont toutes deux composées de deux molécules de chlorophylle a et d'une phylloquinone étroitement empilées situées à égale distance (8,9 Å) du cluster [4Fe-4S] FX, qui est coordonné par PsaA et PsaB. PsaC héberge les clusters [4Fe-4S] FA et FB, les deux derniers composants de l'ETC, dont FB est l'accepteur d'électrons final et le point de transfert d'électrons vers les accepteurs d'électrons solubles ancrés, Fd ou Flavodoxine (Fld). La haute résolution locale de notre carte de densité PSI:Fd nous a permis de mesurer les distances des cofacteurs dans l'ETC avec un bon degré de confiance. Les distances bord à bord observées entre les phylloquinones et les trois clusters [4Fe-4S] sont en bon accord avec celles précédemment déterminées dans la structure cristalline aux rayons X de 2, 5 Å (PDB ID: 1JB0). La distance de 8,9 Å entre FB et [2Ga-2S] de Fd est suffisamment courte pour un effet tunnel d'électrons efficace et correspond aux distances trouvées dans le supercomplexe PSI-IsiA-Fld29. De plus, cette distance est également équivalente à la moyenne des trois distances différentes observées dans notre précédente structure cristalline de rayons X PSI:Fd24.

Les distances entre les cofacteurs ont été mesurées 'centre à centre' des atomes de magnésium des chlorophylles voisines au centre des anneaux carbonyle de la phylloquinone pour la branche A et la branche B (lignes pointillées) ou 'bord à bord' entre les phylloquinones et amas fer-soufre (traits pleins).

Dans notre structure, trois molécules Fd sont étroitement liées au côté stromal du trimère PSI. Même dans la carte profilée à un niveau de densité proche du bruit, aucune autre densité indicative de molécules Fd supplémentaires liées à d'autres sites stromaux de PSI ne peut être discernée. Chaque molécule Fd se lie à un protomère PSI de manière identique en contact étroit avec les sous-unités PsaA, PsaC et PsaE, alors qu'aucune interaction directe avec PsaD ou PsaF n'a pu être trouvée. La résolution locale d'environ 2,5 Å et les caractéristiques cartographiques bien définies à l'interface PSI:Fd nous ont permis de modéliser en toute confiance les chaînes latérales d'acides aminés et plusieurs molécules d'eau. Les résidus d'acides aminés et les molécules d'eau impliqués dans l'interaction directe à l'interface PSI:Fd ont été définis à l'aide du programme DIMPLOT de la suite LigPlot+39, 40. D'après l'analyse DIMPLOT, un total de 18 résidus dans les sous-unités PSI (Arg36, Arg40, Thr60 de PsaA ; Ile11, Gly12, Gln15, Arg18, Lys34, Ala35, Ala56, Pro58 de PsaC ; Arg3, Ile37, Arg39, Ser53, Asn56 , Thr57, Asn59 de PsaE) et 20 résidus dans Fd (Ser60, Asp61, Asp67, Ile70 de PsaA ; Phe38, Ser39, Cys40, Ala44, Cys45, Thr47, Phe64, Tyr97 de PsaC ; Glu23, Tyr24, Asp27, Glu31, Cys40 , Arg41, Ala42, Ser63 de PsaE) ont été identifiés comme étant impliqués dans les interactions de liaison (Fig. 3 et Fig. 7 supplémentaire). Quatre résidus (Glu23, Asp27, Phe38, Thr47) dans Fd ont été nouvellement identifiés comme étant impliqués dans l'interaction de liaison, alors que quatre résidus de Fd précédemment attribués pour interagir avec PSI (Gln62, Asp66, Glu71, Tyr81)24 n'ont pas été trouvés pour le faire dans cette étude. Un total de six molécules d'eau pontantes (HOH202 à Fd:PsaA, HOH203, HOH204, HOH205 à Fd:PsaC, HOH101, HOH201 à Fd:PsaE) ont été identifiées près de la surface de liaison, offrant des liaisons hydrogène potentielles entre PSI et Fd. Une comparaison des résultats de la cristallographie aux rayons X, de la saturation croisée transférée par RMN et de cette étude sur la question de savoir quels résidus de Fd interagissent avec le PSI lors de la liaison est présentée à la figure 4.

Chaque interface impliquée dans la reliure est présentée séparément dans un style livre ouvert. Les résidus d'acides aminés et les molécules d'eau en interaction directe sont marqués. a, b Pour Fd:PsaA, c, d pour Fd:PsaC, e, f pour Fd:PsaE. Les résidus nouvellement identifiés impliqués dans l'interaction sont marqués en rouge. Toutes les surfaces des protéines sont colorées en fonction du potentiel électrostatique (positif en bleu, négatif en rouge).

Les résidus interactifs ont été déterminés par une diffraction des rayons X PSI: Fd co-cristallisée (PDB ID: 5ZF024), b Cryo-EM (cette étude) et une saturation croisée transférée par RMN c. Les résidus uniques déterminés par chaque méthode sont mis en évidence par les étiquettes correspondantes (les résidus sur la face dorsale ont été omis).

Deux interfaces de liaison PSI: Fd importantes sont illustrées à la Fig. 5. Une paire d'interactions cation-π entre Phe38 de Fd avec Lys34 de PsaC et Arg41 de Fd a été identifiée (Fig. 5a). Arg39 de PsaE, qui interagit avec Arg41 de Fd par des interactions hydrophobes, crée des interactions supplémentaires avec Asp27 et Tyr24 de Fd. Le résidu Gln15 de PsaC forme le plus grand nombre d'interactions intermoléculaires entre PSI et Fd, et peut être stratégiquement situé à proximité de clusters donneurs et accepteurs d'électrons (Fig. 5b). Gln15 de PsaC est engagé dans des interactions hydrophobes avec Cys45 et Phe64 de Fd et établit également une liaison hydrogène avec Ala44. De plus, via une liaison hydrogène avec HOH205, Gln15 de PsaC est connecté au C-terminal Tyr97 de Fd. Tyr97 crée à son tour une interaction cation-π avec Arg18 de PsaC. Tyr97 de Fd présente une densité bien définie, ce qui est surprenant étant donné la flexibilité connue de l'extrémité C-terminale (Fig. 8 supplémentaire), indiquant de fortes interactions entre Fd Tyr97 et PsaC.

un Nexus d'interactions qui contribuent à l'affinité de liaison de PSI avec Fd. Les résidus PSI cruciaux Lys34 de PsaC et Arg39 de PsaE et leurs partenaires de liaison Fd respectifs sont mis en évidence. PsaC en ruban violet, PsaE en ruban vert, Fd en ruban cyan et leurs atomes de chaîne latérale de résidus en interaction en boule et bâton avec leur densité correspondante en silhouette. b Hub d'interactions autour de Gln15 de PsaC et avec Cys45, Phe64 et Tyr97 de Fd. Ces résidus subissent un changement conformationnel lors de la réduction de Fd. PsaC en ruban violet, Fd en ruban cyan et atomes de chaîne latérale de résidus en interaction en boule et bâton avec leur densité correspondante en silhouette. L'eau interfaciale 205 est représentée par une boule rouge. Le cluster fer-soufre FB de PSI et le cluster gallium-soufre de Fd sont représentés sous forme de boule et de bâton.

Pour visualiser les changements structurels dynamiques lors de la formation complexe entre PSI et Fd, nous avons utilisé des "modevectors" de script python exécutés sur le système graphique moléculaire PyMOL (version 2.3.2, Schrödinger, LLC). Sur la figure 6, des modèles atomiques de PSI avant (ID PDB : 1JB0) et après la liaison Fd (étude en cours, ID PDB : 7FIX) ont été superposés en fonction des positions du carbone α de l'hétérodimère stable PsaA / PsaB. Les déplacements des carbones α> 0, 7 Å avant et après la formation du complexe sont mis en évidence par des pointes de flèche pour un protomère. Étant donné que des chaînes latérales individuelles peuvent être impliquées dans l'emballage cristallin pour les structures à rayons X de PSI ou de Fd, nous avons intentionnellement utilisé les positions de carbone α des structures de chaîne principale à des fins de comparaison et les modèles de bâton Cα sans chaînes latérales ont été illustrés à la Fig. 6 L'analyse montre que les perturbations causées par la liaison Fd et la présence de Cyt c6 ne se limitent pas au côté stromal, mais se propagent également au côté luminal. En comparant le modèle atomique de Fd dans notre structure complexe (PDB ID : 7FIX) au modèle atomique de Fd libre (PDB ID : 5AUI27) en affichant des déplacements > 0,7 Å au carbone α (Fig. 6c), nous avons trouvé que la région proximale du cluster est restée non perturbée alors que trois régions distales (dans les cercles en pointillés) ont subi des changements structurels après la liaison au PSI.

a, b, d La liaison Fd a induit des déplacements structurels dans un protomère PSI de trois points de vue différents. Le modèle atomique de PSI sans Fd (PDB ID : 1JB04) a été superposé à notre modèle de PSI : Fd (PDB ID : 7FIX) basé sur les coordonnées du squelette Cα de l'hétérodimère PsaA/PsaB. Les flèches rouges représentent les déplacements au-delà de 0,7 Å. c Déplacements structurels de Fds à l'état libre et lié au PSI. Le modèle atomique de Fd non lié (PDB ID : 5AUI27, coloré en orange) a été superposé avec le Fd lié au PSI (coloré en cyan). Les flèches rouges mettent en évidence les déplacements de la chaîne principale au-delà de 0,7 Å.

Des mesures de calorimétrie de titrage isotherme (ITC) ont été effectuées pour obtenir des paramètres thermodynamiques pour l'interaction entre Ga-Fd et le trimère PSI. Pour éviter les interférences potentielles des micelles de détergent libres avec les mesures ITC41, les échantillons de trimère PSI ont été préparés en utilisant l'approche GraDeR34 comme cela a été fait pour la cryo-EM à une seule particule. Les résultats représentatifs des thermogrammes ITC, l'isotherme de liaison des interactions entre Ga-Fd et le trimère PSI et les paramètres thermodynamiques sont présentés à la Fig. 7 et au tableau 1. Les analyses ITC démontrent que la valeur de stoechiométrie de liaison est d'environ 3 (2,9 ± 0,2) , indiquant que Fd est lié à chaque protomère PSI dans un rapport de 1:1 ; ce qui est en accord avec notre carte de densité cryo-EM. La valeur de Kd était de l'ordre sub-micromolaire (758,0 ± 123,5 nM), suggérant que l'affinité inter-protéine entre Ga-Fd et PSI est forte. Une série de titrages de Ga-Fd en trimère PSI a généré des pics ITC positifs suivis d'une saturation progressive (Fig. 7a), indiquant les interactions intermoléculaires endothermiques entre Ga-Fd et PSI. Dans l'ensemble, les interactions Fd-PSI ont montré une valeur ΔH positive thermodynamiquement défavorable (1, 1 ± 0, 1 kcal / mol) et une valeur TΔ S positive plus forte (9, 5 ± 0, 1 kcal / mol), démontrant que la formation de complexes est axée sur l'entropie.

a Résultats représentatifs des thermogrammes ITC, b L'isotherme de liaison ajusté à l'aide d'un ensemble de sites.

Notre structure cryo-EM du complexe PSI:Fd est basée sur une carte de densité avec une symétrie de rotation triple stricte à une résolution globale de 1,97 Å. L'amélioration de la résolution pourrait être le résultat de quatre facteurs : (i) une pureté et une homogénéité exceptionnelles de notre préparation PSI à haute concentration, (ii) un état redox strictement contrôlé du complexe de transfert d'électrons transitoire PSI:Fd et la présence de Cyt c6 ( iii) préparation optimisée du complexe de protéines membranaires à l'aide de la méthode GraDeR, et (iv) utilisation d'un microscope cryoélectronique avancé CRYO ARM 300 équipé d'un pistolet à émission à champ froid, d'un filtre d'énergie Ω dans la colonne et d'une caméra de détection directe K3 ( JEOL, GATAN). Une découverte remarquable de notre carte cryo-EM haute résolution est la visualisation de plusieurs densités en forme de bâton entre chaque protomère PSI (Fig. 1b et Fig. 5 supplémentaire), indiquant un emballage stable et spécifique des queues lipidiques. Bien que les membranes thylakoïdes contiennent divers lipides, notamment PG, MGDG, DGDG et SQDG42, la structure originale aux rayons X de 2, 5 Å ne décrivait que trois phospholipides et un galactolipide liés de manière interne aux principales sous-unités PsaA et PsaB. Au total, dix-sept queues d'acides gras nouvellement identifiées ont été trouvées dans notre structure malgré l'exclusion des densités ambiguës qui ne pouvaient pas être clairement distinguées des chaînes de phytol de la chlorophylle ou qui étaient trop courtes ou non perpendiculaires au plan de la membrane. Ces lipides inter-protomères nouvellement découverts n'ont pas été attribués à des types spécifiques en raison de leurs densités de groupe de tête manquantes, ce qui indique leur mobilité. Les queues d'acides gras visibles étaient étroitement attachées aux résidus d'acides aminés hydrophobes et aux ligands d'antenne (chlorophylles et caroténoïdes), ce qui implique leur fonction potentielle dans la stabilisation de la trimérisation du PSI. Ces résultats expliquent les écarts entre le nombre de lipides associés déterminés par les analyses structurales et biochimiques43. En effet, nos découvertes suggèrent une fonction supplémentaire des lipides dans le resserrement structurel de l'interface protomère pour permettre la formation stable de PSI oligomère et pour accueillir les ligands d'antenne saillants, en particulier dans la région inter-protomère. A ce jour, ces aspects n'ont jusqu'à présent été considérés en détail que pour la structure du PSII2, 44.

Ici, nous décrivons la structure cryo-EM haute résolution du PSI cyanobactérien en présence de Fd oxydé et de Cyt c6 réduit. L'échantillon pour la détermination structurale a été préparé en mélangeant les trois protéines sans réticulation et uniquement par une brève incubation dans l'obscurité avant la préparation de la cryo-grille. De plus, nous avons utilisé du Fd substitué par du gallium (Ga-Fd), qui est structurellement identique au Fd oxydé de type sauvage mais ne peut pas être réduit27, 45. L'état redox uniforme résultant du côté accepteur du PSI élimine la possibilité de réactions redox inattendues. entre Fd et PSI déclenchée par l'absorption de la lumière. Par conséquent, l'état redox du complexe était celui du PSI juste avant le transfert d'électrons du PSI au Fd. Dans cette étude, nous avons cependant pu visualiser des densités supplémentaires faibles pour les trois protomères PSI positionnés de manière identique au voisinage de la région N-terminale de PsaF attribuée à Cyt c6 (Fig. 4b, c supplémentaires) qui étaient déjà clairement présentes dans le Modèle initial 3D de novo de notre structure cryo-EM (Fig. 2e supplémentaire). La très faible résolution locale pourrait être une conséquence de la faible stoechiométrie de 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6) dans le mélange utilisé pour la préparation de la cryo-grille. Cependant, la visualisation infructueuse précédemment tentée pour Cyt c6 lié au trimère PSI de T. elongatus à la stoechiométrie PSI:Cyt c6 beaucoup plus élevée de 1:10 dans des conditions de tampon réducteur et en présence d'un agent de réticulation32 suggère que la stoechiométrie et l'état redox de le tampon d'échantillon seul pourrait ne pas être suffisant pour expliquer le seul niveau proche du bruit de la densité extra-luminale détectée ici.

Étonnamment, Cyt c6 n'a pas été trouvé à proximité de l'accepteur d'électrons primaire de P700 en PSI (distance centre à centre P700 à Cyt c6 ~ 55 Å) mais à une distance suffisante pour empêcher un transfert d'électrons productif. Bien que le manque de résolution locale ait empêché la détermination de l'orientation de Cyt c6, nous pensons que le site lui-même est un site de liaison secondaire physiologiquement pertinent pour Cyt c6 qui diffère clairement de celui de la plastocyanine visualisé dans la structure PSI:Pc récemment rapportée (PDB ID : 6ZOO31). Dans la structure de PSI:Pc, Pc s'est avéré se lier à la surface hydrophobe créée par les sous-unités PsaA et PsaB, et l'extension N-terminale de PsaF spécifique à la plante vacuolaire a placé Pc près de P700 suffisamment près pour un transfert d'électrons productif. Étant donné que les cyanobactéries ne contiennent pas d'extension N-terminale de la sous-unité PsaF pour la liaison productive Pc/Cyt c6, il semble peu probable que la cyanobactérie Cyt c6 se lie à une position similaire à celle des plantes supérieures. Les tentatives précédentes de visualisation de PSI avec Cyt c6 lié par réticulation ont échoué32 et à notre connaissance, les densités cryo-EM de Cyt c6 dans notre étude sont la première visualisation expérimentale de Cyt c6 lié à PSI sur ce site périphérique non productif.

Quelle pourrait être la fonction physiologique de ce site de liaison Cyt c6 nouvellement découvert ? Le site de liaison Cyt c6 est clairement différent du site de liaison productif Pc/Cyt c6. Les résultats de l'analyse cinétique de transfert d'électrons à partir d'algues vertes et de plantes supérieures ont indiqué des caractéristiques biphasiques46, 47 : une phase de transfert d'électrons rapide pertinente pour la réduction de P700 ; et une phase lente responsable du temps de diffusion de Pc/Cyt c6 dans l'espace luminal vers les centres réactionnels du PSI. La base structurelle de cette cinétique biphasique a été attribuée à l'extension N-terminale riche en Lys de PsaF d'algues vertes46. Récemment, une structure cryo-EM de PSI de Chlamydomonas reinhardtii a montré une densité supplémentaire du côté luminal du complexe qui suggère une liaison non productive de Pc48. Cette région supplémentaire offre des sites d'interaction électrostatique aux protéines donneuses d'électrons, ce qui joue un rôle clé pour les guider vers le centre de réaction P700. Le résultat hétérogène de la réticulation et les caractéristiques cinétiques ont indiqué l'existence de sites de liaison productifs et non productifs49. Le test de réticulation50 réalisé chez Chlamydomonas reinhardtii a donné un résultat similaire. Plus précisément, seuls 33% de Cyt c6 ont effectué un transfert d'électrons rapide vers P700, tandis que les 67% restants de réticulation inactive ont indiqué l'existence d'un site de liaison supplémentaire potentiel. Ces sites de liaison non productifs peuvent être trop éloignés de P700 pour le transfert d'électrons, mais garantissent néanmoins un approvisionnement rapide et continu en donneurs d'électrons. Une fonction possible du site de liaison Cyt c6 visualisé ici pourrait être un site de liaison non productif, analogue à celui trouvé dans les plantes vasculaires.

L'existence de la réaction en deux phases chez les cyanobactéries a été contestée étant donné que la PsaF cyanobactérienne ne contient pas l'extension N-terminale trouvée dans la PsaF des algues vertes et des plantes supérieures12. Récemment, cependant, une étude cinétique de réduction de P700 in vivo sur le PSI de Synechocystis sp. PCC6803 a montré des caractéristiques cinétiques similaires à celles des algues vertes et des plantes supérieures51. La réaction en deux phases pourrait être la conséquence d'une liaison non productive des donneurs d'électrons (Pc et Cyt c6) du côté luminal du PSI cyanobactérien. L'absence d'extensions dans le PsaF cyanobactérien peut rendre la liaison Cyt c6 spécifique mais flexible, ce qui pourrait fournir une explication supplémentaire à la résolution limitée de Cyt c6 dans notre carte de densité. Cette proposition est cohérente avec la faible résolution locale de Pc liée sur le site non productif de Chlamydomonas PSI48. Cela pourrait également expliquer pourquoi, dans la précédente étude cryo-EM de Kölsch et al.32 sur T. elongatus PSI, la réticulation de PSI et de Cyt c6 combinée à un raffinement 3D masqué n'a pas localisé les densités potentielles de type Cyt c6 dans la région associée. du côté luminal PSI malgré la stoechiométrie beaucoup plus élevée de Cyt c6 à PSI (10: 1) utilisée. Par conséquent, nous supposons qu'une différence évidente entre l'étude de Kölsch et al.32 et la nôtre est l'ajout de Ga-Fd. Cela suggère que le statut de liaison de l'accepteur d'électrons (dans notre cas, Fd) du côté stromal du PSI peut être crucial pour la liaison de la protéine donneuse d'électrons (dans notre cas, Cyt c6) du côté luminal et par conséquent la possibilité de le visualiser. Ainsi, l'état de transfert d'électrons du côté stromal du PSI pourrait affecter le mode de liaison des donneurs d'électrons du côté luminal via une signalisation transmembranaire basée sur l'altération conformationnelle. Les études futures qui se concentrent spécifiquement sur l'optimisation de la liaison spécifique de Cyt c6 à taux d'occupation élevé permettront, espérons-le, de clarifier ces aspects du transfert d'électrons médié par le PSI cyanobactérien.

La liaison du Fd au PSI a été étudiée en détail par mutagenèse des sous-unités stromales. Ces études ont identifié des résidus clés impliqués dans les interactions qui permettent un transfert rapide d'électrons inter-protéines (résumés dans le tableau supplémentaire 2). Notre modèle atomique fournit la base structurelle du rôle important joué par ces résidus d'acides aminés clés et peut expliquer leurs effets mutationnels. À l'interface de liaison Fd sur PsaE, les interactions clés précédemment établies de Arg3952, dont la mutation en glutamine perturbe complètement la liaison de Fd, sont maintenant rationalisées par son interaction électrostatique avec Asp27 et ses interactions hydrophobes avec Tyr24 et Arg41 de Fd (Fig. 5a et Fig. 7c supplémentaire). À l'interface avec PsaC, Lys34 est engagé dans des interactions hydrophobes avec Phe38 de Fd, ce qui explique l'incapacité du mutant PsaC K34D25, 53 à former l'interaction cruciale cation-π, perturbant complètement le transfert rapide d'électrons (Fig. 5a). De plus, à l'interface de liaison Fd de PsaC près du cluster fer-soufre FB, Gln15 montre des interactions directes étendues avec Ala44, Cy45, Phe64, et aussi indirectement avec Tyr97 via la molécule d'eau HOH205 (Fig. 5b), qui a également été identifié comme l'un des deux patchs d'interaction clés pour une liaison efficace de Fd54 (Fig. 5).

Une question importante dans le transfert d'électrons médié par PSI est de savoir comment le Fd lié réalise une dissociation rapide de son site de liaison PSI après avoir reçu un électron. La structure cristallographique aux rayons X à haute résolution d'Anabaena Fd dans son état oxydé et réduit55 a suggéré que les principaux changements structurels lors de la réduction impliquent un retournement de la liaison peptidique entre Cys45 et Ser46 (numérotation de T. elongatus), un déplacement de la chaîne latérale de Phe64 et mouvement de chaîne latérale du C-terminal Tyr97. Le lien d'interactions entre PSI et Fd visualisé dans notre structure centrée autour de Gln15 de PsaC est perturbé par ces changements conformationnels induits par la réduction (Fig. 5b). Le retournement du plan peptidique romprait par lui-même l'interaction entre Fd-Cys45 et PsaC-Gln15 et le déplacement résultant de Phe64 pourrait également perturber l'interaction avec Gln15. Enfin, le mouvement du Tyr97 C-terminal pourrait déloger les liaisons hydrogène médiées par l'eau associées à Gln15. Le coût énergétique enthalpique de la perte de ce noyau d'interactions formé par Gln15 pourrait alors être suffisant pour déplacer l'équilibre énergétique vers la dissociation. Ainsi, notre structure de l'interface PSI: Fd à proximité immédiate des amas fer-soufre engagés dans le transfert d'électrons inter-protéines fournit un scénario convaincant pour expliquer le mécanisme de dissociation induite par le transfert d'électrons du Fd du PSI.

Dans cette étude, nous avons utilisé les structures cristallines du PSI de type sauvage (PDB ID : 1JB04) et du Fd de type sauvage de T. elongatus BP-1 (PDB ID : 5AUI27) comme référence de départ pour la modélisation et le raffinement. Bien que certaines différences provenant de l'amélioration significative de la résolution aient été trouvées par rapport à notre analyse précédente24 par cristallographie aux rayons X à une résolution de 4,2 Å et RMN (PDB ID : 5FZ0, BMRB : 11596, Fig. 1), les différences observées dans les résidus en interaction entre Fd et PSI sont mineurs et en accord avec notre interprétation précédente. Ici, nous avons pu inclure pour la première fois des informations sur la chaîne latérale dans l'attribution des interactions de Fd avec PSI. Dans notre précédente structure aux rayons X du complexe PSI:Fd, nous avions conclu que PsaD n'interagissait pas avec Fd, mais cette observation était en contradiction avec les résultats de la mutagenèse dirigée chez Synechocystis PSI56. Cependant, notre structure cryo-EM haute résolution mise à jour corrobore désormais fortement l'absence d'interaction entre PsaD et Fd étroitement lié. Sur la base de notre structure cristalline aux rayons X du complexe PSI: Fd, nous avons précédemment proposé que le PsaF cyanobactérien puisse agir comme un transducteur de signal transmembranaire activé par la liaison Fd24. Bien que les changements structurels observés ne soient que faibles, l'absence de contacts de réseau avec des voisins cristallographiques dans cette étude, qui a également visualisé des changements structurels en PSI lors de la liaison de Fd et en présence de Cyt c6 à la fois du côté stromal et luminal (Fig. 6) , soutient notre précédente proposition basée sur la structure cristalline des rayons X selon laquelle de petits changements structurels transmembranaires pourraient signaler la liaison de Fd au côté luminal. Bien que la pertinence physiologique des changements structurels détectés ici ne puisse être établie, l'idée d'un système de relais transmembranaire pour la coordination du transport d'électrons à travers le PSI reste attrayante.

Étonnamment, six molécules d'eau assurant la médiation des liaisons hydrogène entre Fd et PSI peuvent être visualisées dans la structure (Fig. 3 et Fig. 7 supplémentaire). Avant la formation du complexe, le Fd et les sous-unités stromales du PSI doivent être complètement hydratés par le solvant. Après avoir formé le complexe de transfert d'électrons spécifique entre Fd et PSI, les molécules d'eau des coquilles d'hydratation, à l'exception des six molécules d'eau restantes, doivent être exclues de l'interface. Pour obtenir des informations thermodynamiques sur la formation complexe de Fd avec PSI, y compris les molécules d'eau hydratantes, des mesures ITC ont été effectuées. D'après l'analyse des paramètres thermodynamiques, la formation du complexe Fd:PSI s'apparente à celle du type Fd:FNR57 et du type Fd:GmHO58 (ΔH > 0 et ΔS > 0) mais pas à celle du type Fd:SiR59 (ΔH < 0 et ΔS > 0). La liaison de Fd à sa protéine partenaire (dans ce cas, PSI) semble être entièrement déterminée par l'entropie. Des interactions électrostatiques attrayantes, des interactions polaires et des interactions commandées par la force de Van der Waals pourraient contribuer à un ΔH négatif (ΔH <0), mais le détachement des molécules d'eau liées aux interfaces pour la complexation de Fd et PSI coûtera thermodynamiquement pour donner une valeur positive pour le ΔH net (ΔH > 0), comme également observé dans la formation du complexe Fd:FNR57, 60. Néanmoins, le désordre conformationnel accompagnant le déplacement des molécules d'eau de l'interface peut rendre la formation complexe énergétiquement favorable en raison de l'augmentation associée de l'entropie. L'analyse ITC démontre une forte affinité inter-protéine entre Ga-Fd et PSI avec une valeur de Kd d'environ 0,8 μM, ce qui correspond étroitement à l'affinité du Fd natif pour le PSI telle que mesurée par spectroscopie d'absorption flash24. Enfin, la stoechiométrie de liaison (valeur n) calculée sur la base des résultats de mesure ITC était d'environ trois, ce qui signifie qu'un Ga-Fd se lie à un protomère PSI en solution, ce qui est cohérent avec les résultats de notre structure cryo-EM.

Sur la base d'analyses cinétiques et de notre étude structurelle mise à jour, nous proposons un mécanisme de formation de complexes de transfert d'électrons impliquant cinq étapes comme suit (voir également le dessin animé de la Fig. 8). (i) Fd et Cyt c6 sont initialement dans un état libre non lié avant le transfert d'électrons (Fig. 8a). (ii) Une fois qu'un événement de séparation de charge induit par la lumière se produit dans le PSI, le Fd oxydé s'approche du PSI pour se lier du côté stromal afin de recevoir l'électron excité. De fines altérations structurelles au sein du PSI déclenchées par la liaison de Fd sont transmises au côté luminal pour recruter Cyt c6 sur le site de liaison non productif (Fig. 8b). L'augmentation de l'affinité des sites de liaison non productifs pour Cyt c6 peut protéger le centre de réaction PSI d'une réduction excessive lorsque FA et FB sont dans un état réduit. (iii) PSI réduit Fd (Remarque, dans notre structure, Ga-Fd ne peut pas être réduit et donc Fd reste lié au PSI et Cyt c6 reste lié au site non productif (Fig. 8c)). (iv) Une fois que Fd est réduit par un électron excité puis se détache du PSI, Cyt c6 migrera vers le site de liaison productif proximal P700 pour un transfert d'électrons ultérieur (Fig. 8d). (v) Enfin, Cyt c6 oxydé se détache du PSI et un autre cycle de réactions de transfert d'électrons commence.

a Cyt c6 réduit et Fd oxydé sont à l'état libre non lié. b La séparation de charge induite par la lumière à travers la membrane provoque la liaison du Fd oxydé du côté stromal et ouvre des sites d'amarrage non productifs pour Cyt c6 du côté luminal. Le symbole rose en forme de cœur représente un site de liaison activé et le panneau de signalisation « fermé » représente un centre de réaction fermé. c Cyt c6 est lié aux sites d'amarrage luminaux non productifs tandis que le Ga-Fd oxydé en permanence reste lié du côté stromal avec le cadre en pointillés indiquant la structure déterminée dans cette étude. d L'électron excité a quitté le PSI avec son porteur soluble Fd et la Cyt c6 réduite s'est déplacée vers le site de liaison proximal productif P700 * pour le transfert d'électrons et le détachement ultérieur du PSI.

En résumé, nous proposons que le PSI s'engage dans deux types de mécanismes de liaison Pc ou Cyt c6 au centre de réaction. Un mécanisme implique la "pré-liaison" de Pc à l'extension N-terminale de PsaF comme observé pour Chlamydomonas reinhardtii. Le mécanisme alternatif implique une liaison "non productive" induite par la liaison Fd pour faciliter un transfert d'électrons efficace dans les cyanobactéries. Ces mécanismes de recrutement peuvent avoir évolué davantage pour fournir la base d'un transfert d'électrons efficace et robuste vers P700 dans les algues vertes et les plantes vasculaires.

Des cyanobactéries thermophiles de la souche mutante Thermosynechococcus elongatus BP-1, génétiquement modifiées avec une étiquette His10 N-terminale sur la sous-unité PsaF ainsi qu'un gène résistant au chloramphénicol comme marqueur sélectionnable, ont été cultivées sous illumination pour la purification des deux trimères PSI et Cyt c6. La culture a été réalisée sous illumination continue à 30 μM de photons m-2 s-1 à 50 °C dans du milieu BG11 comme décrit précédemment61. Un total de 16 L de culture a été récolté lorsque l'absorbance OD730 nm a atteint une valeur de un. Les trimères PSI marqués His ont été purifiés à partir de membranes thylakoïdes en utilisant la méthodologie décrite par Kubota et al.43 avec des modifications mineures comme décrit ci-dessous.

Les cellules récoltées ont été concentrées par centrifugation (8000 × g, 2 min à 4 °C, rotor JLA 9.1000, Avanti™ HP-26XP), remises en suspension dans le tampon A contenant 50 mM MES (pH 6,5), 25 % glycérol, 20 mM CaCl2 et 20 mM MgCl2, puis congelé pour stockage à -80 °C ou utilisé immédiatement pour la rupture cellulaire comme décrit précédemment62. Les cellules ont été rompues dans du tampon B pré-refroidi fraîchement préparé (mêmes composants que dans le tampon A avec l'ajout de 1 mM de benzamidine, 1 mM d'acide 6-aminohexanoïque, 1 mM de PMSF solubilisé dans de l'éthanol et 1 mM de DNase I) et les membranes des thylakoïdes ont été séparés du contenu cellulaire soluble par ultracentrifugation (40 000 × g, 30 min à 4 °C, rotor P50AT2, HITACHI himac CP80WX).

Les membranes thylakoïdes ont été remises en suspension dans le tampon A à une concentration de chlorophylle de 1 mg/mL, puis une solution mère de β-DDM à 10 % a été ajoutée goutte à goutte jusqu'à ce que la concentration de β-DDM atteigne 1 %. Le mélange est ensuite incubé dans le noir à 4°C sous agitation douce pendant 45 min. Après solubilisation de la membrane, le contenu insoluble a été éliminé par ultracentrifugation (50 000 × g, 30 min à 4 °C, rotor P50AT2, HITACHI himac CP80WX) et le surnageant a été appliqué sur une colonne ouverte avec Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Hilden, Allemagne) . Les trimères PSI ont été élues de la colonne en utilisant le tampon C contenant 20 mM de MES (pH 6,5), 20 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 0,05 % de β-DDM et 100 mM d'imidazole. Les trimères PSI élués ont été concentrés par ultrafiltration à 3000 × g, 4 ° C (tubes d'ultrafiltration Amicon15, MWCO 100 kDa; Amicon, Miami, FL, États-Unis) jusqu'à une concentration finale de chlorophylle d'environ 10 mg / ml.

L'approche GraDeR34 a été appliquée pour échanger le détergent β-DDM en glyco-diosgénine (GDN) et pour éliminer l'excès de détergent libre. Pour ce faire, un gradient par étapes de saccharose a été préparé avec des concentrations de saccharose de 1,7 M, 1,3 M, 0,9 M, 0,5 M et 0,1 M de bas en haut, et un GDN de 0,1 %, 0,05 %, 0,03 % 0,01 %, et 0,005 % de bas en haut. Après centrifugation en gradient de densité de saccharose (25 000 × g, 20 h à 4 ° C, rotor P28S, HITACHI himac CP80WX, résultat voir Fig. 1a supplémentaire), les trimères PSI de la bande correspondante ont été collectés et une colonne de dessalement (PD-10, GE Healthcare, Chicago, IL, USA) a été utilisé pour éliminer le saccharose et pour l'échange de tampon. Les trimères PSI finaux ont été concentrés à une concentration de chlorophylle de 10 mg/mL dans du tampon D (Tricine 10 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM et GDN 0,005 %) et examinés pour la pureté, la stabilité et la monodispersité à l'aide d'une microscopie électronique à coloration négative comme décrit dessous. L'échantillon final de trimère PSI a été congelé dans de l'azote liquide en aliquotes de 10 μL à l'aide de tubes EP photophobes et stocké jusqu'à une utilisation ultérieure à -80 ° C. La concentration en protéines du trimère PSI a été déterminée sur la base du rapport de teneur en chlorophylle de CPro/CChl = 3,92.

La qualité des échantillons de protéines PSI a été évaluée par une coloration négative. Une aliquote de 3,5 μL de l'échantillon final a été diluée au 1/100 et appliquée sur des grilles de cuivre revêtues d'un film de carbone continu à décharge luminescente (5 mA, 10 s, Eiko) (Nisshin EM, Tokyo, Japon). La coloration a été réalisée en appliquant 3,5 μL d'une solution d'acétate d'uranyle à 2 %. Après incubation pendant 30 s, la solution de coloration a été buvardée à l'aide d'un papier filtre (Whatman # 1; Whatman, Little Chalfont, Royaume-Uni) et séchée à température ambiante. Les grilles EM ont été inspectées à l'aide d'un microscope électronique à transmission H-7650 HITACHI à une tension d'accélération de 80 kV équipé d'une caméra CCD 1 × 1K Tietz FastScan-F114. Une micrographie de coloration négative typique de particules PSI trimériques est présentée dans la Fig. 1b supplémentaire.

Le surnageant obtenu par rupture des cellules BP-1 de T. elongatus et ultracentrifugation comme décrit ci-dessus a été utilisé pour l'isolement de Cyt c6 sur la base d'une méthode de purification précédente avec quelques modifications. Du sulfate d'ammonium solide (AS) a été progressivement ajouté à 25 °C au surnageant jusqu'à ce que la saturation atteigne 45 %. Après agitation pendant 45 min à 25 °C, le précipité a été éliminé par centrifugation (9500 x g, 30 min à 25 °C, rotor JLA 9.1000, Avanti™ HP-26XP). Le surnageant résultant a été chargé sur une colonne de chromatographie d'interaction hydrophobe (HiTrap® Phenyl HP) pré-équilibrée avec un tampon contenant 10 mM de tricine (pH 7,5) et 45 % d'AS à l'aide d'un système de chromatographie liquide Fast Protein (FPLC, ÄKTA explorer). Les fractions contenant Cyt c6 ont été éluées en diminuant la concentration en AS à environ 20 %. Après dessalage sur colonne (PD-10, GE Healthcare), les fractions ont été échangées dans un tampon contenant 10 mM Tricine (pH 7,5) et 10 mM NaCl, et chargées sur une colonne échangeuse d'anions (HiTrap® Q HP) pré-équilibrée avec le même tampon. La protéine liée a été éluée en augmentant la concentration de NaCl à environ 100 mM et les fractions avec une coloration rose ont été regroupées. L'échantillon regroupé a ensuite été soumis à une étape finale de chromatographie par filtration sur gel (Superose® 75 16/60) en utilisant un tampon courant contenant 30 mM de tricine (pH 8,0) et 10 mM de MgCl2. La qualité de l'échantillon et l'état redox ont été évalués en mesurant le rapport d'absorbance OD553nm/OD273nm sur la base d'un protocole précédemment publié64 et les propriétés d'absorbance ont été caractérisées par spectroscopie d'absorbance UV-Vis. La couleur rose foncé et le pic d'absorption caractéristique à 553 nm ont vérifié l'état réduit de Cyt c6 purifié par rapport aux résultats spectroscopiques précédents65 de Cyt c6 réduit. L'analyse SDS-PAGE de Cyt c6 purifié est présentée dans la Fig. 1c supplémentaire.

Un fragment d'ADN codant pour la ferrédoxine BP-1 native de T. elongatus (Fd) a été cloné dans le vecteur pET28a (Novagen, Madison, WI, USA) à l'aide des sites de restriction NcoI-BamHI et exprimé à l'aide de la souche Escherichia coli BL21(DE3) cultivée à Luria - Milieu Bertani (LB). La purification de Fd et la substitution ultérieure de son cluster natif [2Fe-2S] par le cluster inerte redox [2Ga-2S] ont été effectuées comme décrit précédemment27. En bref, les cellules ont été récoltées par centrifugation, remises en suspension dans un tampon contenant 50 mM de Tris (pH 7,5) et 10 % de glycérol. Après rupture cellulaire par sonication, les lysats résultants ont été centrifugés pendant 30 min à 45 000 tr/min, 4 ° C (rotor P45AT, Hitachi CP80WX) et le surnageant résultant chargé sur une colonne de cellulose échangeuse d'anions (DE52, Whatman). Les fractions de couleur rouge contenant du Fd ont été éluées à l'aide d'un tampon contenant du Tris 50 mM (pH 7, 5) et du NaCl 500 mM et dialysées pendant une nuit à 4 ° C contre 3 L de tampon contenant du Tris 50 mM (pH 7, 5) et du NaCl 50 mM. Le dialysat a ensuite été appliqué sur une colonne HiTrap Q HP (GE Healthcare) dans un tampon contenant du Tris 50 mM (pH 7,5) et élué à l'aide d'un gradient linéaire de NaCl (0-1 M NaCl). Par la suite, pour la précipitation au sulfate d'ammonium, un tampon AS saturé à 100 % (Tris 50 mM (pH 7,5) a été ajouté 1: 1 aux fractions regroupées. Le précipité a été centrifugé (8000 × g, TOMY) et jeté. L'échantillon a finalement été soumis à la chromatographie d'interaction hydrophobe à l'aide d'une colonne de phényl-sépharose (GE Healthcare) équilibrée dans le tampon A (50 mM Tris pH 7,5, 40 % de sulfate d'ammonium saturé). L'élution a été réalisée à l'aide d'un gradient linéaire de 0 à 100 % de tampon B (50 mM Tris pH 7.5) et les fractions colorées en rouge ont été recueillies.

Pour la substitution Gallium, 45 mg de Fd ont été dénaturés en ajoutant du chlorure d'hydrogène (HCl) à une concentration de 6 M à une concentration finale de 1 M HCl. La solution trouble a été granulée (10 min, 10 000 × g à température ambiante, centrifugeuse de TOMY) et le précipité blanc immédiatement rincé avec de l'eau Milli-Q, suivi d'une remise en suspension dans un tampon contenant du Tris 100 mM (pH 8,0). Les étapes ci-dessus ont été répétées deux fois pour assurer l'élimination de tous les atomes de fer du Fd. Le précipité de protéines final a été remis en suspension dans un tampon contenant du Tris 100 mM (pH 8,0), du chlorhydrate de guanidine 6 M et du dithiothréitol 10 mM dans un environnement anaérobie.

Le Fd dénaturé a été replié à 4 ° C en le diluant dans un tampon de repliement (GaCl3 2 mM, Na2S 2 mM, DTT 2 mM et Tris 20 mM, pH 8, 0) et incubé à 4 ° C pendant une nuit dans des conditions anaérobies. Le Ga-Fd replié a été purifié par chromatographie sur colonne HiTrap-Q (GE Healthcare) en utilisant un gradient d'élution de 0 à 1 M de NaCl dans 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Les profils d'élution des protéines ont été contrôlés par absorbance à 280 nm. Les fractions éluées contenant Ga-Fd ont été collectées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'une unité Amicon Ultra-15 de coupure de 10 kDa qui a été centrifugée dans un rotor oscillant (2000 × g, 4 ° C). L'échantillon concentré a ensuite été chargé sur une colonne Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) pré-équilibrée en Tris 100 mM (pH 8,0) à un débit de 0,5 ml/min dans le même tampon. Les fractions contenant Ga-Fd ont été détectées par absorbance à 280 nm puis soumises à une dernière étape de chromatographie d'exclusion stérique. La concentration de Fd natif et de Ga-Fd a été calculée à partir de leurs coefficients d'extinction molaire de ε422 = 9,68 mM/cm et ε280 = 170,2 mM/cm, respectivement27. La pureté de Ga-Fd a été évaluée par analyse SDS-PAGE, comme indiqué sur la Fig. 1d supplémentaire.

Toutes les mesures ITC ont été effectuées avec un instrument MicroCal PEAQ-ITC (Malvern Panalytical, Royaume-Uni) à 25 ° C. Les concentrations de Ga-Fd dans la seringue et de trimère PSI dans la cellule étaient respectivement de 600 μM et 11 μM. Toutes les solutions protéiques ont été soumises à un échange de tampon dans un tampon Tricine-NaOH 30 mM (pH 8,0) contenant 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl et 0,005 % GDN en utilisant des colonnes PD-10 (GE Healthcare Life Sciences), et les bulles d'air ont été éliminées. par centrifugation pendant 5 min à 10 000 × g avant ITC. Les paramètres ITC suivants ont été utilisés : titrage, 19 injections ; délai initial, 60 s ; temps d'espacement, 180 s; puissance de référence, 10 μcal/s ; et vitesse d'agitation, 750 tr/min. Le volume d'injection était de 0,4 μL pour la première injection et de 2 μL pour les injections restantes. La chaleur de dilution a été mesurée en titrant 600 μM de Fd substitué par Ga dans la seringue dans une cellule d'échantillon remplie de tampon seul. Le flux de chaleur et l'isotherme de liaison ont été calculés en soustrayant la chaleur de dilution. Les données ont été ajustées au modèle de liaison à un ensemble de sites incorporé dans le logiciel d'analyse MicroCal PEAQ-ITC. Les paramètres thermodynamiques sont présentés sous forme de moyenne ± SEM dérivée de trois expériences ITC indépendantes.

Un total de 10 μL de trimère PSI purifié à une concentration de protéine de 37 μM (40 mg/mL), 1 μL de Ga-Fd purifié à une concentration de 400 μM (4,4 mg/mL) et 2 μL de Cyt c6 purifié dans concentration de 75 μM (0,75 mg/mL) ont été mélangés ensemble à la température de la glace jusqu'à une concentration finale de 30 mg/mL de trimère PSI. Après incubation sur glace dans l'obscurité pendant 2 h, une aliquote de 2,6 μL a été appliquée sur une grille Quantifoil cryo-EM à décharge luminescente (JEC-3000 FC, 30 s, film support carbone vers le haut) (R 1,2/1,3 Cu 300 mesh) et congelé en plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) équipé d'un papier filtre Whatman #1 pour le transfert à 4 °C et 100 % d'humidité pendant 3,5 s à une force de transfert de 0. Congelé les grilles ont été transférées dans de l'azote liquide pour stockage. Le criblage a été réalisé à l'aide d'un microscope cryoélectronique à transmission Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 200 kV. Des cryo-grilles présentant une distribution de particules et une épaisseur de glace appropriées ont été extraites du Talos Arctica et réutilisées pour la collecte de données à haute résolution.

À l'aide de la cartouche d'adaptateur auto-grille (JEOL, Tokyo, Japon), une seule cryo-grille pré-sélectionnée coupée en tant qu'auto-grille (Thermo Fisher Scientific) a été transférée à un microscope cryoélectronique à transmission CRYO ARM 300 (JEOL) exploité à 300 kV et équipé d'un canon à émission à champ froid et d'un filtre Ω en colonne. L'acquisition d'images a été réalisée à l'aide d'un éclairage parallèle à faisceau large en mode d'imagerie en champ clair. Les films ont été automatiquement enregistrés par SerialEM en utilisant le décalage d'image (5 × 5 trous par position de scène) et une caméra de détection directe K3 (Gatan, AMETEK, Pleasanton, CA, USA) en mode CDS à un grossissement nominal de × 60 000 au niveau de la caméra, correspondant à une taille de pixel de 0,806 Å avec 48 images en 3 s de temps d'exposition, résultant en une dose totale de 48 e−/Å2. Au total, 3018 films ont été collectés en série dans une plage de défocalisation de -0,5 μm à -1,5 μm. Une micrographie typique et une distribution angulaire des complexes protéiques sont présentées dans les figures supplémentaires. 2b et 3b, respectivement.

Tout le traitement d'image a été effectué à l'aide de RELION 3.1 et UCSF CHIMERA66 sur une station de travail GPU locale équipée de deux GPU (voir la Fig. 2a supplémentaire pour le flux de travail). Un total de 3018 films ont été divisés en six groupes, et la correction de mouvement pondérée par la dose a été effectuée par l'algorithme MotionCor267 implémenté dans Relion. Pour chaque film corrigé en mouvement, la fonction de transfert de contraste (CTF) a été estimée à l'aide de CTFFIND468. Après estimation CTF, 1959 films avec une résolution estimée supérieure à 5 Å et de bons anneaux Thon (Fig. 2c supplémentaire) ont été conservés pour un traitement ultérieur. Pour la construction de novo d'un modèle initial, 40 483 particules ont été automatiquement sélectionnées dans l'un des 500 groupes de films en utilisant la méthode laplacienne de gaussienne. Les particules sélectionnées ont été soumises à un tour de classification 2D sans référence et le modèle initial a été calculé en utilisant 30 580 particules des meilleures classes 2D. La Fig. 2e supplémentaire présente une visualisation isosurface du modèle initial à quatre seuils différents. La sélection automatique des films des six groupes a été effectuée en utilisant le modèle initial comme référence 3D. Un total de 511 737 particules ont été sélectionnées dans tous les films et une classification 2D a été effectuée sur les particules sélectionnées pour chaque groupe de films. De bonnes classes 2D (Fig. 2d supplémentaire) contenant un total de 366 174 particules ont été sélectionnées, regroupées et utilisées pour la classification 3D. Les particules de la meilleure classe 3D, indiquées par une légende rouge dans la Fig. 2f supplémentaire représentant 56,6 % (207 142 particules) de toutes les particules, ont été sélectionnées pour la reconstruction 3D à l'aide d'un raffinement automatique standard. Par la suite, plusieurs cycles de raffinement CTF et de polissage bayésien ont été effectués jusqu'à ce que la résolution globale de la carte ne s'améliore plus. Suivant les procédures de post-traitement standard, la carte finale masquée a donné une résolution estimée de 2,06 Å sans symétrie appliquée (C1) et 1,97 Å avec symétrie appliquée (C3). Aucune différence évidente n'a pu être observée entre les cartes C1 et C3 en termes de caractéristiques structurelles. La carte symétrisée C3 a été utilisée pour la construction du modèle car elle présentait une meilleure distribution des angles d'Euler et un niveau de bruit réduit. La distribution de résolution locale (Fig. 4a supplémentaire) de la carte symétrisée C3 a été calculée à l'aide de RELION.

Coot69, Phenix, MolProbity70 et UCSF Chimera66 ont été utilisés pour la construction de modèles et le raffinement de l'espace réel. Les structures cristallines aux rayons X du trimère PSI de Synechococcus elongatus déterminées à une résolution de 2,5 Å (PDB ID : 1JB04) et de la structure cristalline aux rayons X de la ferrédoxine de T. elongatus BP-1 déterminées à une résolution de 1,5 Å (PDB ID : 5AUI27) ont été utilisé comme modèle de départ pour le raffinement de l'espace réel dans Phenix 1.19.2 après ajustement manuel dans UCSF Chimera 1.13.1. Coot 0.9.5 a été utilisé pour la correction manuelle et la minimisation des rotamères, de la géométrie et des valeurs aberrantes de Ramachandran dans le modèle raffiné de l'espace réel. Des fichiers de retenue de ligands non métalliques précis ont été téléchargés à partir de Grade Server (http://grade.globalphasing.org) et utilisés pendant le raffinement. Pour tenir compte de la présence observée de magnésium des deux côtés du plan de l'anneau de chlore, la limitation de la chiralité du plan de liaison du magnésium dans les contraintes des chlorophylles (CLA et CL0) a été supprimée pour permettre un ajustement raisonnable dans la carte de densité. De plus, de nouvelles contraintes de cluster fer-soufre71 utilisant une géométrie rhomboïde ont été appliquées pour le raffinement du cluster fer-soufre (SF4). Les fichiers de retenue nouvellement modifiés ont été téléchargés avec le modèle sur le site de dépôt wwPDB. La visualisation des cartes et des modèles dans toutes les figures a été réalisée à l'aide de PyMOL 2.3.2, UCSF Chimera 1.13.1 et ChimeraX72 1.2.5. Pour le positionnement de Cyt c6 présenté à la Fig. 2, la routine Phenix "Dock in map" (https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html) a été effectuée avec l'entrée de la carte de densité locale correspondante et la T. elongatus BP-1 Cyt c6 Structure cristalline aux rayons X déterminée à une résolution de 1,7 Å (PDB ID : 6TR165).

Aucune méthode statistique n'a été appliquée pour présupposer la taille ou la forme de l'échantillon de protéines, et les expériences n'ont pas été randomisées. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'attribution pendant les expériences et l'évaluation des résultats. Les expériences de purification des trimères PSI, de la ferrédoxine et du cytochrome c6 ont été répétées trois fois, ce qui présentait des caractéristiques d'échantillon presque identiques. Les mesures de l'ITC ont été répétées trois fois et des résultats similaires ont été obtenus (les données supplémentaires 1 montrent les données sources de la mesure de l'ITC décrites dans l'article). Les données Cryo-EM ont été collectées à partir d'une seule cryo-grille. Les images individuelles avec une résolution estimée inférieure à 5 Å et des anneaux de Thon flous ainsi qu'une épaisseur de glace insatisfaisante ont été exclues manuellement de l'ensemble de données. Des statistiques détaillées sur la collecte, le traitement et le raffinement des données sont résumées dans le tableau supplémentaire 1.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Tous les 3018 films cryo-EM bruts ont été déposés dans les archives d'images publiques de microscopie électronique (EMPIAR) sous le numéro d'accession EMPIAR-10928. La carte de densité cryo-EM finale a été déposée dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) sous le numéro d'accession EMD-31605. Les coordonnées atomiques du modèle raffiné PSI:Fd ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) sous le numéro d'accession 7FIX. Toutes les données pertinentes sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Knaff, DB & Hirasawa, M. Enzymes chloroplastiques dépendantes de la ferrédoxine. biochimie. Biophys. Acta (BBA) - Bioénergie. 1056, 93–125 (1991).

Article CAS Google Scholar

Umena, Y. et al. Structure cristalline du photosystème II dégageant de l'oxygène à une résolution de 1,9 Å. Nature 473, 55–60 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kurisu, G. et al. Structure du complexe cytochrome b6f de la photosynthèse oxygénée : réglage de la cavité. Sciences 302, 1009-1014 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jordan, P. et al. Structure tridimensionnelle du photosystème cyanobactérien I à une résolution de 2,5 Å. Nature 411, 909–917 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Schuller, JM et al. Les adaptations structurelles du complexe photosynthétique I permettent le transfert d'électrons dépendant de la ferrédoxine. Sciences 363, 257-260 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Saif Hasan, S. & Cramer, WA Sur les limitations de vitesse de transfert d'électrons dans le complexe photosynthétique du cytochrome b6f. Phys. Chim. Chim. Phys. 14, 13853 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guskov, A. et al. Photosystème cyanobactérien II à une résolution de 2,9 Å et rôle des quinones, des lipides, des canaux et du chlorure. Nat. Structure. Mol. Biol. 16, 334–342 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nelson, N. & Junge, W. Structure et transfert d'énergie dans les photosystèmes de la photosynthèse oxygénique. Annu. Rév. Biochem. 84, 659–683 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Croce, R. & van Amerongen, H. Récolte de la lumière dans le photosystème I. Photosynth Res. 116, 153-166 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nugent, JHA Photosynthèse oxygénique. transfert d'électrons dans le photosystème I et le photosystème II. EUR. J. Biochem. 237, 519–531 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hanke, G. & Mulo, P. Ferrédoxines de type végétal et métabolisme dépendant de la ferrédoxine : ferrédoxines des chloroplastes. Cellule végétale Environ. 36, 1071-1084 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hervas, M. et al. Analyse cinétique par flash laser du transfert rapide d'électrons de la plastocyanine et du cytochrome c6 au photosystème I. Preuve expérimentale de l'évolution du mécanisme de réaction. Biochimie 34, 11321-11326 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Netzer-El et al. Structure cristalline du monomère du photosystème I de Synechocystis PCC 6803. Front Plant Sci. 9, 1865 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Zheng, L. et al. Aperçus structurels et fonctionnels du photosystème tétramérique I à partir de cyanobactéries formant des hétérocystes. Nat. Plantes 5, 1087–1097 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ben-Shem, A. et al. Évolution du photosystème I - de la symétrie à la pseudosymétrie jusqu'à l'asymétrie. FEBS Lett. 564, 274-280 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Malavath, T. et al. Structure et fonction du photosystème I de type sauvage et appauvri en sous-unités chez Synechocystis. Biochim Biophys. Acta Bioénerg. 1859, 645–654 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang, J. et al. Structure du photosystème végétal I − complexe de récolte de lumière I supercomplexe à une résolution de 2,4 Å. J. Intégr. Végétal Biol. 63, 1367-1381 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Huang, Z. et al. Structure du photosystème I-LHCI-LHCII de l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii dans l'état 2. Nat. Commun. 12, 1100 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, C. et al. Base structurale du transfert d'énergie dans un énorme supercomplexe de diatomées PSI-FCPI. Nat. Commun. 11, 5081 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nagao, R. et al. Base structurelle pour l'assemblage et la fonction d'un supercomplexe de photosystème de diatomées I-capteur de lumière. Nat. Commun. 11, 2481 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuhlbrandt, W. La révolution de la résolution. Sciences 343, 1443-1444 (2014).

Article PubMed Google Scholar

Kato, K. et al. Base structurelle de l'adaptation et de la fonction de la chlorophylle f dans le photosystème I. Nat. Commun. 11, 238 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fromme, P. et al. Cristallisation et caractérisation par résonance paramagnétique électronique du complexe du photosystème I avec son accepteur naturel d'électrons, la ferrédoxine. Biophys. J. 83, 1760–1773 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kubota-Kawai, H. et al. Structure aux rayons X d'un complexe trimérique asymétrique de ferrédoxine-photosystème I. Nat. Plantes 4, 218–224 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sétif, P. et al. Le site d'amarrage de la ferrédoxine du photosystème I. Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Bioénerg. 1555, 204-209 (2002).

Article Google Scholar

Sétif, PQY & Bottin, H. Étude par spectroscopie d'absorption flash laser de la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I : preuves spectrales et cinétiques de l'existence de plusieurs complexes de photosystème I-ferrédoxine. Biochimie 34, 9059–9070 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mutoh, R. et al. Structure aux rayons X et analyse par résonance magnétique nucléaire des sites d'interaction de la ferrédoxine cyanobactérienne substituée par Ga. Biochimie 54, 6052–6061 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gisriel, CJ et al. La structure d'un complexe de photosystème I-ferrédoxine d'une cyanobactérie marine donne un aperçu de la photoacclimatation à la lumière rouge lointain. J. Biol. Chim. 298, 101408 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cao, P. et al. Base structurelle du transfert d'énergie et d'électrons du supercomplexe du photosystème I – IsiA – flavodoxine. Nat. Plantes 6, 167–176 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Caspy, I. et al. La structure d'un triple complexe du photosystème végétal I avec la ferrédoxine et la plastocyanine. Nat. Plantes 6, 1300–1305 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Caspy, I. et al. La structure du complexe du photosystème végétal I-plastocyanine révèle de fortes interactions hydrophobes. Biochimie. J. 478, 2371-2384 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kolsch, A. et al. Limites actuelles de la biologie structurale : l'interaction transitoire entre le cytochrome c et le photosystème I. Curr. Rés. Structure. Biol. 2, 171–179 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chae, PS et al. Une nouvelle classe d'amphiphiles portant des groupes hydrophobes rigides pour la solubilisation et la stabilisation des protéines membranaires. Chim. EUR. J. 18, 9485–9490 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hauer, F. et al. GraDeR : préparation d'un complexe de protéines membranaires pour la cryo-EM monoparticule. Structure 23, 1769-1775 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nouveaux outils pour la détermination automatisée de la structure cryo-EM à haute résolution dans RELION-3. eLife 7, e42166 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

wwPDB consortium et al. Protein Data Bank : l'archive mondiale unique pour les données de structure macromoléculaire 3D. Nucleic Acids Res. 47, D520–D528 (2019).

Iudin, A. et al. EMPIAR : une archive publique pour les données brutes d'images de microscopie électronique. Nat. Méthodes 13, 387–388 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liebschner, D. et al. Détermination de la structure macromoléculaire par rayons X, neutrons et électrons : développements récents dans Phenix. Acta Crystallogr D. Struct. Biol. 75, 861–877 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wallace, AC et al. LIGPLOT : un programme pour générer des diagrammes schématiques des interactions protéine-ligand. Protéine Ing. Dés. Sél. 8, 127–134 (1995).

Article CAS Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+ : plusieurs diagrammes d'interaction ligand-protéine pour la découverte de médicaments. J. Chem. Inf. Modèle. 51, 2778–2786 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zakharov, SD et al. Calorimétrie par titrage isotherme des interactions protéiques membranaires : RNF et complexe cytochrome b6f. Biophys. J. 121, 300–308 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Boudière, L. et al. Glycérolipides dans la photosynthèse : composition, synthèse et trafic. Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Bioénerg. 1837, 470–480 (2014).

Article CAS Google Scholar

Kubota, H. et al. Purification et caractérisation du complexe du photosystème I de Synechocystis sp. PCC 6803 en exprimant des sous-unités marquées à l'histidine. Biochim. Biophys. Acta 1797, 98-105 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mizusawa, N. & Wada, H. Le rôle des lipides dans le photosystème II. Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Bioénerg. 1817, 194–208 (2012).

Article CAS Google Scholar

Mignée, C. et al. P. Gallium ferredoxine comme outil pour étudier les effets de la liaison de la ferredoxine au photosystème I sans réduction de la ferredoxine. Photosynth. Rés. 134, 251-263 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Hippler, M. et al. Le domaine N-terminal de PsaF : site de reconnaissance précis pour la liaison et le transfert rapide d'électrons du cytochrome c6 et de la plastocyanine vers le photosystème I de Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 95, 7339–7344 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drepper, F. et al. Dynamique de liaison et transfert d'électrons entre la plastocyanine et le photosystème I. Biochemistry 35, 1282–1295 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Suga, M. et al. Structure du photosystème d'algues vertes I supercomplexe avec un complexe décamère collecteur de lumière I. Nat. Plantes 5, 626–636 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Hippler, M. et al. Le domaine de liaison à la plastocyanine du photosystème I. EMBO J. 15, 6374–6384 (1996).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hippler, M. et al. Transfert rapide d'électrons du cytochrome c6 et de la plastocyanine au photosystème I de Chlamydomonas reinhardtii Nécessite PsaF. Biochimie 36, 6343–6349 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Viola, S. et al. Don d'électrons in vivo de la plastocyanine et du cytochrome c au PSI chez Synechocystis sp. PCC6803. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Bioénergétique 1862, 148449 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Barth, P. et al. Rôle essentiel d'une seule arginine du photosystème I dans la stabilisation du complexe de transfert d'électrons avec la ferrédoxine. J. Biol. Chim. 275, 7030–7036 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fischer, N. et al. La sous-unité PsaC du photosystème I fournit un résidu de lysine essentiel pour un transfert rapide d'électrons vers la ferrédoxine. EMBO J. 17, 849–858 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fischer, N. et al. Mutagenèse dirigée de la sous-unité PsaC du photosystème IJ Biol. Chim. 274, 23333-23340 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Morales, R. et al. Les structures radiographiques raffinées de la ferrédoxine [2Fe-2S] oxydée à 1, 3 Å et réduite à 1, 17 Å de la cyanobactérie Anabaena PCC7119 montrent des changements conformationnels liés à l'oxydo-réduction. Biochimie 38, 15764-15773 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bottin, H. et al. Rôle des résidus d'acides aminés acides de la sous-unité PsaD sur la limitation de l'affinité du photosystème I pour la ferrédoxine. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 287, 833–836 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kinoshita, M. et al. Nature physicochimique des interfaces contrôlant l'activité de la ferrédoxine NADP+ réductase par ses interactions interprotéiques avec la ferrédoxine. Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Bioénerg. 1847, 1200-1211 (2015).

Article CAS Google Scholar

Tohda, R. et al. Structure cristalline de l'oxygénase-1 de l'hème végétal supérieur et son mécanisme d'interaction avec la ferrédoxine. J. Biol. Chim. 296, 100217 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kim, JY et al. Études structurales et mutationnelles d'un complexe de transfert d'électrons de sulfite réductase de maïs et de ferrédoxine. J. Biochem. 160, 101-109 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lee, Y.-H. et coll. Énergétique de liaison de la ferrédoxine-NADP + réductase avec la ferrédoxine et sa relation avec la fonction. ChemBioChem 12, 2062-2070 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Allen, MM Conditions simples pour la croissance d'algues bleu-vert unicellulaires sur des plaques. J. Phycol. 4, 1–4 (1968).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rögner, M. et al. Purification et caractérisation des complexes centraux du photosystème I et du photosystème II à partir de souches de type sauvage et déficientes en phycocyanine de la cyanobactérie Synechocystis PCC 6803. J. Biol. Chim. 265, 6189–6196 (1990).

Article PubMed Google Scholar

Shin, M. et al. Purification des cytochromes de type c d'une algue bleu-vert thermophile, Synechococcus vulcanus, par chromatographie sur colonne hydrophobe à l'aide de toyopearls. Cellule végétale Physiol. 25, 1575-1578 (1984).

Article CAS Google Scholar

Koike, H. & Katoh, S. Stabilités à la chaleur des cytochromes et de la ferrédoxine isolées d'une algue bleu-vert thermophile. Cellule végétale Physiol. 20, 1157-1161 (1979).

CAS Google Scholar

Falke, S. et al. Structures cristallines du cytochrome c6 natif de Thermosynechococcus elongatus dans deux groupes spatiaux différents et implications pour son oligomérisation. Acta Crystallogr F. Struct. Biol. Commun. 76, 444–452 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera - un système de visualisation pour la recherche exploratoire et l'analyse. J. Comput. Chim. 25, 1605-1612 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2 : correction anisotrope du mouvement induit par le faisceau pour une cryomicroscopie électronique améliorée. Nat. Méthodes 14, 331–332 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4 : estimation rapide et précise de la défocalisation à partir de micrographies électroniques. J. Structure. Biol. 192, 216-221 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P. et al. Fonctionnalités et développement de Coot. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 486-501 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, CJ et al. MolProbity : des données de référence plus nombreuses et de meilleure qualité pour une meilleure validation de la structure de tous les atomes. Protéine Sci. 27, 293–315 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Moriarty, NW & Adams, PD Les amas fer-soufre n'ont pas d'angles droits. Acta Crystallogr D. Struct. Biol. 75, 16-20 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX : visualisation de la structure pour les chercheurs, les éducateurs et les développeurs. Protéine Sci. 30, 70–82 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous sommes reconnaissants pour le soutien technique et la précieuse contribution scientifique de ce projet à Hisako Kubota-Kawai, Yuko Misumi, Hideaki Tanaka, Mika Hirose, Norbert Krauß, Orkun Çoruh et Takayuki Kato. Ce travail a été financé par le JST-CREST sous le numéro de subvention JPMJCR20E1 (GK) et une subvention pour la recherche scientifique sous le numéro de subvention 21H02417 (GK) de MEXT-KAKENHI, le projet de plateforme pour soutenir la découverte de médicaments et la recherche en sciences de la vie de AMED sous le numéro de subvention JP20am0101117 (KN) et JP16K07266 (CG), et JP22ama121001j0001 à Masaki Yamamoto, CG et GK et l'innovation cyclique pour l'autonomisation clinique (CiCLE) numéro de subvention JP17pc0101020 de AMED à KN et GK, et National Research Foundation of Korea ( NRF) subventions financées par le gouvernement coréen sous le numéro de subvention 2019R1A2C1004954, subvention du National Research Council of Science & Technology (NST) financée par le gouvernement coréen sous le numéro de subvention CCL22061-100 et le fonds KBSI sous le numéro de subvention C220000, C230130, C280320 et C270100 à Y.-HL, et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre du Research Training Group 234 'MiCon' (MMN). Ce travail est également soutenu par la bourse du China Scholarship Council (CSC) pour les études de JL à l'Université d'Osaka (CSC n° 201706220064).

Laboratoire de cristallographie des protéines, Institut de recherche sur les protéines, Université d'Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japon

Jiannan Li, Noriyuki Hamaoka, Akihiro Kawamoto, Christoph Gerle & Genji Kurisu

Département des sciences biologiques, École supérieure des sciences, Université d'Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japon

Jiannan Li et Genji Kurisu

Département des sciences macromoléculaires, École supérieure des sciences, Université d'Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japon

Noriyuki Hamaoka et Genji Kurisu

École supérieure de Frontier Biosciences, Université d'Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japon

Fumiaki Makino & Keiichi Namba

JEOL Ltd., Akishima, Tokyo, Japon

Makino Fumiaki

Centre de recherche pour l'analyse de la bioconvergence, Korea Basic Science Institute, Ochang, Chungbuk, 28119, Corée du Sud

Yuxi Lin & Young-Ho Lee

Biochimie végétale, Faculté de biologie et de biotechnologie, Ruhr University Bochum, 44780, Bochum, Allemagne

Matthias Rögner & Marc M. Nowaczyk

Sciences bio-analytiques, Université des sciences et technologies, Daejeon, 34113, Corée du Sud

Young Ho Lee

École supérieure des sciences et technologies analytiques, Université nationale de Chungnam, Daejeon, 34134, Corée du Sud

Young Ho Lee

RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research et SPring-8 Center, Suita, Osaka, Japon

Numéro Keiichi

JEOL YOKOGUCHI Research Alliance Laboratories, Université d'Osaka, Suita, Osaka, Japon

Numéro Keiichi

Centre RIKEN SPring-8, Kouto, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japon

Christophe Gerlé

Institut pour les initiatives de recherche ouvertes et transdisciplinaires (OTRI), Université d'Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japon

Genji Kurisu

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

GK, MR et MMN ont lancé l'étude ; Recherche conçue par GK et CG ; JL, NH, FM, AK et YL ont réalisé des expériences ; JL, NH, YL, Y.-HL et CG ont analysé les données ; KN a supervisé la recherche et JL, CG et GK ont rédigé le manuscrit avec la contribution et les commentaires de tous les auteurs.

Correspondance à Christoph Gerle ou Genji Kurisu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Mei Li pour sa contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : Manuel Breuer. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Li, J., Hamaoka, N., Makino, F. et al. Structure du photosystème cyanobactérien I complexé avec la ferrédoxine à une résolution de 1,97 Å. Commun Biol 5, 951 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

Télécharger la citation

Reçu : 13 juillet 2022

Accepté : 30 août 2022

Publié: 12 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Nature (2023)

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.