Vague

Oct 16, 2023

Military Medical Research volume 9, Article number: 8 (2022) Citer cet article

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Un diagnostic et une classification précoces des infections augmentent le taux de guérison tout en diminuant les complications, ce qui est important pour les infections graves, en particulier pour la chirurgie de guerre. Cependant, les méthodes traditionnelles reposent sur des opérations laborieuses et des appareils encombrants. D'autre part, les méthodes au point de service (POC) souffrent d'une robustesse et d'une précision limitées. Par conséquent, il est urgent de développer des dispositifs POC pour un diagnostic rapide et précis des infections afin de répondre aux exigences militarisées sur site.

Nous avons développé une plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde (WMC) (WMC-MDP). WMC-MDP réduit le temps de détection et améliore la répétabilité grâce au prémélange des échantillons et à la réaction des réactifs. Nous avons en outre combiné la plate-forme de détection avec le système amplifié streptavidine-biotine (SA-B) pour améliorer la sensibilité tout en utilisant l'intensité de la chimiluminescence (CL) comme lecture du signal. Nous avons réalisé la détection simultanée de la protéine C-réactive (CRP), de la procalcitonine (PCT) et de l'interleukine-6 ​​(IL-6) sur la plate-forme de détection et évalué la sensibilité, la plage linéaire, la sélectivité et la répétabilité. Enfin, nous avons terminé la détection de 15 échantillons de volontaires et comparé les résultats avec des kits ELISA commerciaux.

La détection de CRP, PCT et IL-6 a montré de bonnes relations linéaires entre les intensités et les concentrations de CL dans la plage de 1, 25 à 40 μg / ml, 0, 4 à 12, 8 ng / ml et 50 à 1 600 pg / ml, respectivement. La limite de détection de CRP, PCT et IL-6 était de 0,54 μg/ml, 0,11 ng/ml et 16,25 pg/ml, respectivement. WMC-MDP est capable d'une bonne sélectivité et répétabilité adéquates. L'ensemble de la procédure de détection ne prend que 22 minutes, ce qui répond aux exigences d'un appareil POC. Les résultats de 15 échantillons de volontaires étaient cohérents avec les résultats détectés par les kits ELISA commerciaux.

WMC-MDP permet une détection simultanée, rapide et sensible de CRP, PCT et IL-6 avec une sélectivité et une répétabilité satisfaisantes, nécessitant une manipulation minimale. Cependant, le WMC-MDP tire parti du fait qu'il s'agit d'un dispositif microfluidique présentant des coefficients de variation inférieurs à 10 %, ce qui permet au WMC-MDP d'être un type de test au point de service (POCT). Par conséquent, WMC-MDP fournit une alternative prometteuse au POCT de plusieurs biomarqueurs. Nous pensons que l'application pratique du WMC-MDP dans les champs militarisés révolutionnera le diagnostic des infections pour les soldats.

Les infections peuvent entraîner une légère irritation cutanée et une défaillance organique grave si elles ne sont pas traitées, en particulier dans les domaines de la traumatologie et de la chirurgie de guerre. Les infections bactériennes et virales sont les principaux types d'infection [1, 2]. Les infections graves peuvent entraîner une septicémie. Retarder d'une heure le traitement du sepsis augmente le risque de décès de 6 à 10 % [3]. Par conséquent, il est nécessaire d'analyser des biomarqueurs pour un diagnostic et une classification rapides et précis des infections [4,5,6]. La détection multiplex de la protéine C-réactive (CRP) [7], de la procalcitonine (PCT) [8] et de l'interleukine-6 ​​(IL-6) [9] est une méthode fiable pour diagnostiquer avec précision les infections et la septicémie [10]. Dans le sérum humain normal, la teneur en CRP est généralement inférieure à 8 µg/ml. L'élévation de la CRP a une corrélation positive avec la sévérité de l'infection [11]. Des niveaux élevés de CRP sont liés à des infections bactériennes et à certaines infections virales comme l'hémagglutinine 1 neuraminidase 1 (H1N1) et la maladie à virus Corona 2019 (COVID-19) [12,13,14]. Les maladies coronariennes [15, 16], le cancer [17, 18] et d'autres maladies de ce type ont des concentrations élevées de CRP. Pour cette raison, les diagnostics d'infections reposant sur la détection de la CRP ne sont pas précis. Normalement, le niveau de PCT dans le sang est inférieur à 0,5 ng/ml pour les adultes en bonne santé. PCT est un index spécifique pour la détection d'une infection bactérienne [19]. La concentration reste normale lorsque des infections virales surviennent. L'IL-6 est un biomarqueur hautement sensible et spécifique pour le diagnostic des infections. Le taux d'IL-6 dans le sérum humain normal est inférieur à 75 pg/ml [20], ce qui est extrêmement bas. Il est difficile de détecter l'IL-6 pour identifier les infections virales et bactériennes. Dans les sérums de patients atteints d'infections graves ou de septicémie, les niveaux d'IL-6 dépassent 1000 pg/ml. CRP, PCT et IL-6 ont des temps et des caractéristiques anormaux différents. Cela peut conduire à un diagnostic erroné des infections, ne serait-ce que pour détecter un seul biomarqueur. Les détections multiplexées de CRP, PCT et IL-6 peuvent couvrir toute la période d'infection. Il évalue efficacement la classification et la gravité des infections [21]. Il est impératif de développer une technique de détection multiplexée des biomarqueurs infectieux dans les domaines des tests militarisés au point de service (POCT) [22,23,24].

En tant que plate-forme émergente pour la détection médicale [25,26,27], les puces microfluidiques ont le potentiel de développer des dispositifs POCT militarisés [28, 29]. Mou et al. [30] ont réalisé une détection multiplexée de CRP, PCT et IL-6 en utilisant des microfibres électrofilées et des nanoparticules d'or pour amplifier les signaux. Mais les procédures de détection coûtent plus d'une heure. De plus, les opérations laborieuses et l'instabilité ont rendu difficile son application dans des environnements complexes comme les champs de bataille. Russel et al. [31] ont détecté l'IL-6 en 2,5 min avec un immunodosage par électrochimiluminescence (ECL). Cependant, il peut difficilement permettre un diagnostic classificatoire en raison de sa limitation à un seul biomarqueur et de sa faible sensibilité. Zupančič et al. [32] ont décrit une plate-forme de capteur électrochimique à faible coût pour détecter simultanément plusieurs biomarqueurs de septicémie dans le sang total. Ils ont incorporé un revêtement nanocomposite fait d'albumine sérique bovine réticulée pour prévenir l'encrassement biologique tout en maintenant l'électroconductivité. Il s'agit d'une plate-forme potentielle pour intégrer la détection des trois biomarqueurs dans un seul système de capteurs.

Ici, nous développons une plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique (WMC) en forme d'onde (WMC-MDP) pour le CRP, le PCT et l'IL-6 en conjonction avec un micromélangeur, la chimiluminescence (CL) et la streptavidine-biotine (SA-B ) système. WMC-MDP a une structure en sandwich. WMC se compose d'une couche de canal au-dessus, d'une couche de base en dessous et d'une couche de détection au milieu. Prémélange d'antigènes et d'anticorps de détection dans des micromélangeurs. Le prémélange simplifie les étapes d'incubation et de lavage et réduit le temps de détection grâce à l'optimisation et au prétraitement. Le système SA-B amplifie le signal de l'IL-6 pour surmonter le problème du grand écart de contenu entre les biomarqueurs. Nous lisons l'intensité CL du système d'analyse d'image CL et analysons les concentrations de biomarqueurs. En plus de cela, WMC-MDP est capable d'une analyse rapide, robuste, précise et multiplexée de CRP, PCT et IL-6 dans l'environnement dynamique du champ de bataille pour identifier de manière fiable les infections.

Des poudres d'anticorps de capture de CRP (CRP-Ab1), PCT (PCT-Ab1), IL-6 (IL-6-Ab1) ont été obtenues auprès d'Abcam (Royaume-Uni). Le CRP, le PCT et l'IL-6 ont été achetés chez Abcam (Royaume-Uni). Des poudres d'anticorps de détection de CRP (CRP-Ab2), PCT (PCT-Ab2) conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) ont été achetées chez Abcam (Royaume-Uni). Les anticorps de détection de l'IL-6 conjugué à la biotine (B-IL-6-Ab2) et de la HRP conjuguée à la SA (SA-HRP) ont été obtenus auprès de Thermo Fisher Scientific (USA). Les poudres de fraction V d'albumine sérique bovine (BSA) ont été acquises auprès de Tianjin Kangyuan Biotechnology Co., Ltd. (Tianjin, Chine). Les anticorps de détection utilisent une solution de BSA à 0,05 % pour diluer. Le prétraitement des canaux WMC nécessite une solution BSA à 5 %. Des comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et du Tween-20 ont été achetés auprès d'Amresco (États-Unis) pour préparer une solution de PBS à 0, 01 mol / l (pH 7, 4) et une solution de solution saline tamponnée au phosphate à 0, 5% Tween-20 (PBST). Les anticorps et antigènes de capture se diluent dans une solution PBS. Des kits de réactifs de substrat chimioluminescent supersensibles ont été obtenus auprès de Beijing Labgic Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine). Le polydiméthylsiloxane (PDMS) et l'agent de durcissement (Sylgard 184) ont été achetés auprès de Dow Corning Inc. (USA) pour préparer des puces microfluidiques. Le film de silicone (100,0 mm × 100,0 mm × 0,1 mm) utilisé pour recouvrir les anticorps de capture a été acheté auprès de Shanghai Shentong Rubber and Plastic Products Co., Ltd. (Shanghai, Chine). La résine Lasty-R de SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou, Chine) était le matériau pour l'impression 3D.

Les études impliquant des participants humains ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique du Yangzhou University Medical College (YXYLL-2020-89). Tous les sujets ont fourni des consentements éclairés écrits. Les tests d'échantillons cliniques comprenaient des échantillons provenant de 3 personnes en bonne santé et de 12 patients. Les échantillons de sérum ont été stockés à - 80 ° C avant la détection. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives.

La fabrication de moules utilise une imprimante 3D Lite 600HD produite par SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou, Chine) Four de séchage sous vide DZF-6020A, un séchage thermostatique électrique 202-00 T a été obtenu auprès de LICHEN-BX Co., Ltd. (Shanghai , Chine). SANHOPTT Co., Ltd. (Shenzhen, Chine) a fourni le nettoyeur de plasma PT-10. Le pousse-seringue intelligent ISPLab02 a été acquis auprès de DK INFUSETEK Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le système d'analyse d'image CL a été acheté auprès de BIO-OI Co., Ltd. (Guangzhou, Chine). La caractérisation des microcanaux utilise la microscopie métallographique IMM 3000 de MEGA Instruments Co., Ltd. (Suzhou, Chine). Le spectrophotomètre UV/VIS L5S d'INESA Analytical Instrument Co., Ltd. (Shanghai, Chine) devait tester la transmission.

La conception de la structure sandwich du WMC comprend deux parties. Doubles couches PDMS et une couche de détection. Il a également des fonctionnalités supplémentaires contenant une valve et deux supports. Nous avons utilisé le logiciel SolidWorks® 2016 pour concevoir le modèle tridimensionnel du WMC.

La couche de canal mesure 68 mm de long, 37 mm de large et 4 mm d'épaisseur sur le dessus de la structure sandwich. Il contient quatre réservoirs. Chaque réservoir peut contenir 85 μl de réactif. Pour introduire les réactifs et égaliser la pression, chaque réservoir est percé d'un évent de 1 mm. Les antigènes, les anticorps de détection et les enzymes sont mélangés à l'aide d'un micromélangeur en forme de vague. Le mélangeur se compose de cinq unités semi-elliptiques de 5,0 mm sur le grand axe et de 3,0 mm sur le petit axe. Chaque connexion d'unité a une liaison de bout en bout. Il y a un trou de valve entre le micromélangeur et le réservoir de 8,5 mm de diamètre pour les connecter. À la fin du micromélangeur en forme d'onde, nous avons conçu des canaux de détection de trois canaux linéaires disposés en parallèle avec un écart de 3,0 mm. Les canaux en demi-cercle relient les trois canaux linéaires avec un évent à pression négative de 1,0 mm. Nous avons inséré tous les évents dans des tubes flexibles pour l'injection de réactifs et la conduite de fluide. Ainsi, permettant à la fois une pression positive et négative pour la conduite de fluide. Tous les canaux ont une largeur et une profondeur de 400 μm avec un volume total de fluide de 20 μl. Un film de silicone de 10,0 mm de long, 8,0 mm de large et 0,1 mm d'épaisseur est la couche de détection recouverte de bandes d'anticorps de capture entre les doubles couches de PDMS. La couche de base inférieure du WMC a la même taille et le même trou de valve que la couche de canal mentionnée précédemment. Il y a un réservoir de déchets conçu sur la couche de base pour recevoir les réactifs de déchets.

La conception de la puce extérieure comporte deux plaques de support d'une épaisseur de 2,0 mm reliées par des broches pour soutenir la puce. Les deux plaques de support ont des trous pour s'adapter à la vanne mécanique de type translation (TM) afin d'éviter le phénomène de balancement de la vanne TM. La plaque de support supérieure se compose d'un autre trou pour exposer l'évent au réservoir. La vanne TM relie les réservoirs requis au micromélangeur en forme de vague en installant des canaux à différentes hauteurs. Pendant le mouvement de la vanne TM, le réservoir connecté ne dépend pas de l'alignement de la sortie avec le canal correspondant sur la vanne TM.

Pour la fabrication des moules des doubles couches de PDMS et des pièces auxiliaires, nous avons utilisé une imprimante 3D pour fabriquer [33, 34] (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1a). Les moules sont fabriqués à partir d'un matériau en résine résistant aux hautes températures pour éviter la déformation du moule qui se produit en raison de la température élevée pendant la période de durcissement du PDMS. Les pièces auxiliaires en matériau transparent permettent d'observer facilement le mouvement du fluide. Après avoir imprimé toutes les pièces, elles sont lavées dans un nettoyeur à ultrasons avec de l'éthanol à 99,7 % pendant 5 min et durcies dans une chambre de durcissement UV pendant 15 min. Nous rectifions le moule pour obtenir une rugosité de surface de Ra = 1,6 μm. Il est propice à une précision dimensionnelle et à une transmittance plus élevées. De l'huile brillante est pulvérisée sur la surface des moules de surface pour améliorer les formes du canal. Le PDMS et les agents de durcissement sont mélangés uniformément dans un rapport pondéral de 10:1. Un four de séchage sous vide est utilisé pour débuller le mélange. Il est ensuite coulé dans les moules. Le PDMS est durci dans l'étuve de séchage thermostatique électrique à 70 ° C pendant 90 min. Après démoulage du PDMS, la réalisation de la couche de canal et de la couche de base est terminée. Le nettoyeur à plasma rompt la liaison silicium-oxygène sur la surface et lie la couche de canal et la couche de base.

Nous avons pris en sandwich la couche de détection entre deux couches PDMS, en prenant les précautions nécessaires pour garantir que les doubles couches PDMS couvraient toute la région du canal de détection. Les bandes d'anticorps de capture sur la couche de détection doivent être perpendiculaires au canal de détection. Une liaison sécurisée est assurée en appliquant une pression adéquate sur les doubles couches de PDMS. Pour accueillir les couches de PDMS collées, deux plaques de maintien sont construites à l'aide de broches. Pour faciliter l'ajout d'échantillon et l'entraînement du fluide dans le WMC, une vanne TM est utilisée dans les trous de vanne. Des tubes flexibles de longueur appropriée sont utilisés dans tous les évents pour se connecter à la pompe. Enfin, l'assemblage du WMC-MDP est réalisé (Fichier complémentaire 1 : Fig. S1b).

Les trois canaux de notre conception de puce microfluidique sont capables de recouvrir la feuille de silicone avec des anticorps de capture. Les canaux ont une largeur et une profondeur de 400 μm, sont également parallèles et espacés de 3 mm. Le film silicone est découpé aux dimensions du dessin et placé sur sa longueur (Fichier complémentaire 1 : Fig. S2a). CRP-Ab1, PCT-Ab1, IL-6-Ab1 sont respectivement injectés dans les canaux, suivis d'une période de quiescence de 20 minutes (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2b). Après cela, le tampon PBST est injecté trois fois dans chaque canal pour éliminer les anticorps de capture non revêtus (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2c). Enfin, la puce est retirée et la couche de détection recouverte d'anticorps capturés (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2d).

Nous avons ensuite ajouté 50 ul de solution de BSA à 5% à n'importe quel réservoir en appuyant sur la valve TM à la hauteur appropriée sur le WMC-MDP terminé. La pression positive est utilisée pour forcer les réactifs à travers les évents du réservoir, tandis que la pression négative est utilisée pour les faire passer à travers l'évent à pression négative. Après avoir complètement rempli tous les canaux avec une solution de BSA, WMC-MDP est laissé inactif pendant 30 min pour minimiser l'adsorption de protéines non spécifiques. De plus, l'ajout de la solution BSA sert de mesure de contrôle de la qualité. Si du liquide se renverse pendant la procédure d'ajout, la qualité de la puce est compromise (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3).

Les étapes de base de WMC-MDP dans la détection de CRP, PCT et IL-6 comprennent le prétraitement, le prémélange et la lecture du signal. Le prétraitement consiste à recouvrir la couche de détection de bandes d'anticorps capturées et à modifier la surface des canaux. Le but du prémélange est de mélanger les antigènes avec des anticorps pour la détection avant de procéder à une réaction immunitaire. Le pré-mélange des antigènes et des anticorps dans un micromélangeur peut éliminer le besoin d'incubation et de lavage, économisant la moitié du temps de détection. La réaction de HRP avec le substrat de Luminol-H2O2 déconstruit H2O2 en un radical sans oxygène, qui est catalysé par HRP et oxyde le luminol pour produire des signaux CL. Les concentrations de CRP et de PCT sont élevées dans le sérum et peuvent être détectées directement par les anticorps conjugués à la HRP. Cependant, en raison de la faible concentration d'IL-6 dans le sérum, nous devons introduire un système d'amplification du signal. Nous avons utilisé le système SA-B pour détecter l'IL-6 en conjuguant la biotine avec des anticorps et la streptavidine avec HRP. Les préparations des deux conjugués sont des procédés matures et commerciaux. Un système automatique lit les signaux CL et analyse l'image CL.

Le micromélangeur est une structure fiable intégrée à une puce microfluidique [35,36,37]. L'efficacité du micromélangeur repose sur un mélange homogène des protéines dans les échantillons. C'est un pré-requis essentiel pour WMC-MDP de réduire le temps de détection par prémélange. Nous avons utilisé le logiciel COMSOL Multiphysics 5.6 pour simuler les conditions de mélange dans le modèle tridimensionnel du micromélangeur en forme d'onde et explorer l'effet du mélange des réactifs dans le micromélangeur en forme d'onde. Le jugement ne repose pas sur les changements de mouvement d'une protéine individuelle, il n'est donc pas nécessaire de prendre en compte les aspects biomécaniques. Entraîné par la pompe, le fluide dans le WMC-MDP se déplace à des nombres de Reynolds (Re) de 0,4 (Fig. 1a), 4 (Fig. 1b) et 40 (Fig. 1c). Pour étudier si deux types de liquide pouvaient se transformer en un liquide homogène, nous avons mélangé du liquide avec une concentration de 0 mol/l et 1 mol/l dans le micromélangeur en forme d'onde. Pour quantifier l'impact du mélange, nous évaluons l'efficacité du mélange à l'aide de la formule suivante.

Simulation de l'effet de mélange d'un micromélangeur en forme d'onde sous différents Re à l'aide du logiciel COMSOL. a Lorsque le Re était de 0,4, l'efficacité du mélange à la sortie était de 0,99606. b Encore une fois avec le Re de 4, l'efficacité du mélange à la sortie était de 0,99874. c Sous le Re de 40, l'efficacité de mélange à la sortie observée était de 0,99999. Numéro Reynolds

où \(c\) est la concentration du liquide, \(\overline{c}\) est la concentration moyenne, \(\Gamma\) est la concentration que nous avons mesurée à partir du plan de sortie, \(A\) est la surface du plan de sortie.

Lorsque le Re est de 0,4, 4, 40, l'efficacité de mélange résultante est de 0,99606, 0,99874 et 0,99999, respectivement. WMC-MDP est capable de prémélanges efficaces sur une large gamme de Re, et il peut satisfaire les exigences des opérations manuelles à l'automatisation instrumentale.

Une taille précise est la base pour assurer un fonctionnement normal du micromélangeur, un mouvement fluide du fluide et une sensibilité de détection. Le moule imprimé en 3D est une technologie émergente dans la fabrication de puces microfluidiques [38]. Pour vérifier la fiabilité de la fabrication du moule WMC lors de l'utilisation de la technologie d'impression 3D, nous avons utilisé la microscopie pour mesurer les dimensions des canaux dans le WMC. L'écart dimensionnel des canaux droits et courbes dans la couche de canaux (Fig. 2a – c), canal dans la valve TM (Fig. 2d) est inférieur à 2%. Cela prouve que le WMC fabriqué à l'aide de l'impression 3D a une précision de fabrication extrêmement élevée et peut répondre aux exigences de la production de masse.

Dimensions des canaux dans les composants WMC. une partie longitudinale de microcanaux WMC est étudiée avec la largeur conçue de 400 μm et caractérisée, et la largeur réelle est de 395,37 μm avec un écart dimensionnel de 1,16 %. b Le canal incurvé de WMC est également mesuré selon la conception de largeur de 400 μm. Mais la largeur réelle est de 405,41 μm et l'écart dimensionnel est de 1,35 %. c La profondeur du canal dans WMC a une hauteur conçue de 400 μm. Mais en réalité, la hauteur est de 407,25 μm avec un écart dimensionnel de 1,81 %. d Par rapport à la largeur de canaux conçue de 400 μm dans la valve TM, elle a 402,73 μm et 403,35 μm. Ici, l'écart dimensionnel moyen est de 0,61 %. Puce microfluidique en forme d'onde WMC, vanne mécanique de type translation de valve TM

En plus de la précision dimensionnelle, la transmittance est un autre critère pour évaluer la fabrication des puces. Pour observer le mouvement du fluide dans la puce et détecter l'intensité CL, nous avons examiné la transmittance de WMC dans la région visible (380–720 nm) (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4). Les résultats ont montré que la transmittance moyenne du WMC dans la région visible est de 85,97 %. Dans les conditions optimales de détection de l'intensité CL (425 nm) [39], la transmittance du WMC est de 86,04 %. Par rapport à la transmission de 95 % du PDMS, la transmission de la lumière du WMC ne diminue pas de manière significative et répond aux exigences d'observation et de détection.

Nous avons revêtu des anticorps avec différentes concentrations pour optimiser les concentrations d'anticorps pour capturer CRP, PCT et IL-6 sur la couche de détection. Nous avons étudié CRP-Ab1 et PCT-Ab1 de 10, 20, 40, 60, 80 μg/ml (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5a et b), IL-6-Ab1 de 20, 40, 60, 80, 120 μg /ml pour le revêtement (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5c). Les concentrations de CRP-Ab2, PCT-Ab2 et B-IL-6-Ab2 étaient toutes de 75 μg/ml. La concentration de SA-HRP était de 4 μg/ml. Les autres conditions expérimentales sont cohérentes. Initialement, l'intensité CL est positivement corrélée avec la concentration d'anticorps de capture. Lorsque les concentrations d'anticorps de capture augmentent dans une certaine mesure, l'augmentation de l'intensité CL devient discrète. L'intensité CL diminue même lorsque les concentrations d'anticorps de capture sont à des niveaux élevés. Les conditions optimales pour capturer CRP-Ab1, PCT-Ab1, IL-6-Ab1 sont 40, 60 et 80 μg/ml. Nous avons utilisé les concentrations optimales pour le revêtement.

Les anticorps de détection aux concentrations de 6,25, 12,5, 25, 50 et 75 μg/ml sont utilisés pour étudier les conditions optimales de détection de la CRP (fichier supplémentaire 1 : Fig. S6a), tandis que les anticorps de détection aux concentrations de 12,5, 25, 50, 75, 100 μg/ml sont utilisés pour détecter PCT et B-IL-6 (fichier supplémentaire 1 : Fig. S6b et c). L'intensité de CL est augmentée en augmentant la concentration d'anticorps de détection jusqu'à ce qu'elle atteigne un plateau. Par conséquent, nous avons choisi 25 μg/ml de CRP-Ab2, 50 μg/ml de PCT-Ab2 et B-IL-6-Ab2 comme concentration optimale.

Nous avons utilisé une pompe péristaltique à pression négative pour entraîner le fluide. Tout d'abord, nous connectons la pompe à l'évent à pression négative. Ensuite, 30 μl de l'échantillon, 40 μl de la solution mixte (anticorps de détection et SA-HRP), 70 μl de PBST et 35 μl du substrat sont ajoutés dans les quatre réservoirs, respectivement (Fig. 3a). Les étapes de détection contiennent : (1) Appuyer sur la valve TM à la hauteur appropriée pour s'assurer que l'échantillon et les anticorps de détection avec la solution SA-HRP peuvent entrer dans le micromélangeur en forme d'onde, (2) Pomper la solution mélangée dans le canal de réaction, (3 ) Positionnement de la valve TM en appuyant dessus à la hauteur suivante pour pomper les solutions PBST dans le canal de détection afin d'éliminer les réactifs n'ayant pas réagi (Fig. 3d), (4) Pompage du substrat CL dans le canal de détection pour réagir avec HRP après avoir appuyé sur la valve TM vers le dernière hauteur. Dans le micromélangeur, les réactifs peuvent être mélangés uniformément et initialement mis à réagir (Fig. 3b). Dans la deuxième étape, les solutions sont incubées pendant 20 min pour générer une immunoréaction, formant une structure sandwich à double anticorps. (Fig. 3c). Enfin, les bandes d'anticorps de capture et les canaux de détection se croisent pour former un 3 × 3 points de détection. Nous avons obtenu l'intensité CL par le système d'analyse d'image CL et utilisé le logiciel GEL-PRO Analyzer pour une analyse ultérieure (Fig. 3e). L'ensemble du processus prend 22 minutes.

Schéma de principe pour la détection multiplex de CRP, PCT et IL-6 à l'aide de WMC-MDP. a Avant la détection, le prétraitement comprend le revêtement des bandes d'anticorps de capture, la préparation de la surface des canaux et l'ajout de réactifs. b Prémélange d'échantillons avec des anticorps de détection dans un micromélangeur en forme d'onde. c L'immunodosage sandwich se produit dans les canaux détectés et forme les structures de Ab1-CRP-Ab2-HRP, Ab1-PCT-Ab2-HRP et Ab1-IL-6-Ab2-B-SA-HRP. d Éliminer les réactifs n'ayant pas réagi en lavant les canaux. e Ajout d'un substrat CL dans les canaux pour produire une intensité CL. Protéine c-réactive CRP, procalcitonine PCT, IL-6 interleukine-6, plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde WMC-MDP, tween-20 salin tamponné au phosphate PBST, chimiluminescence CL, albumine de sérum bovin BSA, anticorps de capture CRP-Ab1 de la protéine c-réactive, PCT-Ab1 anticorps de capture de la procalcitonine, IL-6-Ab1 anticorps de capture de l'interleukine-6, CRP-Ab2 anticorps de détection de la protéine c-réactive, PCT-Ab2 anticorps de détection de la procalcitonine, B-IL-6 -Anticorps de détection Ab2 de l'interleukine-6 ​​conjuguée à la biotine, la peroxydase de raifort HRP, la peroxydase de raifort SA-HRP conjuguée à la streptavidine

La plage linéaire, la limite de détection (LOD) et la sélectivité peuvent évaluer les performances de détection du WMC-MDP. Dans les conditions optimales, nous avons détecté la CRP dans la plage de 0, 16 à 80 μg / ml, le PCT dans la plage de 0, 1 à 51, 2 ng / ml et l'IL-6 dans la plage de 12, 5 à 6400 pg / ml (Fig. 4a, b). Les plages linéaires sont de 1,25 à 40 μg/ml pour la CRP (\(Y = - 105726,34 + 18258,99X\); \(R^{2} = 0,99\)), 0,4 à 12,8 ng/mL pour la PCT (\(Y = - 57834,93 + 24184,26X\ ); \(R^{2} = 0,99\)). 50–1600 pg/ml pour IL-6 (\(Y = - 30857.38 + 19426.37X\); \(R^{2} = 0.97\)) (Fig. 4c). Les plages linéaires couvrent les valeurs seuils des trois biomarqueurs. \(LOD = 3S/M\), tandis que S est l'écart type des échantillons blancs et M est la pente de la courbe linéaire. Les LOD de CRP, PCT et IL-6 sont respectivement de 0,54 μg/ml, 0,11 ng/ml et 16,25 pg/ml. Étant donné que les LOD sont bien inférieures aux valeurs seuils, la sensibilité des trois biomarqueurs peut répondre aux besoins de POCT.

L'intensité CL est obtenue à partir de la détection multiplex de CRP, PCT et IL-6 à l'aide de WMC-MDP pour construire la plage de détection, la plage linéaire et la sélectivité. a Images CL de CRP, PCT et IL-6 dans la plage linéaire à diverses concentrations. L'analyse montre CRP dans le coin supérieur gauche, PCT au milieu et IL-6 dans le coin inférieur. b Plage de détection de CRP, PCT et IL-6. c Gamme de revêtements de CRP, PCT et IL-6. d Images CL de CRP, PCT et IL-6 dans différentes combinaisons. Chimiluminescence CL, protéine C-réactive CRP, procalcitonine PCT, interleukine-6 ​​IL-6, plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde WMC-MDP

Aucune réaction croisée n'est la prémisse pour réaliser une détection multiplexée des trois biomarqueurs. Nous avons détecté toutes les combinaisons de CRP, PCT et IL-6 pour observer si elles feraient une différence (Fig. 4d). Le processus de détection est cohérent à l'exception des différentes combinaisons d'échantillons dans le réservoir. Les concentrations de CRP, PCT et IL-6 sont de 10 µg/ml, 0,8 ng/ml et 100 pg/ml. Les résultats montrent que les signaux CL ne peuvent apparaître que lorsque les anticorps capturés correspondants sont coatés. Différentes combinaisons de biomarqueurs n'affectent pas l'intensité CL des points de détection. Cela indique que des réactions croisées n'ont pas été générées et que le WMC-MDP est capable de détection multiplexée de biomarqueurs infectieux.

La reproductibilité est également un indice important pour évaluer la capacité de détection du WMC-MDP. Nous avons utilisé dix morceaux de WMC produits à partir du même lot pour détecter le même échantillon. Les concentrations de CRP, PCT et IL-6 dans les échantillons sont de 10 μg/ml, 0,8 ng/ml et 100 pg/ml. Les résultats montrent que les coefficients de variation (CV) pour la CRP, la PCT et l'IL-6 sont de 5,24 % (fichier supplémentaire 1 : Fig S7a), 5,02 % et 6,12 %, respectivement (fichier supplémentaire 1 : Fig S7b et c). Tous les CV sont inférieurs à 10%, ce qui indique que la reproductibilité de WMC-MDP est compatible pour l'application POCT. La fabrication précise du WMC et l'optimisation des conditions expérimentales assurent une reproductibilité optimale.

Pour satisfaire les exigences de POCT et de commercialisation, WMC-MDP doit avoir une excellente stabilité de stockage. Nous avons étudié la capacité de détection du WMC-MDP après stockage pendant 1 à 7 jours à une température de 4 °C et une pression de 101 kPa. Les concentrations de CRP, PCT et IL-6 à détecter sont respectivement de 10 µg/ml, 0,8 ng/ml et 100 pg/ml. Les signaux n'affichent aucune diminution distincte du WMC-MDP pour détecter les mêmes concentrations d'échantillons. Les CV de CRP, PCT et IL-6 sont respectivement de 6,33 %, 5,77 % et 6,64 %, inférieurs à 15 % (Fichier supplémentaire 1 : Fig S8). Cela indique que le WMC-MDP peut stocker les réactifs de manière stable.

Nous avons détecté 15 échantillons de sérum pour vérifier la capacité de WMC-MDP dans le diagnostic clinique et comparé les résultats avec des kits ELISA commerciaux. La justification met en évidence le potentiel du WMC-MDP dans les applications pratiques. Les résultats de WMC-MDP sont très cohérents avec les kits ELISA commercialisés (CRP, \(R^{2} = 0,93\) ; PCT, \(R^{2} = 0,94\) ; IL-6, \(R^ {2} = 0,98\)) (Fig. 5a–f). Les résultats des échantillons de 3 volontaires sains et de 12 volontaires malades sont tous cohérents avec les résultats du diagnostic clinique.

Comparaison et analyse des données de détection de CRP, PCT et IL-6 dans des échantillons cliniques entre WMC-MDP et les kits ELISA commerciaux. a et b Comparaison des kits WMC-MDP et ELISA pour la détection de CRP. c et d Comparaison des kits WMC et ELISA pour la détection PCT. e et f Comparaison des kits WMC-MDP et ELISA pour la détection de l'IL-6. g Analyse de CRP, PCT, IL-6 dans des échantillons cliniques détectés par WMC-MDP, sans transformation logarithmique à 0. h Diagramme en boîte à moustaches de CRP, PCT et IL-6 chez 12 patients infectés. Protéine C-réactive CRP, procalcitonine PCT, IL-6 interleukine-6, puce microfluidique en forme d'onde WMC, plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde WMC-MDP, puce microfluidique en forme d'onde WMC-CL utilisant la chimiluminescence, sans transformation logarithmique à 0

Les valeurs seuil raisonnables prédéfinies et uniformes facilitent l'analyse des échantillons cliniques. Nous avons utilisé des valeurs seuils de 8 μg/ml, 0,5 ng/ml et 75 pg/ml pour la CRP, la PCT et l'IL-6, respectivement. Pour visualiser les changements de biomarqueurs, nous avons utilisé leur multiplication par rapport à la valeur seuil pour montrer le contenu des biomarqueurs (Fig. 5g). Du point de vue des patients n°9 et n°15, seul le taux d'IL-6 dans le sang des patients est supérieur à la valeur seuil. Cela peut être dû au stade précoce de l'infection. Les niveaux de CRP dans le sang commencent à augmenter après 6 à 8 h d'infection et atteignent un pic après 24 à 48 h. Les niveaux de PCT augmentent en 2 à 4 h et atteignent un plateau en 12 à 48 h, tandis que les niveaux d'IL-6 augmentent rapidement, mais avec une demi-vie de seulement 1 h. Cela indique que les échantillons doivent être prélevés peu de temps après l'infection du patient pour la détection de l'IL-6. Les bactéries, virus et autres agents pathogènes peuvent provoquer des infections. La PCT n'est sensible qu'à l'infection bactérienne, tandis que la CRP n'est pas sensible à ce pathogène. Les taux d'IL-6 sont élevés chez le patient n° 3, tandis que les taux de CRP sont légèrement élevés et les taux de PCT sont normaux. Elle peut être causée par d'autres agents pathogènes plutôt que par une bactérie. L'utilisation de médicaments peut également entraîner une baisse rapide de la PCT, qui nécessite un diagnostic plus approfondi en fonction des antécédents médicaux du patient. Le patient n° 8 a suscité notre intérêt pour les taux élevés de CRP et de PCT dans le sang et les taux normaux d'IL-6. Cela peut être dû au fait que l'infection du patient n'était pas grave et que les niveaux d'IL-6 ont diminué en raison de sa courte demi-vie, contrairement à la PCT et à la CRP. Le graphique en boîte à moustaches montre que les patients infectés peuvent également avoir une augmentation des niveaux de biomarqueurs inférieure à un (Fig. 5h). Cela signifie que même si une personne est infectée, les concentrations de certains biomarqueurs peuvent se situer dans la plage normale. Selon l'analyse de cas ci-dessus, il est difficile de diagnostiquer avec précision une infection avec un biomarqueur individuel. Les détections multiplexées de CRP, PCT et IL-6 peuvent remplir la zone aveugle de l'analyse d'un seul biomarqueur et diagnostiquer avec précision l'infection.

La performance globale de WMC-MDP est satisfaisante par rapport aux technologies matures existantes. Cela est dû à la conception avancée et à la fabrication précise des modules, y compris les canaux de traitement, les micromélangeurs, les matériaux de la couche de réaction et le stockage des réactifs.

La combinaison de l'impression 3D avec les technologies microfluidiques ouvre une nouvelle voie pour la production de masse de puces. La largeur des canaux dans le WMC-MDP est de 400 μm, montrant une meilleure précision de fabrication que le moulage par injection. Cependant, l'erreur de fabrication augmente significativement lorsque la largeur de canal est inférieure à 50 µm. De plus, le PDMS est difficile à durcir dans les moules produits à l'aide de la technologie d'impression 3D photodurcissante. L'isolement physique ou la modification de la surface peut résoudre le problème, mais cela complique le processus de fabrication. De nouveaux matériaux et des améliorations technologiques peuvent fournir des alternatives prometteuses pour la fabrication de puces microfluidiques basées sur l'impression 3D. Les micromélangeurs ont été largement utilisés dans les puces microfluidiques. Des micromélangeurs basés sur la topologie sont en cours de développement pour mélanger des fluides dans des canaux plus courts. Cependant, la structure complexe rend sa fabrication difficile. De plus, il peut difficilement répondre aux exigences de mélange de fluides à une large gamme de Re. La conception raisonnable de WMC-MDP fait que le micromélangeur en forme d'onde occupe un espace minimal. Il permet au WMC-MDP d'être portable tout en s'adaptant aux environnements complexes du champ de bataille.

Bien que nous raccourcissions le temps d'incubation, la sensibilité n'est pas affectée, en raison de la bonne capacité d'adsorption de la couche de réaction. Au lieu du film d'aluminium couramment utilisé, nous avons choisi un film de silicium comme matériau de couche de réaction. Par rapport au film d'aluminium, la capacité d'adsorption du film de silicium sur les protéines est grandement améliorée. Avec une forte adsorption et une bonne plasticité, le film de silicium est capable d'amplifier les signaux de détection. Pour les puces microfluidiques, le stockage des réactifs a été l'un des problèmes les plus difficiles. Même si le WMC-MDP peut maintenir le réactif à 4 °C pendant plus de 7 jours, il reste encore beaucoup à faire pour que la méthode soit utilisable sur le marché. Il peut être atténué en utilisant de nouvelles techniques de lyophilisation ou en améliorant la structure des réservoirs. .

Nous avons comparé la capacité de détection multiplexée, ainsi que le fonctionnement, le temps, le coût et la limite de détection basée sur WMC-MDP avec les méthodes de détection conventionnelles (tableau 1). Comparé aux kits ELISA, au dosage immunologique par fluorescence et au dosage immunologique ECL, le WMC-MDP présente de meilleures performances en termes de fonctionnement, de temps et de coût. Bien que la LOD de l'IL-6 soit supérieure à celle de l'immunoessai par fluorescence et de l'immunoessai ECL, elle répond toujours aux exigences du diagnostic des maladies infectieuses. De plus, WMC-MDP peut réaliser la détection multiplex de trois biomarqueurs. Il a une signification pratique dans l'application clinique. Les performances du WMC-MDP dans l'analyse d'échantillons cliniques ont également validé sa valeur d'application dans le diagnostic rapide et la classification des infections. La rapidité, le faible coût, l'intervention manuelle minimale et la capacité de détection multiplexée font du WMC-MDP un candidat solide pour le POCT à vocation militaire.

En conclusion, pour étudier l'infection dans un scénario militaire, nous développons un WMC-MDP pour les détections multiplexées de CRP, PCT et IL-6. Le prémélange d'antigènes et d'anticorps pour la détection simplifie les étapes de la réaction et raccourcit le temps de détection. Un processus de fabrication fiable et l'optimisation des conditions de réaction améliorent la sensibilité et la spécificité, tout en réduisant le coût. Le prétraitement simplifie le processus des opérations. Les avantages de rapidité, de rentabilité et de convivialité font de WMC-MDP une alternative compétitive aux méthodes traditionnelles. WMC-MDP fournit une méthode réalisable pour la détection d'autres agents pathogènes. WMC-MDP est un outil prospectif pour l'identification rapide des infections et montre le potentiel d'être développé pour les dispositifs POCT militarisés.

Les données et les matériaux utilisés dans l'étude actuelle sont tous disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Anticorps de détection de l'IL-6 conjugué à la biotine

Albumine de sérum bovin

Chimiluminescence

Maladie du coronavirus 2019

Protéine C-réactive

Capturer les anticorps de la CRP

Anticorps de détection de CRP

Coefficients de variation

Électro-chimiluminescence

Hémagglutinine 1 Neuraminidase 1

Peroxydase de raifort

Interleukine-6

Capturer les anticorps de l'IL-6

Limite de détection

Solution saline tamponnée au phosphate

Tween-20 de solution saline tamponnée au phosphate

Procalcitonine

Capturer les anticorps de PCT

Anticorps de détection de PCT

Polydiméthylsiloxane

Point de service

Dépistage au point de service

Le numéro de Reynold

Streptavidine–biotine

HRP conjugué à SA

Vanne mécanique de type translation

Puce microfluidique en forme de vague

Plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde

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Les auteurs remercient SHINING 3D Technology Co., Ltd. (Yangzhou et Hangzhou, Chine) pour leur soutien technique sur l'impression 3D.

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81902167, 52075138) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20190872).

École de génie mécanique, Université de Yangzhou, Yangzhou, 225127, Jiangsu, Chine

Bin-Feng Yin, Xin-Hua Wan, Chang-Cheng Qian et ASM Muhtasim Fuad Sohan

Département de biochimie, Institut des sciences médicales fondamentales, Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) et Peking Union Medical College, Pékin, 100005, Chine

Ming-Zhu Yang

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BFY a conçu l'étude, réalisé les expériences et fourni le financement. XHW a exécuté des simulations, analysé les données expérimentales et rédigé le manuscrit. MZY a relu la méthode et fourni le financement. CCQ a édité des graphiques et relu des données expérimentales. ASMMFS a révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Bin-Feng Yin.

Les études impliquant des participants humains ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique du Yangzhou University Medical College (YXYLL-2020-89). Tous les sujets ont fourni des consentements éclairés écrits.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas d'intérêts concurrents.

Une véritable plate-forme de détection multiplexée assistée par puce microfluidique en forme d'onde (WMC) (WMC-MDP). Figure S2. Processus de revêtement des bandes d'anticorps de capture sur la couche de détection. Figure S3. L'encre rouge coule dans le canal. Aucune fuite de liquide n'indique que la puce est qualifiée. Figure S4. La transmission de WMC est dans la gamme de 380-720 nm. Figure S5. Optimisation des anticorps de capture dans WMC-MDP. Figure S6. Optimisation des anticorps de détection dans WMC-MDP. Figure S7. Reproductibilité de CRP, PCT et IL-6. Figure S8. Stabilité de stockage de CRP, PCT et IL-6.

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Réimpressions et autorisations

Yin, BF., Wan, XH., Yang, MZ. et coll. Test au point de service assisté par puce microfluidique en forme d'onde pour un diagnostic précis et rapide des infections. Military Med Res 9, 8 (2022). https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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Reçu : 19 août 2021

Accepté : 26 janvier 2022

Publié: 11 février 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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