Bioimpression de matériaux vivants fonctionnels microporeux à partir de protéines

Oct 11, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 322 (2023) Citer cet article

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Les matériaux vivants rassemblent la science des matériaux et la biologie pour permettre l'ingénierie et l'augmentation des systèmes vivants avec de nouvelles fonctionnalités. La bioimpression promet un contrôle précis de la formation de ces matériaux complexes grâce au dépôt programmable de cellules dans des matériaux mous, mais les approches actuelles ont eu un succès limité pour affiner les microenvironnements cellulaires tout en générant des morphologies macroscopiques robustes. Ici, nous relevons ce défi grâce à l'utilisation d'encre microgel core-shell pour découpler les microenvironnements cellulaires de la coque structurelle pour un traitement ultérieur. Les cellules sont immobilisées de manière microfluidique dans le noyau visqueux qui peut favoriser la formation de populations microbiennes et de sphéroïdes cellulaires de mammifères, suivie d'un recuit interparticulaire pour donner des échafaudages fonctionnels stabilisés de manière covalente avec une microporosité contrôlée. Les résultats montrent que la stratégie core-shell atténue les fuites cellulaires tout en offrant un environnement favorable à la culture cellulaire. En outre, nous démontrons que différents consortiums microbiens peuvent être imprimés dans des échafaudages pour une gamme d'applications. En compartimentant les consortiums microbiens dans des microgels séparés, la capacité de biotraitement collectif de l'échafaudage est considérablement améliorée, mettant en lumière les stratégies visant à augmenter les matériaux vivants avec des capacités de biotraitement.

Les matériaux vivants sont des matériaux complexes qui incorporent des cellules vivantes dans des composants non vivants1,2. Selon la nature des interactions avec les cellules constitutives, ces matériaux peuvent aller des milieux bioinertes qui offrent des fonctions d'échafaudage3,4,5,6,7, aux biomatériaux instructifs pour les cellules qui peuvent diriger les comportements cellulaires8,9,10, et récemment, même à des matrices génétiquement programmables produites par des cellules qui imitent la formation naturelle de biofilms11,12,13,14,15. La fonctionnalité de ces matériaux composites provient principalement des cellules intégrées ; en tant que tel, le matériau doit toujours permettre aux cellules de se développer et de fonctionner correctement. Cependant, il existe généralement de fortes contraintes sur les propriétés macroscopiques des matériaux en raison de l'exigence fonctionnelle pour une structure finale de présenter une forme physique qui peut être manipulée, livrée, conservée, réutilisée et qui protège les cellules. La synergie entre les matériaux et la biologie a non seulement radicalement transformé notre compréhension des processus cellulaires16, mais nous a également apporté la capacité de concevoir des systèmes vivants vers une myriade d'applications, de l'administration thérapeutique de cellules pour la médecine régénérative17,18,19, à la demande. production de produits chimiques de grande valeur grâce au biotraitement microbien6,7.

La manipulation de la distribution spatiale des cellules est l'une des capacités les plus recherchées dans le domaine des matériaux vivants. La bioimpression a sans doute attiré le plus d'attention20,21 en raison de sa polyvalence et de sa compatibilité avec de nombreux matériaux souples respectueux des cellules. Par exemple, la bio-impression permet le dépôt programmable de cellules de mammifères dans des hydrogels bioactifs pour créer des constructions biologiques 3D qui récapitulent mieux la complexité et l'hétérogénéité des tissus natifs22,23,24,25, qui détient d'énormes valeurs translationnelles en biomédecine. Les microbes de bioimpression ont également connu une augmentation des applications ces dernières années, car ils approfondissent notre compréhension des communautés bactériennes dynamiques26 et offrent des informations pour l'amélioration du biotraitement3,4,5,6. Cependant, les routines actuelles de bio-impression compromettent souvent l'adéquation aux cellules pour une meilleure manufacturabilité des matériaux, car les propriétés mécaniques et rhéologiques inhérentes de la bioencre ne peuvent pas être correctement découplées des microenvironnements cellulaires27,28. De plus, il reste un défi de construire des morphologies matérielles macroscopiques arbitraires avec des niches cellulaires bien définies pour établir des interactions robustes entre différentes communautés cellulaires20,21,29.

Nous proposons ici une méthode pour relever ce défi. Dans ce travail, nous explorons l'applicabilité des microgels core-shell chargés de cellules à l'interface de la bio-impression et des matériaux vivants fonctionnels. Sur la base d'un système aqueux à deux phases entre gélatine/gélatine méthacryloyle (gelMA) et carboxyméthylcellulose (CMC)30, les microgels noyau-enveloppe sont fabriqués avec des cellules encapsulées dans la phase de noyau visqueuse, tandis que l'enveloppe d'hydrogel offre une stratégie de mise en réseau double pour être liés de manière covalente les uns aux autres dans un échafaudage microporeux PAM (Microgel recuit à base de protéines). De plus, nous combinons des blocs de construction microfluidiquement accordables avec des fonctionnalités de matériaux vivants macroscopiques via la bioimpression par extrusion29,31 vers le biotraitement. Nous montrons que les microgels core-shell soutiennent la croissance des populations microbiennes et des sphéroïdes cellulaires de mammifères ; plus important encore, en comparaison avec leurs homologues non core-shell, les microgels core-shell peuvent réduire la fuite cellulaire vers le milieu tout en augmentant la capacité de biotraitement de ces matériaux. Enfin, nous démontrons qu'en fabriquant des échafaudages avec des propriétés variables localement, c'est-à-dire des populations de cellules réparties de manière hétérogène et séparées dans l'espace dans des microgels discrets, des bioactivités significativement améliorées sont observées dans deux modèles de consortiums microbiens typiques. Nous pensons que notre méthode a fourni une stratégie généralisable pour construire la prochaine génération de matériaux vivants, prometteuse non seulement dans le biotraitement microbien, mais aussi dans la biofabrication avancée.

Nous avons commencé avec la gélatine, un matériau dérivé du collagène qui a longtemps été utilisé dans diverses applications biologiques en raison de son origine animale et de sa grande disponibilité32, pour construire des matériaux vivants (Fig. 1). Pour permettre un double réseau, la gélatine a d'abord été mélangée avec son dérivé photoréticulable, gelMA, pour générer une solution homogène de précurseur d'hydrogel à 15 % dopée avec 0,5 % de photoinitiateurs de lumière bleue lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP). GelMA a été synthétisé selon un protocole bien établi33, avec un degré de fonctionnalisation estimé à 50% par RMN (Fig. 1 supplémentaire). La phase dispersée a été émulsifiée dans un dispositif de focalisation de flux microfluidique, où une solution de 1 % de carboxyméthylcellulose (CMC) dopée avec 10 U/ml de transglutaminases a été flanquée de solutions formant un hydrogel à la jonction du dispositif, et ensemble la phase dispersée a été coupée par l'huile de support (Novec 7500 avec 0,1% de tensioactif Pico-surf) pour générer des gouttelettes (Fig. 2 supplémentaire). Les débits pour le précurseur d'hydrogel, le CMC et l'huile étaient respectivement de 8, 2 et 40 µL/min, résultant en des gouttelettes noyau-enveloppe hautement monodispersives d'environ 165 µm de diamètre (coefficient de variance, CV = 2,2 %) et noyau CMC ~ 90 µm (CV = 7,4%). Par microfluidique, l'épaisseur de la coque a pu être contrôlée (Fig. 1b). Les gouttelettes ont été durcies à température ambiante pendant une nuit pour permettre la diffusion des transglutaminases du noyau CMC dans la phase de coquille qui, par la suite, a catalysé la formation de liaisons isopeptidiques entre la glutamine et la lysine et donc le premier réseau covalent. Les microgels ont été désémulsifiés, suivis d'un mélange direct avec une solution tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0, 5% de LAP à un rapport volumique de 4: 1 pour donner une imprimabilité satisfaisante. À l'aide d'une imprimante 3D à extrusion, des microgels coincés pourraient être modelés en échafaudages macroscopiques. Enfin, une lumière bleue de 405 nm a initié une deuxième réticulation parmi les microgels pour générer des échafaudages PAM stabilisés par covalence mécaniquement suffisamment rigides pour être facilement manipulés par une paire de pincettes (Fig. 1c) et peut maintenir son intégrité structurelle après 3 jours d'incubation dans du PBS ( Vidéo supplémentaire 1). Remarquablement, la double stratégie covalente est réversible, c'est-à-dire que les gouttelettes peuvent d'abord être durcies par un rayonnement de lumière bleue, puis recuites par voie enzymatique.

a Schéma de la formation des échafaudages PAM. Tout d'abord, le mélange de polymères gélatine/gelMA contenant LAP, ainsi que la solution de CMC contenant des cellules enrichies de transglutaminases, est émulsifié par l'huile de support en gouttelettes dans un dispositif microfluidique à focalisation de flux. Les gouttelettes sont ensuite converties en microgels par des réactions enzymatiques, après quoi elles sont extrudées et modelées en échafaudages. Enfin, la lumière bleue initie une deuxième réticulation covalente parmi les microgels bloqués, donnant lieu à des échafaudages PAM. b Par microfluidique, le rapport cœur-coquille peut être contrôlé. Les débits de la solution de précurseur d'hydrogel (phase de coque) et de l'huile de support sont contrôlés à 8 et 40 µL/min, respectivement, et les débits de CMC (phase centrale) sont de 1, 2 et 3 µL/min, pour les petites , moyenne et grande taille de noyau, respectivement, n = 50 microgels analysés dans une expérience. c Échafaudages PAM imprimés et la micrographie montre un grossissement local de deux filaments croisés. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type et les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Les images SEM (Scanning Electron Microscope) montrent la morphologie noyau-coquille des blocs de construction (Fig. 3b supplémentaire) et que les échafaudages PAM à double réseau portaient une porosité à plusieurs échelles (Fig. 3a – c supplémentaire). À la surface du microgel, il y avait des nanopores (Fig. 3a supplémentaire) caractéristiques des hydrogels en tant que matériau à haute teneur en eau. L'emballage de microgel a donné naissance à des micropores34, comme en témoigne la morphologie des mailles étirées des échafaudages PAM lyophilisés (Fig. 3c supplémentaire). Pour étudier plus en détail comment la taille du microgel affecte les propriétés physiques des échafaudages à grande échelle, nous avons étudié la cinétique de dégradation des échafaudages PAM assemblés à partir de microgels de tailles différentes en faisant percoler une solution de trypsine dans la structure (Fig. 4a supplémentaire), ainsi que des hydrogels en vrac à double réticulation et microgels non recuits. Les profils cinétiques (Fig. 4b supplémentaire) démontrent que la dégradation de tous les échafaudages PAM, quelles que soient les tailles de microgel, a montré des taux plus élevés que les hydrogels en vrac en raison de la présence de micropores qui ont facilité la percolation de la solution de trypsine dans les échafaudages. De plus, la dégradation avait tendance à être plus lente avec des tailles de microgel plus petites, probablement en raison d'une diminution de la taille des pores19 et donc d'une percolation ralentie (Fig. 4b supplémentaire).

Les microgels sont récemment apparus comme un type d'encre pour fabriquer des structures 3D par impression par extrusion29,31,34,35,36,37. Dans un état coincé, ils peuvent former des structures de repos se comportant comme des solides élastiques par des interactions physiques telles que des frottements ; lors du cisaillement, les frottements interparticulaires sont dissipés pour permettre à l'encre de s'écouler. En tant que tels, les matériaux qui peuvent être façonnés en microgels sont théoriquement imprimables par extrusion, quelle que soit leur chimie polymère29,31. Pour évaluer quantitativement l'imprimabilité de cette encre microgel core-shell, une caractérisation rhéologique a d'abord été réalisée. Les microgels bloqués présentaient un comportement d'amincissement par cisaillement (Fig. 2a) et pouvaient rapidement se remettre de la contrainte lors de leur retrait (Fig. 2b). Collectivement, ce comportement rhéologique particulier peut se traduire par la capacité de l'encre à se transformer rapidement d'un liquide fluide lorsqu'elle est cisaillée à un solide élastique à la sortie de la buse. L'expérience de balayage de contrainte démontre que l'encre microgel a cédé à environ 30% de contrainte (Fig. 5a supplémentaire); après le recuit interparticulaire, le module de stockage et de perte a augmenté de manière significative (Fig. 2c) et la limite d'élasticité a été multipliée par six environ (Fig. 5b supplémentaire), donnant lieu à des échafaudages PAM avec une résistance mécanique améliorée. De plus, l'encre avec une stratégie de réseau double inversé partageait un ensemble de propriétés rhéologiques similaires (Fig. 5c – f supplémentaires).

a–c Caractérisation rhéologique de l'encre microgel. Les microgels sont durcis par voie enzymatique. une expérience de balayage du taux de cisaillement. Taux de cisaillement de 0 à 10 1/s. Filtrer 1 %. b Balayage étape-déformation où une faible déformation (1 %) et une déformation élevée (90 %) sont cyclées toutes les 100 s. Fréquence 1Hz. c Modules de stockage et de perte avant et après le recuit photo-initié, n = 3 caractérisations rhéologiques indépendantes. ***p = 0,00022, ** p = 0,0031, test t de Student bilatéral non apparié. d Images fluorescentes de filaments extrudés imprimés à partir de buses de tailles différentes. L'encart montre un coin incurvé d'un filament. e Analyse des diamètres des filaments. Les barres colorées représentent les diamètres intérieurs des buses d'impression et les blancs sont les diamètres mesurés des filaments imprimés, n = 3 filaments imprimés indépendamment dans une expérience. f Images fluorescentes d'échafaudages, c'est-à-dire (i) des échafaudages homogènes verts et (ii) rouges, (iii) un échafaudage macroscopiquement hétérogène et (iv) un échafaudage microscopiquement hétérogène. d, f Des microgels fluorescents sont générés à partir d'un mélange de gélatine et de gelMA marqué au fluorophore. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type et les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Nous avons ensuite testé la fidélité de l'impression. Des buses de différents diamètres intérieurs ont été utilisées pour modeler les échafaudages, et les filaments ont tous affiché une épaisseur uniforme sans aplatissement notable (Fig. 2d) autrement affecté par la tension superficielle lors du contact avec la surface solide. Par conséquent, les diamètres des filaments étaient fidèles aux buses d'impression et même légèrement plus petits avec les buses 20 G, 21 G et 22 G (Fig. 2e) en raison de l'augmentation de l'irrégularité des bords. Nous avons ensuite testé la compatibilité de l'encre microgel avec une imprimante 3D à extrusion commerciale (Fig. 6a supplémentaire et vidéo supplémentaire 2). L'encre Microgel avec une imprimabilité optimisée a été chargée dans une cartouche de dispersion couplée à un bras robotique mécanique à trois axes. L'extrusion et la vitesse d'écriture de l'encre microgel ont été contrôlées pneumatiquement et par le bras robotisé, respectivement. Contrairement à l'impression par extrusion à base de matériau continu où l'épaisseur du filament peut être contrôlée à la fois par l'extrusion et la vitesse d'écriture en raison de la fusion du filament38, nous avons constaté que l'épaisseur de l'encre microgel imprimée ne dépend guère ni de la vitesse, mais de la taille de la buse due à son comportement plus élastique. Ainsi, des vitesses incompatibles entraîneront soit une rupture de filament (extrusion < écriture) soit une accumulation de filament indésirable (extrusion> écriture, Fig. 6b supplémentaire). En conséquence, en faisant correspondre la vitesse d'extrusion et d'écriture de l'encre, nous avons pu modeler l'encre microgel en diverses formes prédéfinies (Fig. 6a supplémentaire) et structures multicouches. Outre les structures homogènes (Fig. 2fi et ii), des structures hétérogènes (Fig. 2f, iii et iv) pourraient également être fabriquées en mélangeant simplement des populations de microgels portant des propriétés différentes.

L'un des principaux défis de la bioimpression par extrusion est de savoir comment trouver un équilibre entre les propriétés mécaniques du matériau, la fabricabilité du matériau et son aptitude à la culture cellulaire21,27,28, en tant que caractéristiques mécaniques inhérentes du matériau, c'est-à-dire le profil rhéologique et le résultat final. la rigidité du matériau déterminera non seulement ses performances d'impression20,39, mais aussi, plus important encore, pourrait affecter négativement les comportements cellulaires40,41. Pour relever ce défi, nous utilisons la stratégie core-shell pour découpler le traitement des matériaux (la phase shell) de la culture cellulaire (la phase core) grâce à leur séparation de phase30. Le matériau de base, le CMC, a été utilisé pour la culture cellulaire et comme échafaudages d'ingénierie tissulaire42,43. La caractérisation rhéologique du matériau de base montre que la solution CMC penche vers la viscosité (Fig. 5g, i supplémentaire). Ensuite, nous avons étudié la prolifération de micro-organismes dans un environnement aussi visqueux par opposition aux blocs de construction non core-shell (Fig. 3). On a laissé E. coli se développer dans des microgels durcis pendant 24 heures. Dans les microgels noyau-enveloppe, dans une large mesure, la croissance cellulaire était physiquement confinée, ce qui a conduit à une population bactérienne concentrée dans le noyau (Fig. 3a). À l'opposé, les bactéries présentes dans les microgels sans noyau-coque ont proliféré localement et formé des microcolonies arrondies et sporadiques (Fig. 3b) similaires à celles rapportées récemment44. De plus, nous avons également découvert visuellement qu'un tel confinement spatial pourrait empêcher plus efficacement les bactéries de s'échapper dans l'environnement (Fig. 7a supplémentaire). Nous avons en outre confirmé le résultat via une expérience de placage de dilution (Fig. 7b supplémentaire), qui montre que l'unité formant colonie (UFC) du surnageant de microgels non core-shell était de deux ordres de grandeur supérieure à celle de core-shell microgels sur 24 heures (Fig. 7c supplémentaire). Comme la fuite cellulaire constitue un défi non résolu dans le domaine des matériaux vivants pour le biotraitement6,7,45, en particulier lorsque des micro-organismes génétiquement modifiés sont impliqués qui ne peuvent pas risquer de s'échapper, l'utilisation de microgels core-shell pourrait offrir des stratégies pour résoudre ce problème46. De plus, les microbes pourraient proliférer dans les échafaudages PAM de la même manière sans contamination croisée notable entre les microgels adjacents (Fig. 8 supplémentaire).

Panneau de gauche : GFP Escherichia Coli (E. coli.) dans des microgels core-shell et non core-shell. Panneau de droite : formation et caractérisation de sphéroïdes cellulaires HEK 293 T dans des microgels core-shell. a Prolifération de GFP E. coli. dans les microgels core-shell. La croissance cellulaire est confinée à l'intérieur des noyaux de microgel visqueux. b Prolifération d'E. coli. dans les microgels non core-shell. E. coli prolifère localement pour former des microcolonies visibles. Les lignes pointillées bleues et blanches décrivent les microgels et les noyaux CMC, respectivement. c Représentation schématique de la formation de sphéroïdes multicellulaires. En raison du confinement spatial, les cellules sont autorisées à interagir dans les trois dimensions pour former des sphéroïdes multicellulaires présentant une structure hiérarchique. d Croissance des sphéroïdes HEK 293 T du jour 3 au jour 6, quantifiée par la circularité et la surface des sphéroïdes. Les données sont représentées sous forme de valeurs moyennes avec minimums/maximums, n = 107 sphéroïdes (jour 3), n = 248 sphéroïdes (jour 6) dans la même expérience. **p = 0,0019, ****p < 1E-15, test t de Student bilatéral non apparié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. e Coloration vivante/morte des microgels chargés de cellules au jour 0, au jour 3 et au jour 6. Les cellules vivantes (vertes) et les cellules mortes (rouges) sont colorées avec de la calcéine acétoxyméthyle (calcéine AM) et de l'éthidium homodimère-1 (EthD-1 ), respectivement. f Structure cytosquelettique des sphéroïdes HEK 293 T. (i) Image en fond clair d'un sphéroïde HEK 293 T et (ii) son image microscopique confocale. (iii) Structure cytosquelettique de HEK 293 T à partir d'une culture monocouche. La F-actine et les noyaux sont colorés avec de la phalloïdine et du 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), respectivement. La micrographie fluorescente confocale est rendue à partir d'images en coupe transversale à différentes positions verticales (Fig. 10 supplémentaire).

L'applicabilité des microgels noyau-enveloppe pour la culture de cellules de mammifères a également été caractérisée (Fig. 3c – f). La livraison des cellules dans les microgels a suivi la distribution de Poisson (Fig. 9 supplémentaire). De même, les cellules étaient confinées dans l'espace et autorisées à proliférer et à interagir dans toutes les dimensions à l'intérieur des noyaux de microgel pour s'auto-assembler en sphéroïdes à haute densité cellulaire (Fig. 3c). Les cellules T 293 du rein embryonnaire humain (HEK) se sont développées en sphéroïdes cellulaires après trois jours dans des microgels noyau-enveloppe (Fig. 3e), dont la plupart présentaient une circularité élevée (supérieure à 0, 8, Fig. 3d). Du jour 3 au jour 6, la taille des sphéroïdes a augmenté de 80 % (Fig. 3d) et a maintenu une viabilité élevée, comme en témoigne la coloration Live/Dead (Fig. 3e). De plus, le cytosquelette des sphéroïdes HEK 293 T était composé de noyaux densément emballés entourés d'un maillage d'actine corticale (Fig. 3f, ii et Supplémentaire Fig. 10), incarnant la prédominance des interactions cellule-cellule, contrairement à la monocouche. culture cellulaire, où l'actine était organisée en fibres cytoplasmiques47 (Fig. 3f, iii). Pour conclure, HEK 293 T est capable de former des sphéroïdes cellulaires bien structurés à l'intérieur de microgels noyau-coquille à haute viabilité cellulaire, indiquant leur potentiel pour de futures applications en tant que blocs de construction pour la biofabrication de structures à haute densité cellulaire20.

L'impression de microbes est la frontière émergente de la bio-impression48, car elle offre un outil polyvalent pour créer des matériaux vivants fonctionnels avec des formes et des propriétés bien définies qui ont trouvé un large éventail d'applications, notamment la détection49, la biofabrication6 et la bioremédiation3,7. Les microgels noyau-coquille ont ensuite été utilisés comme bioencre pour imprimer des échafaudages vivants fonctionnels pour le biotraitement (Fig. 4a). Nous avons commencé avec un système de fermentation naturel de Saccharomyces cerevisiae pour convertir de manière anaérobie le glucose en éthanol3,4,5. Des microgels core-shell chargés de levure ont été imprimés (Fig. 4b) dans des échafaudages PAM recuits et immergés dans un milieu extrait de levure peptone dextrose (YPD) dans un environnement sans oxygène pour la fermentation. Pour tous les échafaudages de microgel core-shell chargés de levure utilisés dans ce travail, la production d'éthanol a commencé à décoller 2 heures après l'immersion dans le milieu YPD et a augmenté de façon exponentielle en 12 heures (Fig. 4e). Tout d'abord, nous avons étudié comment les propriétés physiques du bloc de construction influencent la capacité de biotraitement des échafaudages imprimés. En ajustant uniquement le débit de la phase centrale, des microgels noyau-enveloppe de même taille globale (noyau-enveloppe A et B : 156 ± 3,2 µm et 154 ± 2,0 µm, respectivement) ont été générés avec des tailles de noyau variées (84 ± 8,2 µm et 56 ± 2,1 µm, respectivement, Fig. 4c, d) et donc un écart dans les charges cellulaires. Nous avons sondé la cinétique de la production d'éthanol dans les milieux (Fig. 4e) et constaté que des noyaux plus gros (noyau-enveloppe A) entraînaient une génération plus rapide d'éthanol en raison de charges cellulaires plus élevées. Ensuite, nous avons examiné si la taille des microgels noyau-enveloppe entraînerait des différences de fermentation. Pour dissocier le facteur de charge cellulaire des performances de biotraitement, les profils d'écoulement de la phase dispersée (à la fois le noyau et l'enveloppe) utilisés pour fabriquer le microgel noyau-enveloppe B ont été maintenus constants mais avec un débit accru de l'huile de support dans un plus petit dispositif microfluidique à gouttelettes (Fig. 11a supplémentaire), donnant naissance à des microgels noyau-coque plus petits (noyau-coque C, 95 ± 3,2 µm au total, 34 ± 1,7 µm noyau) avec un rapport volumique inchangé entre le noyau et le matériau de la coque (Fig. .4d). Par conséquent, en imprimant des échafaudages de poids égaux, leurs charges cellulaires initiales étaient proches quelle que soit la taille des blocs de construction. Nous avons constaté qu'avec une quantité équivalente de cellules de levure immobilisées dans l'échafaudage, la taille des microgels noyau-enveloppe n'influençait pas de manière significative le processus de fermentation (Fig. 4e), que nous avons attribué à la présence des micropores dans l'échafaudage, ainsi que avec une longueur de diffusion relativement plus courte34, qui n'a pas considérablement gêné la livraison de petites molécules vers/depuis les cellules. Enfin, des microgels non core-shell ont également été générés (150 ± 3,0 µm) à titre de comparaison et une production considérablement retardée d'éthanol par des échafaudages imprimés à partir de celui-ci (Fig. 4e) a été observée, principalement en raison de la croissance restreinte de la levure dans un réseau d'hydrogel hautement réticulé chimiquement qui avait ralenti la prolifération cellulaire44. Cependant, nous avons également constaté que la production d'éthanol au point final (20 heures) à partir des échafaudages PAM core-shell était légèrement inférieure (Fig. 11b supplémentaire), ce que nous avons attribué à une fuite cellulaire plus prononcée pour les échafaudages PAM non core-shell. (Fig. 11c supplémentaire) qui a stimulé la production d'éthanol.

a Schéma de la fabrication d'échafaudages vivants fonctionnels. Des microgels noyau-coque chargés de microbes sont générés via la microfluidique des gouttelettes et imprimés dans des échafaudages recuits qui sont utilisés pour le biotraitement, où les microbes agissent comme le biocatalyseur de la cellule entière pour convertir le substrat en produit dans le milieu. b Micrographies des microgels core-shell de tailles variées et des microgels non core-shell. c La distribution de taille des microgels core-shell et des microgels non core-shell dans b, n = 20 microgels dans une expérience. d Le rapport volumique entre la phase noyau et la phase coquille pour les microgels noyau-coque. Les microgels noyau-enveloppe A ont une taille globale similaire à B mais ont des noyaux plus grands. Les microgels noyau-coquille B et C sont de taille globale différente mais ils ont le même rapport noyau/coquille afin de maintenir des charges cellulaires équivalentes pour la bio-impression, n = 20 microgels dans une expérience, ****p < 1E-10, ns (non significatif) = 0,74, test t de Student bilatéral non apparié. e La production d'éthanol à partir de levure pendant 12 heures dans un environnement sans oxygène, qui est normalisée par les poids de l'échafaudage, n = 3 expériences biologiques indépendantes. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type et les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Nous avons ensuite étendu l'application aux bioprocédés basés sur des consortiums microbiens6. Grâce à des microgels noyau-enveloppe interconnectés, les échafaudages PAM possèdent non seulement une porosité contrôlable, mais également la capacité de séparer les communautés multi-espèces dans des microgels séparés (Fig. 5a), ce qui, ensemble, effectue un transfert plus efficace des nutriments et des métabolites entre l'échafaudage et l'environnement. ainsi que des espèces en interaction tout en empêchant leur croissance compétitive. Nous avons ensuite examiné si cette méthode pouvait améliorer les bioactivités des consortiums microbiens immobilisés grâce à une division spatiale du travail (Fig. 5b) par rapport au mélange direct des consortiums. Dans un premier temps, nous avons étudié un système microalgues-bactéries composé de Chlorella vulgaris photoautotrophe et de Bacillus subtilis aérobie (Fig. 5c) pour sa capacité à bioremédier le methyl orange3,50 et l'amoxicilline51. Dans ce consortium microbien, les microalgues fixent le dioxyde de carbone émis par les bactéries dans des sources de carbone tout en produisant de l'oxygène par photosynthèse pour que les bactéries respirent (Fig. 5c), ce qui améliore ainsi sa capacité de bioremédiation en bénéficiant réciproquement à la croissance des deux microbes52,53. Premièrement, pour démontrer le processus de bioremédiation, des échafaudages PAM hétérogènes immobilisant le consortium dans des microgels séparés ont été fabriqués et immergés dans des eaux usées synthétiques contenant de la méthylorange ou de l'amoxicilline (Fig. 12a supplémentaire). Plus de 90 % de l'amoxicilline (300 mg/L) ont été éliminés en 24 heures et environ 15 % pour le méthyl orange (100 mg/L). Pour examiner si une telle stratégie de séparation spatiale augmente la bioremédiation, des échafaudages homogènes, dans lesquels le consortium a été encapsulé dans les mêmes microgels, ont été testés, ainsi que des échafaudages immobilisant des monocultures de microalgues et de bactéries, respectivement. Le résultat (Fig. 5d) démontre que les deux populations microbiennes uniques immobilisées pouvaient éliminer le méthyl orange avec une efficacité similaire sur 24 heures, mais les échafaudages homogènes étaient plus efficaces dans la bioremédiation malgré une charge cellulaire réduite de moitié pour les deux microbes, suggérant l'effet synergique de le consortium. Plus important encore, les échafaudages hétérogènes ont remédié à beaucoup plus de méthyl orange (Fig. 5d), indiquant une capacité de biotraitement améliorée. Cependant, nous avons également observé qu'après 48 heures, les échafaudages hétérogènes étaient tous dégradés et liquéfiés (Fig. 13a supplémentaire), ce qui était causé par l'hydrolyse des échafaudages par des protéases microbiennes dont la concentration augmentait avec le temps en 48 heures (Fig. 12b). Nous avons cherché à utiliser ce phénomène comme mesure qualitative supplémentaire de la bioactivité microbienne du consortium (Fig. 5e). Quatre échafaudages PAM de l'arrangement exact comme le précédent ont été fabriqués et immergés dans le milieu BG11 (Fig. 5e et Fig. 13b supplémentaire). Nous avons à nouveau observé un schéma similaire : alors que l'échafaudage immobilisant les microalgues a commencé à se décomposer après 24 heures, pendant 72 heures, l'échafaudage avec des bactéries a conservé en grande partie sa structure, car le milieu déficient en nutriments est défavorable à la croissance de Bacillus subtilis. Dans les 24 heures, l'échafaudage hétérogène a commencé à se désintégrer en fragments plus petits, tandis que l'échafaudage homogène a conservé son intégrité structurelle jusqu'au jour 3 (Fig. 13c supplémentaire).

a Les échafaudages PAM immobilisent et séparent les consortiums microbiens dans l'espace microscopique, ce qui empêche la croissance compétitive tout en permettant un transfert de masse plus efficace des métabolites entre les espèces. Les cercles et les triangles représentent les métabolites sécrétés par les microbes. b Les microgels core-shell chargés de cellules sont coincés et imprimés dans des échafaudages. Les échafaudages hétérogènes et homogènes sont définis comme : une population mixte de microgels contenant deux espèces de micro-organismes différentes, respectivement, et une population homogène de microgels contenant un mélange de deux micro-organismes. c–e Un modèle de mutualisme de consortiums microbiens. c Représentation schématique de la relation entre Chlorella vulgaris et Bacillus subtilis. d Biorestauration du méthylorange par des échafaudages hétérogènes, des échafaudages homogènes et des échafaudages immobilisant des monocultures de microalgues et de bactéries, respectivement, n = 3 expériences biologiques indépendantes. e Caractérisation de la désintégration de l'échafaudage en 72 heures. Le symbole fermé marque un échafaudage ininterrompu tandis que l'échafaudage de symbole ouvert se désintègre nettement. Pour toutes les expériences, les échafaudages sont soumis à une condition de lumière/obscurité cyclique de 12h12 et incubés à 25 oC. f–h Un modèle de croissance compétitive de consortiums microbiens. f Le consortium microbien synthétique d'Escherichia Coli et de Meyerozyma guilliermondii génétiquement modifiés pour la production de 2-PE à partir de glucose60. Les gènes surexprimés sont marqués en rouge. Le gène croisé tyrA est éliminé. g La production de 2-PE à partir d'échafaudages hétérogènes sur 6 jours, qui est normalisée par les poids d'échafaudage respectifs, n = 3 expériences biologiques indépendantes. h Comparaison des bioprocédés en termes de production normalisée de 2-PE sur 3 jours, n = 3 expériences biologiques indépendantes. *p = 0,021, ns = 0,069, test t de Student bilatéral non apparié. Pour les deux échafaudages, la production est normalisée par les poids d'échafaudage correspondants ; pour la culture liquide, la CMC contenant des consortiums est directement inoculée dans des milieux, dont la charge cellulaire est la même que les échafaudages, et la production de 2-PE est normalisée aux poids moyens des échafaudages hétérogènes et homogènes combinés. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type et les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Enfin, nous avons testé un consortium de champignons-bactéries synthétiques pour fermenter le glucose en 2-phényléthanol (2-PE) (Fig. 5f). Dans cette cascade enzymatique (Fig. 5f et Fig. 14 supplémentaire), la source de carbone est d'abord convertie par Escherichia Coli en l-phénylalanine intermédiaire qui est ensuite métabolisée en 2-PE par Meyerozyma guilliermondii, une espèce de levure qui est signalée à produire et tolérer une forte concentration de 2-PE5460. Comme les deux micro-organismes utilisent le glucose comme source de carbone, ils forment une relation compétitive. En culture liquide où deux microbes sont simplement mélangés, le M. guilliermondii deviendrait toujours l'espèce dominante sur 96 heures, quel que soit le taux d'inoculation initial (Fig. 15 supplémentaire). Pour caractériser le processus de biofabrication de 2-PE à partir d'échafaudages contenant un consortium, nous avons d'abord mesuré la cinétique de production de 2-PE avec les échafaudages hétérogènes en milieu synthétique. Une population mixte de microgels encapsulés respectivement par E. coli ou M. guilliermondii a été fabriquée dans des échafaudages et incubée dans le milieu de culture pour fermenter le glucose en 2-PE (Fig. 16 supplémentaire). Le résultat affiche (Fig. 5g) une cinétique sigmoïdale qui a culminé vers le jour 2 et s'est progressivement stabilisée après 3 jours de fermentation. Ensuite, nous avons comparé le rendement en 2-PE entre deux ensembles différents d'échafaudages (Fig. 5h). Remarquablement, une concentration de 2-PE plus de six fois plus élevée a été détectée dans le bouillon de fermentation contenant des échafaudages hétérogènes que leurs homologues homogènes en 3 jours. Nous avons également constaté qu'il y avait plus de 2-PE provenant des échafaudages homogènes par rapport à la culture liquide (Fig. 5h), ce qui était peut-être attribué au contact physique plus étroit de deux micro-organismes apportés par le confinement de la croissance dans des microgels. Enfin, nous avons examiné la réutilisation des échafaudages pour la production par lots de 2-PE (Fig. 16 supplémentaire). Les échafaudages pourraient conserver leur intégrité pendant le premier lot (3 jours) ; malgré un effondrement structurel progressif, les échafaudages n'étaient pas complètement compromis après 4 traitements par lots consécutifs (12 jours au total). Cependant, la production de 2-PE a considérablement diminué (Fig. 16g supplémentaire), en particulier pour les échafaudages hétérogènes, qui ont diminué de 70 % au deuxième lot alors que 20 % pour les échafaudages homogènes. La production de 2-PE pour les deux échafaudages s'est détériorée lot par lot et s'est presque complètement arrêtée après le troisième lot ; néanmoins, les échafaudages hétérogènes produisaient encore plus de 2-PE (Fig. 16g supplémentaire). La baisse des performances des échafaudages pourrait être causée par la fuite et le rattachement des cellules à la surface interne de l'échafaudage qui perturbe l'équilibre de croissance de deux espèces microbiennes, car elles ne peuvent pas être entièrement éliminées par des milieux frais entre les lots.

Pris dans leur ensemble, les travaux présentés ici décrivent une approche de construction de matériaux vivants via une routine commune de bio-impression par extrusion. Grâce à une méthode de microgel à double mise en réseau, des matériaux vivants fonctionnels macroscopiques stabilisés de manière covalente peuvent être imprimés et facilement déployés pour la bioremédiation et la biofabrication. Nous avons utilisé des microgels core-shell comme blocs de construction et malgré l'inévitable fuite cellulaire6,7, nous avons constaté qu'une telle stratégie peut atténuer ce problème par rapport aux microgels non core-shell. De plus, à l'aide d'un modèle de monoculture de levure, une production d'éthanol sévèrement retenue a été observée dans des échafaudages de microgels non noyau-coque, ce qui suggère une meilleure adéquation des microgels noyau-coque pour la culture cellulaire. De plus, des microgels chargés de microbes ont été utilisés pour organiser spatialement les communautés cellulaires, à partir desquelles une distribution hétérogène de cellules peut être établie pour favoriser les communications inter-espèces de consortiums microbiens au milieu de la génération de morphologies programmables par impression par extrusion. Nos résultats démontrent des bioactivités remarquablement améliorées de deux consortiums microbiens différents. Bien que le matériau à base de protéines ne soit peut-être pas le choix le plus idéal pour les applications microbiennes en raison de sa sensibilité à l'hydrolyse des protéases, nous envisageons des efforts futurs d'utilisation de matériaux plus robustes mécaniquement pour de telles applications. Nous montrons également que les microgels core-shell peuvent cultiver des sphéroïdes cellulaires de mammifères61 ; combinés à la microfluidique des gouttelettes et à la stratégie de double mise en réseau du microgel, ils promettent d'être utilisés comme éléments de base pour construire des structures à haute densité cellulaire. En conclusion, nous pensons que notre méthode proposée représente un paradigme précieux pour construire des matériaux vivants fonctionnels pour le biotraitement microbien et détient également un potentiel pour la biofabrication avancée55.

La gélatine méthacryloyle (gelMA) a été synthétisée selon un protocole publié33. La gélatine de peau de porc (Shanghai Aladdin Biochemical Technology) a été dissoute dans de l'eau déminéralisée à 50 ° C jusqu'à une concentration finale de 10 % (p/v, les concentrations sont toutes désignées par p/v ou autrement). 0,6 g d'anhydride méthacrylique (Shanghai Macklin Biochemical) a été ajouté goutte à goutte à la solution de gélatine homogène pour 1 g de gélatine. La réaction a été effectuée à 50 ° C pendant 1 h et terminée en ajoutant deux volumes d'eau déionisée préchauffée, après quoi le mélange a été centrifugé pendant 3 min à 3500 × g. Les surnageants ont été décantés et dialysés contre de l'eau déminéralisée à 30°C en utilisant un tube de dialyse d'un seuil de poids moléculaire de 12 kDa pendant 7 jours. Après dialyse, la solution acide de gelMA a été ajustée à pH = 7,4, congelée instantanément par de l'azote liquide et lyophilisée jusqu'à hydratation totale en mousse blanche poreuse. La modification de la gélatine a été vérifiée par résonance magnétique nucléaire 1H (RMN). La gélatine et le gelMA ont été dissous dans de l'oxyde de deutérium, de manière réceptive, et les spectres (Fig. 1 supplémentaire) ont été collectés à une fréquence de 400 MHz à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance III HD avec une sonde inverse à gradient à axe unique. Pour estimer le degré de fonctionnalisation (DoF), les signaux de proton de lysine méthylène intégrés ont été normalisés par le signal de proton aromatique respectif dans les spectres (Fig. 1 supplémentaire), et le DoF de gelMA a été calculé comme suit :

Les dispositifs microfluidiques ont été fabriqués par un protocole standard de lithographie douce56. En bref, le photorésist négatif SU-8 (matériaux avancés Kayaku) a été appliqué par centrifugation sur une plaquette de silicium et cuit doucement sur une plaque chauffante à 95 ° C. Un photomasque avec une géométrie de dispositif définie a ensuite été placé sur la plaquette et exposé sous une lumière UV collimatée (URE-2000/35 L, Institut d'optique et d'électronique, Académie chinoise des sciences) pour durcir la zone de canal représentée, suivi d'une post-cuisson à 95 °C et développement SU-8 (révélateur SU-8, matériaux avancés Kayaku). Des dispositifs microfluidiques à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été fabriqués par lithographie douce. Les élastomères PDMS (kit DOWSILTM Sylgard 184) ont été mélangés avec des agents de durcissement dans un rapport de 10:1 (p/p) avant d'être versés sur le maître développé dans une boîte de Pétri. Le PDMS non durci a ensuite été dégazé et incubé à 65 ° C pour se solidifier. Après cela, PDMS avec canal de dispositif a été découpé dont les entrées et les sorties ont été perforées avec des trous de 0,75 mm. Les dispositifs et les lames de verre ont ensuite été traités au plasma (PDC-002-HP, Harrick Plasma) pendant 1 min, collés les uns aux autres et cuits à 65 ° C pendant 10 min. Pour la modification hydrophobe des canaux, les canaux du dispositif ont été traités avec 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriéthoxysilane (Sigma-Aldrich) pendant 2 min.

Deux méthodes de préparation des échantillons ont été employées dans ce travail. Pour l'imagerie de la morphologie de surface des microgels, le séchage au point critique (CPD) a été utilisé : premièrement, l'huile de support a été retirée et les échantillons photo-durcis ont été directement remis en suspension dans de l'éthanol à 50 %. Les microgels ont été progressivement déshydratés consécutivement par 75 % et 100 % d'éthanol pendant deux jours au total avant le CPD. Les microgels ont été transférés dans des capsules d'échantillons microporeuses (78 µm, Agar Scientific) qui ont été placées dans une nacelle d'échantillons remplie d'éthanol à 100 %. Le bateau spécimen a été inséré dans un séchoir à point critique (E3100, Quorum Technologies) et rincé au moins quatre fois avec du CO2 liquide. Après rinçage, l'échantillon a été chauffé à 37°C à une pression de 80 bars pour sécher. Pour imager la morphologie de surface des échafaudages PAM, l'échantillon a été lyophilisé : brièvement, l'échafaudage PAM a été congelé dans de l'azote liquide et directement déshydraté dans un lyophilisateur pendant la nuit. Pour l'imagerie SEM, les échantillons ont été montés sur des talons SEM en aluminium à l'aide de tampons collants en carbone conducteur et recouverts d'iridium 15 nm à l'aide d'une coucheuse à pulvérisation K575X (Quorum Technologies). Un microscope électronique à balayage FEI Verios 460 a été utilisé pour l'imagerie.

La caractérisation rhéologique de l'encre microgel bloquée et des échafaudages PAM a été réalisée à l'aide d'une géométrie de plaques parallèles (diamètre de 20 mm, écart de 1 mm) montées sur des rhéomètres à contrainte contrôlée (rhéomètre Thermo Scientific HAAKE MARS 40/60). Des microgels coincés ont été préparés de la même manière et moulés selon une géométrie identique aux plaques. Les échafaudages PAM ont été formés par un rayonnement de lumière bleue de 300 s. Pour la stratégie de réticulation inversée, les microgels bloqués remis en suspension avec des enzymes ont été autorisés à recuire pendant 30 min dans une boîte de Petr scellée avant les mesures. Les courbes d'amincissement par cisaillement ont été obtenues dans des mesures contrôlées par la vitesse de déformation avec une déformation de 1 % et des taux de cisaillement de 0,01 à 10 s−1. Le comportement de récupération de l'encre a été réalisé par un balayage par étapes où une faible contrainte (1%) et une forte contrainte (90%) ont été cyclées toutes les 100 s avec une fréquence de 1 Hz. Des tests de balayage de déformation ont été effectués avec une fréquence de 1 Hz et une déformation de 0 à 1000 %. Les modules ont été calculés à partir de la région viscoélastique linéaire des diagrammes de balayage de déformation. Les tests de balayage de déformation avant et après recuit n'étaient pas appariés. La caractérisation rhéologique de la solution de polymère CMC à 1 % a été réalisée à l'aide de la même machine avec une géométrie de plaque différente (diamètre 35 mm, espacement de 1 mm). Les courbes d'amincissement par cisaillement ont été obtenues dans des mesures contrôlées par la vitesse de déformation avec une déformation de 1 % et des taux de cisaillement de 0,01 à 100 s−1. Le balayage de fréquence a été effectué avec une contrainte de 1 % et une fréquence de 0 à 10 Hz. Toutes les mesures ont été effectuées à température ambiante.

La gélatine et le gelMA ont été dissous dans du PBS à une concentration finale de 15 %, respectivement, et maintenus à 37 °C pour empêcher la gélification induite par la chaleur. La solution mère de carboxyméthylcellulose à 1 % (CMC, Shanghai Aladdin Biochemical Technology) dopée avec 10 U/ml de transglutaminases (200 U/g, Shanghai Yuanye Biotechnology) a été maintenue à 4 °C. Pour les expériences biologiques, tous les polymères ont été dissous dans leur milieu de culture correspondant. Ensuite, des solutions de gélatine et de gelMA ont été mélangées dans un rapport de 1: 2 (v / v) pour donner un mélange de polymères contenant 5% de gélatine et 10% de gelMA (appelé solution d'hydrogel), qui a ensuite été dopé avec 0, 5% LAP photoinitiateurs (Shanghai Bide Pharmatech). Indépendamment de l'implication des cellules, toutes les solutions de polymères ont été filtrées à la seringue (0,22 µm, Millex Syringe Filters) avant les expériences microfluidiques. Toutes les solutions ont été chargées dans des seringues en plastique stériles de 1 ml. La solution d'hydrogel a été placée à 37°C et CMC à 4°C.

Des gouttelettes noyau-enveloppe ont été générées dans une puce microfluidique à focalisation de flux caractérisée par une hauteur de canal de 100 µm et une dimension de jonction de 150 × 150 µm (Fig. 2a supplémentaire). La solution d'hydrogel et la CMC ont été déplacées dans le dispositif par des pompes à seringue (TYD01-02, Lead Fluid) via les canaux latéraux et le canal central, respectivement. À la jonction du dispositif, le CMC a été englouti par la solution d'hydrogel et, ensemble, ils ont été cisaillés par le fluorocarbone Novec 7500 (3 M) contenant 0, 1% (v / v) de tensioactifs Pico-surf (Sphere Fluidics) agissant comme phase continue. Les débits ont été contrôlés par des pompes à seringue à 40, 8, 2 µL/min pour l'huile, la solution d'hydrogel et la CMC, respectivement. Comme la concentration relativement élevée de la solution d'hydrogel a facilement provoqué une gélification induite par la chaleur, un sac d'eau chaude a été placé au-dessus des seringues et le tube a été enveloppé par un coussin chauffant sur mesure.

La formation du premier réseau covalent a été catalysée par des transglutaminases indépendantes du calcium, où la lysine et la glutamine ont été réticulées par une nouvelle liaison isopeptidique. Pour réticuler complètement les gouttelettes, elles ont été incubées à température ambiante pendant une nuit. Les gouttelettes durcies ont été désémulsifiées en ajoutant 20 % (v/v) de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol (PFO, Shanghai Bide Pharmatech) dans du Novec 7500 à la suspension de microgel. Les microgels se sont rapidement agglomérés, ce qui a facilité l'élimination de la plupart des phases huileuses, après quoi ils ont été centrifugés à 2000 tr/min (~ 280 × g) pendant 10 min, et l'huile résiduelle au fond du tube a été aspirée. Les microgels ont ensuite été semi-trempés, c'est-à-dire que les microgels générés à partir de 1 h de fonctionnement microfluidique (600 µL de phase dispersée) ont été directement remis en suspension avec 150 µL de PBS contenant 0,5 % de LAP dans des tubes centrifuges via vortex pour donner une imprimabilité satisfaisante sans aucune perte de microgels. Pour imprimer par extrusion des échafaudages microscopiquement hétérogènes, des microgels de compositions variables, par exemple, fonctionnalisés avec différents fluorophores ou contenant différents microbes, ont été soigneusement mélangés avant la désémulsification.

Pour imprimer par extrusion des microgels à l'aide d'une imprimante 3D commerciale (EFL-BP-6601, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, Chine), des agrégats de microgel ont été chargés dans une cartouche d'impression de 5 ml et dégazés manuellement. L'encre microgel coincée a été déposée pneumatiquement avec une pression d'impression d'environ 50 kPa et une buse d'impression de 18 G (diamètre intérieur : 840 µm, non conique, Nordson EFD). La vitesse d'écriture a été manipulée par un bras robotique et ajustée ad hoc pour être en phase avec la vitesse d'extrusion. Les formes d'impression ont été prédéfinies dans l'interface utilisateur fournie par le fabricant de l'imprimante 3D. Les échafaudages ont été imprimés sur une lame de verre propre et irradiés pendant 300 s par une lumière bleue de longueur d'onde de 405 nm (intensité lumineuse 25 mW/cm2, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, Chine), résultant en échafaudages de microgel interconnectés et stabilisés de manière covalente . Pour les échafaudages avec la stratégie de réticulation inversée, les gouttelettes ont d'abord été durcies par le rayonnement de lumière bleue pendant 300 s, désémulsifiées par PFO et remises en suspension avec une quantité équivalente de PBS enrichi de 10 U/g de transglutaminases, avant d'être extrudées et modelées en échafaudages et autorisées pour recuit inter-microgel pendant 30 min dans une boîte de Petri scellée. Des microgels fluorescents ont été générés à partir d'un mélange de gélatine avec du gelMA marqué au fluorophore (vert : ELF-GM-GF-60, rouge : ELF-GM-RF-60 ; Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, Chine).

Des gouttelettes de tailles différentes ont été générées en premier (Fig. 4a supplémentaire), où le débit global de la phase dispersée a été maintenu constant, 10 µL/min, tandis que celui de la phase continue a été modifié. Les gouttelettes ont été collectées par lots toutes les 30 minutes, puis incubées à température ambiante pendant une nuit, après quoi elles ont été désémulsifiées par PFO et remises en suspension avec 75 µL de PBS contenant du LAP. Ensuite, les microgels ont été centrifugés à 10 000 tr/min (~ 6900 × g) pendant 5 min et sédimentés uniformément au fond du tube. Le deuxième réseau a été formé par un rayonnement de lumière bleue pendant 300 s. Pour digérer les échafaudages PAM, 100 µL de trypsine (Beyotime Biotechnology) ont été déposés au sommet de l'échafaudage et incubés à 37 °C. Toutes les 15 min, l'échafaudage restant a été centrifugé à 10 000 tr/min (~ 6900 × g) pendant 1 min et le surnageant a été aspiré, suivi d'un ajout de 100 µL de trypsine fraîche et d'une incubation. Pour l'hydrogel en vrac, 240 µL de solution d'hydrogel contenant 0,5 % de LAP et 60 µL de 1 % de CMC dopés avec 10 transglutaminases U/mL ont été vigoureusement mélangés et incubés à température ambiante pendant la nuit. Avant la digestion protéolytique, l'hydrogel en vrac a également été soumis à un rayonnement de lumière bleue de 300 s. Pour les microgels non recuits, des microgels de taille moyenne ont été générés et incubés de la même manière ; avant la désémulsification, la suspension de microgel a été irradiée par la lumière bleue pendant 300 s et donc les microgels n'étaient pas interconnectés pour former un échafaudage. Les poids des hydrogels ont été calculés en soustrayant le poids des tubes vides et normalisés par le poids de départ des hydrogels :

L'Escherichia coli DH5α utilisé dans ce travail portait un plasmide de détection de quorum (pTetR-LasR-pLuxR-eGFp) qui détecte la présence de la molécule signal de N-(3-Oxodécanoyl)-L-homosérine lactone (3-Oxo-C12- HSL) et rapporte via l'expression de eGFP, qui était précédemment utilisée dans un autre de nos travaux45. Milieu Luria-Bertani (LB) (1 L) : 10 g de tryptone, 10 g de NaCl et 5 g d'extrait de levure. Le pH de la solution a été ajusté à 7,0 et autoclavé avant utilisation. E. coli ont été sous-cultivés dans le milieu LB avant les expériences d'encapsulation.

Tous les polymères ont été dissous par le milieu LB. Les cellules E. coli transfectées avec eGFP ont été mises en suspension dans la solution de CMC à 1 % jusqu'à une concentration cellulaire finale de DO = 0,1 pour la culture cellulaire (Fig. 3). Des gouttelettes ont été générées et ont été durcies immédiatement par un rayonnement de lumière bleue pendant 300 s. Ensuite, les microgels chargés de cellules ont été désémulsifiés et remis en suspension par une quantité excessive de milieu LB additionné de 10-6 mol/L de 3-Oxo-C12-HSL (Sigma-Aldrich) avant incubation à 37 ° CE coli. la culture dans des microgels sans noyau-enveloppe a été réalisée exactement de la même manière, sauf que la phase contenant les cellules était dépourvue de CMC. Des suspensions de microgels de 50 µL ont été aliquotées à 0, 12 et 24 h et imagées sous un microscope à fluorescence inversé (Olympus IX73).

La quantité de cellules qui ont fui des microgels vers leur milieu a été déterminée par des expériences de placage. Après 24 heures de culture cellulaire, 100 µL de milieu ont été aliquotés et dilués par 105, 106 et 107 fois, respectivement, puis étalés sur des plaques de gélose LB. L'UFC a été calculée après 24 heures d'inculcation à 37°C en courtisant les colonies formées sur les plaques. Les expériences ont été réalisées en triple.

A549 et HEK 293 T provenaient du groupe Narita de l'Université de Cambridge et ont été obtenus auprès de l'American Type Culture Collection. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, GibcoTM 31053044), additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS, GibcoTM A3160801), de l-glutamine 2 mM (GibcoTM 25030024), de pyruvate de sodium 1 mM (GibcoTM 11360070 ) et 0,5 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (GibcoTM 15070063).

Tous les polymères ont été dissous par le milieu de culture cellulaire. Les cellules HEK 293 T (10 millions/mL) ont été mises en suspension dans la solution de CMC à 1 % avant l'encapsulation. Pour la vérification du processus de Poisson (Fig. 9 supplémentaire), des cellules A549 ont également été encapsulées à titre de comparaison. Des gouttelettes ont été générées par le protocole susmentionné. Les gouttelettes chargées de cellules ont été durcies lors de la collecte par un rayonnement de lumière bleue de 300 s, désémulsifiées et remises en suspension dans du DMEM, suivies d'une incubation à 37 ° C et 5 % de CO2.

Les microgels chargés de cellules ont été aliquotés et imagés après encapsulation cellulaire. Le nombre de cellules dans chaque microgel a été compté manuellement et la fréquence a été tracée. Pour s'adapter au modèle de stochasticité de Poisson, le nombre moyen de cellules à l'intérieur des microgels a été calculé et, par conséquent, le modèle théorique de Poisson a pu être tracé :

Où k représente le nombre observé de cellules encapsulées dans les microgels noyau-enveloppe et λ le nombre moyen de cellules encapsulées dans les microgels.

La viabilité cellulaire de HEK 293 T a été évaluée à l'aide du kit de coloration Live/Dead (Invitrogen). Aux jours 0, 3 et 6, 30 µL de suspension de microgels ont été aliquotés et incubés à 37 °C pendant 30 min dans un milieu contenant 4 µM de calcéine acétoxyméthyle (calcéine AM) et 2 µM d'éthidium homodimère-1 (EthD-1), avant imagerie par un microscope à épifluorescence Leica DMI6000B.

La croissance des sphéroïdes a été quantifiée par leur surface et leur circularité par le logiciel FIJI. Plus précisément, les images de fluorescence de deux canaux, Live et Dead, ont été fusionnées et seuillées en images binaires, après quoi la zone (A) et le périmètre (P) des sphéroïdes ont pu être directement mesurés par FIJI. La circularité des sphéroïdes a été calculée comme suit :

Des suspensions de microgel de 500 µL ont été aliquotées et centrifugées à 3 500 tr/min (~ 850 x g) pendant 5 min et le surnageant a été aspiré. Les microgels ont ensuite été incubés à température ambiante pendant 30 min avec 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % et lavés intensément avec du PBS après incubation. Ensuite, les microgels ont été remis en suspension dans 100 µL de PBS avec 0,1 % de Triton X-100 (Fisher Bioreagents BP151-500, Thermo Fisher). Des solutions mères de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) et Alexa FluorTM 647 phalloïdine (Invitrogen) ont été ajoutées et diluées respectivement par le facteur 1000 et 40, suivies d'une incubation de 30 min à température ambiante. température. Enfin, les microgels ont été lavés au moins deux fois et remis en suspension dans du PBS. La visualisation de la culture à base de monocouche a suivi le même protocole. L'organisation spatiale des noyaux et de la f-actine a été imagée à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SP8. Les canaux Z ont été collectés tous les 10 µm pour la construction de la structure 3D des sphéroïdes. L'imagerie des cellules monocouches a été réalisée par un microscope à fluorescence (Olympus IX73).

La levure Saccharomyces cerevisiae a été achetée chez Fleischmann's Rapid Rise et activée dans le milieu YPD pendant 12 heures avant les expériences d'encapsulation cellulaire. Milieu YPD (1 L) : extrait de levure 10 g, peptone 20 g et dextrose 20 g. Les milieux de culture ont été autoclavés avant utilisation.

Toutes les solutions de polymères ont été dissoutes par le milieu YPD. Des gouttelettes noyau-enveloppe chargées de cellules ont été générées avec une DO de levure = 0, 8 et incubées à température ambiante pendant une nuit pour être durcies. Des échafaudages en treillis 3 × 3 à deux couches (dimension : environ 20 × 20 × 2 mm) ont été extrudés à la main dans une enceinte de sécurité biologique et irradiés à la lumière bleue pendant 300 s avant immersion dans un milieu YPD de 1,5 mL pour la fermentation à l'éthanol. Les milieux ont été barbotés avec de l'azote gazeux pendant 5 min pour éliminer l'oxygène et les flacons en verre ont été scellés pendant la fermentation. Pour générer des microgels de tailles variées, deux dispositifs microfluidiques et différents débits ont été utilisés. Les microgels noyau-enveloppe A et B ont été générés avec un dispositif de focalisation de flux avec une dimension de jonction de 150 × 150 µm et une hauteur de canal de 100 µm. Des microgels noyau-enveloppe C ont été générés avec un dispositif de même conception mais avec une dimension de jonction de 100 × 100 µm et une hauteur de canal de 75 µm. Le rapport volumique entre la coque et la phase centrale a été calculé comme suit :

Où R1 est le diamètre du microgel core-shell et R2 le core, mesuré par le logiciel FIJI.

50 µL de milieu ont été aliquotés toutes les 2 heures pendant 12 heures et centrifugés à 10 000 tr/min (~ 6900 × g) pendant 5 min. Le surnageant a été filtré (0,22 µm) et analysé par chromatographie en phase gazeuse (GC, Agilent gc 6890n) à l'aide d'une colonne DB-1701 (Agilent, 30 m × 0,25 mm). La concentration d'éthanol a été dérivée d'une courbe standard d'éthanol.

La microalgue Chlorella vulgaris a été achetée à Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd et directement repiquée. La bactérie Bacillus subtilis était un cadeau du laboratoire du professeur Su Chen à l'Université Nanjing Tech3. Avant les expériences d'encapsulation, Bacillus subtilis ont été cultivés dans le milieu LB à 37 ° C et Chlorella vulgaris ont été cultivés dans le milieu BG11 (Qingdao Haibo Biotechnology) et incubés à 25 ° C avec une intensité lumineuse de ~ 10000 lux et des cycles de lumière / obscurité conditions toutes les 12 h (MQT-60G, Shanghai Minquan Instrument). Recettes de milieux pour la bioremédiation : bioremédiation à l'amoxicilline : 300 mg/L d'amoxicilline (Shanghai Yuanye Biotechnology) dans le milieu BG11. Bioremédiation du méthylorange3 : 100 mg/L de méthylorange (Shanghai Aladdin Biochemical Technology), 22,16 mg/L de NH4Cl, 6,57 mg/L de KNO3, 1,08 mg/L de NaNO2, 5,09 mg/mL de KH2PO4. L'amoxicilline/méthyl orange a été dissoute dans le reste du support respectif après autoclavage, et le support complet a été filtré à la seringue (0,22 µm) avant les expériences microfluidiques.

Tous les polymères ont tous été dissous par les milieux correspondants sans amoxicilline/méthyl orange. Des gouttelettes noyau-enveloppe chargées de cellules ont été générées avec une DO = 0, 4 pour les deux microbes, respectivement, et incubées à température ambiante pendant une nuit pour être guéries. Des échafaudages en treillis 3 × 3 à trois couches (dimension: environ 20 × 20 × 3 mm) ont été extrudés à la main dans une enceinte de sécurité biologique et irradiés à la lumière bleue pendant 300 s avant immersion dans un milieu de 6 ml pour la bioremédiation (contenant de l'amoxicilline / méthyl orange pour la bioremédiation, milieu BG11 pour l'expérience de biodégradation des échafaudages). Pour imprimer des échafaudages hétérogènes, des microgels noyau-enveloppe encapsulant une monoculture de bactéries ou de microalgues ont été mélangés uniformément avant la désémulsification et imprimés ensemble dans des échafaudages. Pour les échafaudages homogènes, les suspensions cellulaires ont été mélangées à 1:1 (v/v) avant l'encapsulation microfluidique. Les échafaudages ont été incubés à 25 ° C avec une intensité lumineuse d'environ 10 000 lux et des cycles de conditions de lumière/obscurité toutes les 12 h pour la bioremédiation. La désintégration des échafaudages a été surveillée toutes les 24 heures.

150 µL de milieu ont été aliquotés à 6, 12, 18 et 24 h après l'incubation et centrifugés à 10 000 tr/min (~ 6 900 × g) pendant 5 min. Le surnageant a été filtré à la seringue avant analyse. La concentration de méthyl orange a été mesurée par un spectrophotomètre UV-Vis (UV-3600, Shimadzu) et comparée à une courbe standard dans les milieux correspondants. La concentration d'amoxicilline a été mesurée par chromatographie liquide haute performance (HPLC, LC-20AD, Shimadzu) équipée d'une colonne C18 (colonne Waters SunFire C18, 5 µm, 4,6 × 250 mm) et comparée à une courbe standard d'amoxicilline dans les milieux correspondants. La concentration de protéases dans les milieux hétérogènes a été mesurée à l'aide d'un kit disponible dans le commerce (D799673-0050, Sangon Biotech) et en suivant les instructions du fabricant.

Toutes les souches ont été obtenues auprès du professeur Wenming Zhang de la Nanjing Tech University60. Souches : Champignon M. guilliermondii MG57 : mgpdc-mgadh-scaro10-scgap-scaro80-mggdh. Les gènes surexprimés mgpdc, mgadh et mggdh provenaient de M. guilliermondii57, et scaro10, scgap et scaro80 provenaient de Saccharomyces cerevisiae58,59. Bactérie Escherichia coli YLC20 : Escherichia coli W1485 contenant des plasmides pour la surexpression des gènes aroF et pheA et pour l'inactivation CRISPR/Cas9 du gène tyrA.

Solution saline 100× (dans 1 L) : 100 g NaCl, 50 g MgCl2·6H2O, 20 g KH2PO4, 30 g NH4Cl, 30 g KCl et 1,5 CaCl2·2H2O. La solution a été autoclavée avant utilisation. Solution d'oligoéléments (TES, dans 1 L) : 2 g Al2(SO4)3·18H2O, 0,75 g CoSO4·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 0,5 g H3BO3, 24 g MnSO4·7H2O, 2,5 g NiSO4·6H2O, 15 g ZnSO4·7H2O et 3 g Na2MoO4·2H2O. Milieu synthétique (dans 1 L) : 3 g MgSO4, 3 g KH2PO4, 1 g NaCl, 5 g (NH4)2SO4, 0,015 CaCl2·2H2O, 0,1125 FeSO4·7H2O, 1 g citrate trisodique, 10 g extrait de levure, 0,3 g l -tyrosine, 0,5 g de base azotée de levure et 2,3 g d'acide N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-2-aminoéthanesulfonique. La solution a été autoclavée puis additionnée de 45 g de glucose autoclavé séparément et filtré à l'aide d'une seringue de 0,22 µm de 0,075 g de vitamine B1 et de 0,04 g de sulfate de kanamycine. Après cela, la solution saline 100 × autoclavée a été ajoutée au mélange par une portion de 10 mL par 1 L de milieu, avec le TES autoclavé 1,5 mL/L et le volume du mélange a été ajusté à 1 L pour donner le synthétique complet. moyen.

Tous les polymères ont tous été dissous dans le milieu synthétique. Des gouttelettes noyau-enveloppe chargées de cellules ont été générées avec une DO = 0, 5 pour les deux microbes, respectivement, et incubées à température ambiante pendant la nuit pour être guéries. Des échafaudages en treillis 3 × 3 à cinq couches (dimension : ~ 0 × 20 × 5 mm) ont été extrudés à la main dans une enceinte de sécurité biologique et irradiés à la lumière bleue pendant 300 s avant immersion dans 8 mL de milieu pour la fermentation 2-PE. Pour la fermentation de 2-PE à base de culture liquide, afin d'assurer une charge cellulaire équivalente, la même quantité de 1 % de CMC contenant les deux microbes (OD = 0,5 chacun avant de mélanger uniformément) a été aliquotée et incubée aux côtés de groupes de gouttelettes à température ambiante pendant la nuit et inoculée dans 8 ml de milieu synthétique en même temps que les échafaudages ont été submergés. Des échafaudages homogènes et hétérogènes ont été fabriqués de la même manière que les précédents. Tous les échafaudages ont été incubés à 37 ° C pendant les 24 premières heures et déplacés à 30 ° C à partir du jour 2. Les échafaudages après une fermentation discontinue, par exemple, les 3 premiers jours, ont été soigneusement retirés et lavés trois fois par un milieu frais, avant d'être immergés dans un milieu frais de 8 ml pour être réutilisés, ce qui a été répété tous les trois jours pour trois cycles de réutilisation au total. La concentration de 2-PE a été mesurée après chaque lot. Des échafaudages hétérogènes et homogènes ont été réutilisés.

La courbe cinétique des échafaudages hétérogènes a été obtenue à partir de 6 jours de surveillance de la concentration de 2-PE à intervalles de 24 heures. La comparaison entre les échafaudages hétérogènes, les échafaudages homogènes et la culture liquide a été effectuée à la fin du jour 3. 150 µL de milieu ont été aliquotés et centrifugés à 10 000 tr/min (~ 6900 × g) pendant 5 min. Les surnageants ont été filtrés à l'aide d'une seringue (0,22 µm) avant analyse. La concentration de 2-PE a été mesurée par GC (Agilent gc 6890n) équipé d'une colonne DB-1701 (Agilent, 30 m x 0,25 mm) et comparée à une courbe standard.

Toutes les manipulations de données et les analyses statistiques ont été effectuées par Microsoft Excel 2019 et tracées à l'aide de scripts Python (v. 3.8.12) à l'aide des bibliothèques NumPy (v.1.22.1) et Matplotlib (v.3.5.1). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type d'au moins trois répétitions biologiques ou autrement indiqué dans le manuscrit. Toutes les images ont été traitées par FIJI-ImageJ (v 2.0.0-rc-69/1.52i) et Adobe Illustrator 2019 a été utilisé pour concevoir des illustrations et organiser des figures.

Photographies, c'est-à-dire Fig. 1c, Figs supplémentaires. 6a, 16a, sont des images de présentation d'échafaudages imprimés. Micrographies de gouttelettes et de microgels, Figs. 1b, 3a, b, 2e, 4b et supplémentaires 2b, 3a, b, 7a, 9a, 9c, sont des images représentatives d'échantillons aliquotés au hasard au cours de l'une des expériences répétées indépendamment. Micrographies d'échafaudages imprimés, c'est-à-dire Figs. 1c, 2d, f et figures supplémentaires. 3c, 8a–c, sont des images représentatives d'une structure locale d'échafaudages qui avaient une morphologie similaire. Toute la caractérisation rhéologique a été réalisée en trois exemplaires et les Fig. 2a, b et les Fig. 5a – e, g – i supplémentaires sont des graphiques de présentation à partir de résultats similaires. Les données de sphéroïdes cellulaires ont été générées à partir d'échantillons de microgel aliquotés au hasard dans une expérience et la figure 3f et la figure supplémentaire 10 sont des images microscopiques confocales représentatives de sphéroïdes avec des structures cellulaires similaires. Toutes les expériences de biotraitement microbien ont été réalisées en triple exemplaire et la Fig. 13 supplémentaire est un ensemble représentatif d'images de l'expérience de dégradation de l'échafaudage par le consortium microalgues-bactéries.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Source Data. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Programme national clé de recherche et de développement de Chine (2021YFC2104300), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21901117, 32111530117) et State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering (KL20-02) à ZY The Newman Foundation, Wellcome Trust, le Conseil européen de la recherche dans le cadre du septième programme-cadre de l'Union européenne (FP7/2007-2013) par le biais de la subvention ERC PhysProt (accord n° 337969) à TPJK Cancer Research UK (CRUK) Cambridge Institute Core Grant (C9545/A29590) à MN ; Prix ​​​​CRUK Early Detection Pump Priming (C20 / A20976) au Conseil chinois des bourses d'études TK et MN (YO et HZ).

Chengzhi Guo

Adresse actuelle : Department of Chemical Engineering, University College London, Torrington Place, Londres, WC1E 7JE, Royaume-Uni

State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, College of Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 30 Puzhu South Road, Nanjing, 211816, République populaire de Chine

Yangteng Ou, Yang Zhang, Chengzhi Guo et Ziyi Yu

Yusuf Hamied Département de chimie, Université de Cambridge, Lensfield Road, Cambridge, CB2 1EW, Royaume-Uni

Yangteng Ou, Hongjia Zhu, Yanli Zhang et Tuomas PJ Knowles

Cambridge University-Nanjing Center of Technology and Innovation, 126 Dingshan Street, Nanjing, 210046, République populaire de Chine

Yangteng Ou

State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, 30 Puzhu South Road, Nanjing, 211816, République populaire de Chine

Shixiang Cao, Wei Yan, Fengxue Xin et Weiliang Dong

Cancer Research UK Cambridge Institute, Université de Cambridge, Cambridge, Centre Li Ka Shing, Robinson Way, Cambridge, CB2 0RE, Royaume-Uni

Masashi Narita

Laboratoire Cavendish, Université de Cambridge, JJ Thomson Avenue, Cambridge, CB3 0HE, Royaume-Uni

Tuomas PJ Knowles

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YO, TPJK et ZY ont conçu et conçu les expériences. YO a réalisé des expériences, organisé des données et rédigé le manuscrit. SC, Yang Z., HZ et CG ont réalisé des expériences. WY et FX ont fourni les informations et les instructions sur les expériences avec des micro-organismes métaboliquement modifiés. MN a fourni des lignées cellulaires de mammifères et une installation de culture tissulaire. WD et Yanli Z. ont aidé à la révision du document. TK et ZY ont supervisé le projet et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé la version finale de l'article.

Correspondance avec PJ Knowles.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Jianhua Qin et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ou, Y., Cao, S., Zhang, Y. et al. Bioprinting de matériaux vivants fonctionnels microporeux à partir de microgels core-shell à base de protéines. Nat Commun 14, 322 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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Reçu : 10 juin 2022

Accepté : 21 novembre 2022

Publié: 19 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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