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May 28, 2023

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 708 (2023) Citer cet article

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Les plateformes d'administration à très longue durée d'action pour la prophylaxie pré-exposition (PrEP) au VIH peuvent accroître l'observance et maximiser les avantages pour la santé publique. Nous rapportons un implant de formation in situ (ISFI) injectable, biodégradable et amovible qui est administré par voie sous-cutanée et peut libérer l'inhibiteur de l'intégrase cabotégravir (CAB) au-dessus des repères protecteurs pendant plus de 6 mois. Les ISFI CAB sont bien tolérés chez les souris femelles et les macaques femelles ne présentant aucun signe de toxicité ou d'inflammation chronique. Chez les macaques, les concentrations plasmatiques médianes de CAB dépassent les valeurs de référence de protection PrEP établies dans les 3 semaines et confèrent une protection complète contre les provocations rectales répétées par le SHIV. Le retrait de l'implant via une petite incision chez 2 macaques à la semaine 12 entraîne une diminution de 7 à 48 fois des taux plasmatiques de CAB en 72 heures. La modélisation pour traduire le dosage CAB ISFI suggère qu'une injection de 3 ml dépasserait les normes de protection chez l'homme pendant plus de 5 mois après l'administration. Nos résultats soutiennent l'avancement clinique des ISFI CAB pour la PrEP à action ultra-longue chez l'homme.

En 2021, 38,4 millions de personnes vivaient actuellement avec le VIH et 40,1 millions de personnes sont décédées de maladies liées au sida dans le monde depuis le début de l'épidémie1. La prophylaxie pré-exposition (PrEP) avec des régimes oraux quotidiens contenant de l'emtricitabine (FTC) en association avec du fumarate de ténofovir disoproxil (TDF) ou du ténofovir alafénamide a été très efficace pour prévenir l'acquisition du VIH lorsqu'elle est prise avec une observance élevée2,3. Bien qu'une adhésion élevée se traduise par une efficacité élevée de la PrEP, le maintien d'une adhésion élevée à la PrEP orale quotidienne reste un défi majeur4–6. De faibles niveaux d'observance et une infection ultérieure peuvent également conduire au développement de virus résistants aux médicaments7. En outre, les faibles niveaux d'adhésion sont particulièrement observés chez les jeunes femmes d'Afrique subsaharienne en raison d'une forte stigmatisation, d'une faible acceptabilité du produit et/ou de l'incapacité de divulguer l'utilisation du produit à leurs partenaires sexuels5. L'atténuation des problèmes d'observance en Afrique subsaharienne, en particulier chez les femmes, est la clé du succès de la PrEP puisque l'Afrique subsaharienne représente plus de 60 % de toutes les nouvelles infections à VIH dans le monde1,5. À cette fin, le pipeline d'options de prévention du VIH s'oriente vers le développement de produits de PrEP à longue durée d'action (LA) qui ne nécessitent pas de doses fréquentes et peuvent surmonter certains des défis d'observance associés à la PrEP orale quotidienne. En fait, des études ont montré que les produits à action prolongée ont une meilleure observance et acceptabilité des régimes oraux quotidiens5,8,9,10,11, en particulier dans les populations où la prévalence du VIH est la plus élevée. Ainsi, une adhésion et une acceptabilité accrues de la PrEP de la PrEP à action prolongée contre le VIH peuvent finalement réduire les taux de transmission du VIH.

Une formulation injectable à action prolongée de l'inhibiteur de l'intégrase cabotegravir (CAB LA) a été approuvée fin 2021 par la FDA pour la PrEP chez les hommes et les femmes12. L'approbation de CAB LA fait suite aux résultats des essais HPTN 083 et 084 montrant que CAB LA était sûr et plus efficace que le FTC/TDF oral quotidien, reflétant probablement l'avantage d'adhérence de la PrEP à longue durée d'action13,14,15. Les études ont également défini les concentrations plasmatiques de CAB nécessaires pour la protection comme étant quatre fois supérieures à la concentration inhibitrice à 90 % ajustée aux protéines (4 × PA-IC90, 664 ng/mL16). CAB LA est administré en injections intramusculaires de 3 ml chaque mois pendant 2 mois initialement et tous les deux mois par la suite. Bien que CAB LA présente une avancée majeure dans la PrEP et le traitement du VIH, les volumes d'injection importants (3 ml/injection), les réactions au site d'injection14,17 et l'incapacité à s'auto-administrer ou à retirer pour mettre fin au traitement si nécessaire sont des défis encore à relever. adressée. De plus, en raison de sa longue demi-vie terminale (> 40 jours)16 et de son incapacité à être retiré après l'administration, le CAB LA présente une longue queue pharmacologique avec des niveaux faibles mais détectables de CAB restant dans le plasma pendant plus de 15 mois après l'arrêt du traitement18 ,19. Ces niveaux sous-optimaux de CAB peuvent entraîner des infections percées et le développement d'un VIH résistant aux médicaments, nécessitant ainsi une PrEP orale supplémentaire pour couvrir la queue afin de prévenir de futures infections19. Pour surmonter ces limitations, les efforts se tournent maintenant vers le développement de formulations de CAB amovibles et auto-administrées (p. De telles formulations peuvent faciliter une mise en œuvre à grande échelle et maximiser le rapport coût-efficacité et les avantages pour la santé publique dans les pays riches et pauvres en ressources.

Les implants de formation in situ (ISFI) peuvent fournir des propriétés souhaitables pour une formulation de CAB à action ultra-longue, notamment de longs intervalles de dosage, de petits volumes d'injection et une récupérabilité20,21. Les ISFI sont constitués d'un polymère hydrophobe et biodégradable (par exemple, l'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA)), de solvants organiques biocompatibles miscibles à l'eau (par exemple, la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) ), et des ingrédients pharmaceutiques actifs (IPA)22,23,24 qui sont co-formulés pour générer une solution ou une suspension liquide homogène et seringue. Lors de l'injection dans l'espace intramusculaire ou sous-cutané, le solvant organique miscible à l'eau diffuse dans l'environnement aqueux, entraînant une inversion de phase générant un dépôt solide ou semi-solide comprenant l'API piégé dans la matrice polymère précipitée23,24,25,26. Les API sont libérés du dépôt par diffusion à travers la matrice polymère et par dégradation en masse du polymère au fil du temps.

Les ISFI formulés avec PLGA et NMP ont été largement étudiés pour la libération à action prolongée du dolutégravir (DTG), un analogue inhibiteur de l'intégrase du VIH de CAB20,21. Chez les souris NOD scid common gamma chain knockout et les souris moelle osseuse-foie-thymus (BLT), les ISFI ont libéré du DTG pendant plus de 11 mois à des niveaux 10 à 100 fois supérieurs au PA-IC90. Ces niveaux étaient associés à une protection élevée contre de multiples provocations vaginales au VIH à forte dose et à la suppression de la virémie chez les souris infectées20,21. De plus, bien que le retrait de l'implant ne soit pas nécessaire en raison de la nature biodégradable du PLGA, l'étude a montré la possibilité de récupérer facilement le dépôt via une petite incision cutanée. Après élimination, les niveaux de DTG dans le plasma sont tombés en dessous de la PA-IC90 dans les 24 heures et en dessous de la limite de détection après 7 jours20. Collectivement, ces observations ont mis en évidence le potentiel des ISFI en tant que nouveau système d'administration à action ultra-longue et ont soutenu l'évaluation approfondie des ISFI fournissant des CAB.

Ici, nous avons développé et caractérisé une formulation CAB ISFI avec une charge médicamenteuse élevée et qui se prête à une administration sous-cutanée en petits volumes. Nous avons défini la stabilité, la microstructure, l'injectabilité et la cinétique de libération in vitro et in vivo. Nous montrons que cette formulation est sûre chez les souris femelles et les primates non humains et peut libérer du CAB pendant 6 à 11 mois à des niveaux supérieurs aux valeurs de référence établies pour la protection de la PrEP chez les macaques et les humains. Nous associons la libération prolongée de CAB de l'ISFI à une protection durable contre l'infection par le SHIV dans un modèle macaque de PrEP qui prédisait l'efficacité clinique de CAB LA et d'autres schémas thérapeutiques de PrEP par voie orale approuvés. Notre étude identifie une plate-forme prometteuse pour la libération prolongée de CAB à des niveaux connus pour être associés à la protection de la PrEP chez l'homme.

De nombreux facteurs influencent la cinétique de libération du médicament à partir des ISFI, notamment le type de polymère et le poids moléculaire (MW), le solvant, le rapport polymère/solvant, la miscibilité du médicament et du polymère avec le solvant et les propriétés physicochimiques du médicament20,24,27. Ici, nous avons étudié l'effet des solvants, de la charge de médicament, du poids moléculaire du polymère et des rapports polymère-solvant pour développer un ISFI avec une charge CAB maximale et des taux de libération in vitro élevés. Tout d'abord, nous avons étudié la solubilité de la saturation CAB dans divers solvants afin de déterminer le système de solvant idéal pour la formulation afin d'atteindre une charge maximale de médicament (tableau supplémentaire 1). La NMP et le DMSO sont des solvants organiques miscibles à l'eau couramment utilisés dans les formulations ISFI24, ces solvants ont donc été testés dans divers rapports pondéraux. L'ajout d'excipients tels que le Tween 20, le Pluronics et le Gelucire a également été étudié car ils peuvent améliorer la solubilité aqueuse des médicaments peu insolubles28. Sur la base de la solubilité du CAB dans ces différents solvants, un rapport pondéral de 1:1 (p/p) de NMP:DMSO (appelé « solvant ») a démontré la solubilité la plus élevée du CAB (solubilité à saturation de 167,12 ± 12,04 mg/mL) et a été donc utilisé pour formuler le CAB sous la forme d'une suspension ISFI stable au-dessus de cette solubilité à saturation.

Au cours de l'optimisation et en s'appuyant sur nos travaux antérieurs, toutes les formulations CAB ISFI ont été générées à l'aide d'un polymère biodégradable approuvé par la FDA composé de 50:50 PLGA, qui permet une libération ultra-longue d'antirétroviraux à partir des ISFI20,21,29 et a un profil de dégradation favorable comprenant entraînant une dégradation complète en quelques mois30,31. Ce profil de dégradation est idéal pour assurer une dégradation complète du polymère avant les injections ISFI ultérieures afin d'éviter l'accumulation de polymère. De plus, toutes les formulations étaient constituées de PLGA 50:50 avec de faibles poids moléculaires de 10 kDa ou 27 kDa, car les PLGA avec des poids moléculaires inférieurs peuvent accueillir une charge de médicament plus élevée, provoquer une plus grande libération de médicament et avoir une viscosité plus faible pour assurer la seringueabilité31 par rapport au PLGA avec des poids moléculaires plus élevés lorsque utilisé dans les systèmes ISFI24,32,33.

Des études de libération in vitro cumulatives de sept formulations CAB ISFI ont été évaluées pendant 35 jours (Fig. 1a) pour étudier l'effet de la charge de médicament, du PLGA MW et des rapports polymère/solvant afin de déterminer la formulation optimale avec la charge et la libération de médicament les plus élevées. taux (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaire). Les résultats ont montré que les taux de libération de CAB augmentaient avec (1) l'augmentation de la charge de médicament (Fig. 1b), (2) l'augmentation de la quantité de solvant et (3) la diminution du poids moléculaire du PLGA (Fig. 1c). Toutes les formulations présentaient une très faible libération en rafale (<3% de libération en 24 heures), une libération prolongée pendant plus d'un mois et une libération prévue pendant plus de 6 mois in vitro (Fig. 1d). ISFI contenant 349 mg/mL de CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):solvant) (Formulation 4), 500 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):solvant) (Formulation 5 ) et 500 mg/mL de CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):solvant) (Formulation 7) ont présenté une cinétique de libération d'ordre zéro pendant les 35 premiers jours. De plus, la libération de CAB était significativement différente (p <0, 05) en faisant varier la charge de médicament (Fig. 1b) et le PLGA MW (Fig. 1c). Notamment, les ISFI contenant 500 mg/mL de CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):solvant) (Formulation 7) et 500 mg/mL (1:4 w/w PLGA (27 kDa):solvant) (Formulation 5) présentaient une cinétique de libération comparable (p > 0,05), malgré les différences de PLGA MW.

a Libération cumulative des formulations CAB ISFI. b Effet de la charge médicamenteuse sur la libération cumulative de CAB. c Effet du poids moléculaire du PLGA sur la libération cumulative de CAB. Toutes les études de libération in vitro ont été réalisées dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4 avec 2 % de Solutol) à 37 °C. Données présentées sous forme de moyenne ± écart type pour n = 3 échantillons. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Analyse statistique : ANOVA à deux voies avec le test de comparaison multiple de Tukey comparant la quantité de libération de médicament par rapport à la formulation et au point temporel en b et c. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 et ns (non significatif) lorsque p > 0,05. d Tableau récapitulatif des cinétiques de libération des formulations CAB ISFI. Solvant = 1:1 (p/p) NMP:DMSO.

Des taux de libération similaires entre les formulations 5 et 7 sont probablement attribués à la charge de médicament considérablement élevée dans les formulations (500 mg/mL de CAB), qui détermine le profil de libération de CAB, quelles que soient les différences de PLGA MW. Dans les deux formulations, le rapport PLGA sur CAB (p/p) est de 1:3,5 p/p (41,2 % CAB et 11,8 % PLGA). Ainsi, la différence de PLGA MW dans les formulations 5 et 7 n'a pas produit un impact aussi important sur la libération de CAB par rapport à d'autres formulations avec différents PLGA MW, telles que les formulations 3 et 6 (rapport PLGA sur CAB de 1: 0, 75 w / w ).

Sur la base de profils de libération de médicament similaires et prometteurs à partir des formulations 5 et 7, la libération in vitro de ces formulations a été prolongée à 180 jours (Fig. 2a supplémentaire). Bien que nous ayons observé une libération in vitro plus élevée de CAB à partir de la formulation 5 après environ 2 mois par rapport à la formulation 7, une étude pilote sur des souris n'a montré aucune différence dans les concentrations de CAB dans le plasma entre les deux formulations jusqu'à 90 jours (Fig. 2b supplémentaire). La formulation 7 a été sélectionnée pour des études ultérieures en raison de son PLGA MW inférieur (10 kDa). Le PLGA MW inférieur a induit une viscosité plus faible (tableau supplémentaire 2) assurant la seringueabilité. De plus, le PLGA 10 kDa (formulation 7) devrait se dégrader plus rapidement que le PLGA 27 kDa (formulation 5) et a été sélectionné pour assurer une dégradation complète du polymère et atténuer l'accumulation de polymère lors des doses suivantes24,32,33.

En fin de compte, le CAB 500 mg/mL (PLGA 1:4 w/w (10 kDa) : solvant) ISFI (Formulation 7) (appelé CAB ISFI) a été sélectionné comme formulation optimisée en raison de sa charge élevée en médicament et de sa teneur élevée en taux de libération in vitro et a été caractérisée en termes de microstructure de dépôt. Il est connu que la cinétique de libération du médicament est influencée par la microstructure du dépôt, qui est en outre influencée par le polymère, le solvant, les propriétés physicochimiques du médicament et la miscibilité du médicament avec le solvant20,24. Comme le montre la Fig. 3 supplémentaire, la microstructure CAB ISFI a été analysée qualitativement par microscopie électronique à balayage (SEM) et a formé un dépôt dense avec des cristaux CAB, et la microstructure est restée inchangée sans formation de pores apparents dans la microstructure ISFI pendant 90 jours d'incubation dans média de libération in vitro. De plus, nous avons effectué une analyse par rayons X à dispersion d'énergie par microscopie électronique à balayage (SEM EDX) sur CAB ISFI et placebo ISFI (sans CAB) pour confirmer les cristaux de CAB observés dans les images SEM (Figure 4 supplémentaire). Les résultats SEM EDX ont démontré l'absence de cristaux dans le placebo ISFI et les cristaux confirmés étaient composés de CAB dans le CAB ISFI à partir de l'analyse élémentaire (présence de groupes fluorés, Fig. 4 supplémentaire). Au final, ces résultats corroborent la cinétique de libération in vitro et in vivo du CAB sur 90 jours.

Pour déterminer la durée de conservation du CAB ISFI optimisé, nous avons effectué des études de stabilité dans deux conditions de stockage (40 °C/75 % d'humidité relative (HR) et 4 °C) pendant 30 et 90 jours, suivies d'une analyse de la libération après stockage. in vitro. La stabilité a été déterminée sur la base de l'apparence physique (couleur, viscosité, séparation de phase) de la formulation ISFI et de la stabilité et de la concentration du médicament après stockage.

Après 30 jours à 4 °C ou 40 °C/75 % HR et 90 jours à 4 °C, la formulation CAB ISFI n'a montré aucune différence visuelle dans l'aspect physique (couleur, aptitude à la seringue, séparation de phase). La concentration du médicament était comparable à la concentration initiale (t = 0) (différence <5%) sans pics de dégradation du médicament observés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Fig. 5a supplémentaire). La formulation n'était plus injectable ni homogène après 90 jours à 40 ° C / 75% HR (Fig. 5b supplémentaire), ce qui empêchait l'analyse de la cinétique de libération après stockage.

Les figures 2a et b montrent la cinétique de libération in vitro après stockage obtenue après 30 jours à 4 °C ou 40 °C/75 % HR et après 90 jours à 4 °C. Indépendamment des conditions de stockage, la libération de CAB après stockage était plus lente et significativement différente (p < 0,05) par rapport à la formulation initiale (t = 0). Plus précisément, la libération in vitro de CAB lorsqu'elle est conservée à 40 °C/75 % HR et 4 °C est devenue significativement différente par rapport à la ligne de base après 7 jours (p = 0,0042) et 21 jours (p = 0,0004), respectivement. En fin de compte, toutes les formulations étaient significativement différentes (p <0, 0001) par rapport à la ligne de base après 90 jours de libération in vitro (Fig. 2a).

a Cinétique de libération cumulée in vitro de CAB ISFI (500 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):solvant)) au départ (t = 0), 30 jours et 90 jours après stockage à 4 °C et 40 °C/75 % HR. Toutes les études de libération in vitro ont été réalisées dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4 avec 2 % de Solutol) à 37 °C. Données présentées sous forme de moyenne ± écart type pour n = 3 échantillons. Analyse statistique : ANOVA bidirectionnelle avec les comparaisons multiples de Tukey comparant la libération de CAB par rapport à la formulation et au point temporel. Au jour 90 après la libération in vitro après stockage, toutes les formulations de stockage ont provoqué une libération de CAB significativement différente et plus lente que la ligne de base (p <0,0001) b Tableau récapitulatif de la cinétique de libération in vitro de CAB ISFI après stockage à partir de a. c Effet des conditions de stockage sur le MW moyen en poids PLGA des formulations placebo mesuré par analyse par chromatographie par perméation de gel (GPC). d Tableau récapitulatif de la dégradation du PLGA dans la formulation placebo après 30 et 90 jours à 4 °C et 40 °C/75 % HR. Solvant = 1:1 w/w NMP:DMSO. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Cette diminution de la cinétique de libération a probablement été influencée par l'hydrolyse du PLGA dans des conditions de stockage stables. Les agents de dégradation du PLGA peuvent cristalliser pendant l'hydrolyse24, ce qui donne un réseau polymère plus cristallin qui peut ralentir la libération du médicament. Pour confirmer la dégradation, l'analyse par chromatographie par perméation de gel (GPC) de la formulation ISFI placebo (1:4 w/w PLGA (10 kDa):solvant) a démontré une diminution de 2,3 % de MW lorsqu'elle est conservée à 4 °C et une diminution de 36,1 % de MW lorsqu'il est stocké à 40 ° C / 75% HR pendant 90 jours (Fig. 2c et d) par rapport au PLGA MW initial (t = 0). De plus, le pH de la formulation placebo a été mesuré avant et après stockage. Au départ et après 90 jours de stockage à 4 °C, le pH de la formulation placebo était neutre (pH = 6–7) alors que le pH est devenu plus acide (pH = 4) après 90 jours de stockage à 40 °C/75 % HR, confirmant davantage la dégradation du PLGA en ses sous-produits acides, en particulier après stockage à 40 °C/75 % HR. Dans l'ensemble, CAB ISFI était plus stable au stockage à 4 ° C, comme en témoigne la dégradation minimale du PLGA (2, 3%) et la capacité à conserver l'injectabilité et l'homogénéité de la formulation après 90 jours.

Une étude de sécurité in vivo de CAB ISFI a été menée avec des souris femelles BALB/c pour évaluer l'inflammation locale et systémique après l'injection par rapport aux souris témoins qui n'ont reçu aucun traitement ou injection. Les résultats de l'étude ont montré que le CAB ISFI était bien toléré et que les souris ne présentaient aucun signe de toxicité manifeste, de changement de comportement ou de perte de poids (Fig. 6 supplémentaire). L'analyse histopathologique de l'implant excisé et du tissu sous-cutané environnant a démontré que le CAB ISFI présentait une inflammation locale légère à modérée illustrée par des cellules immunitaires infiltrées autour du dépôt (Fig. 3a). Aux jours 3 et 7, le score médian d'inflammation microscopique de la peau était de 3 (inflammation modérée) probablement en raison de la réponse immunitaire initiale à l'injection et a diminué au jour 30 chez 2 des 3 souris testées (Fig. 3b).

a Inflammation locale des dépôts excisés et des tissus sous-cutanés environnants collectés aux jours 3, 7 et 30 après l'injection (n = 3/point de temps pour les souris traitées par CAB ISFI et n = 1/point de temps pour les souris témoins (sans injection)) et colorées avec IL. Les astérisques indiquent l'implant CAB. Les flèches indiquent les cellules immunitaires infiltrées et les zones d'inflammation. Toutes les barres d'échelle représentent 1 mm. b Score inflammatoire du tissu sous-cutané entourant le dépôt évalué à l'aide d'un microscope optique et noté à l'aveugle par un pathologiste certifié. Les barres noires représentent le score d'inflammation médian à chaque point de temps (n = 3 par point de temps). Score d'inflammation : 0 : cellules inflammatoires présentes dans les limites attendues ; 1 : inflammation minimale, présence de quelques cellules immunitaires dispersées et augmentées ; 2 : inflammation légère, petits amas de cellules immunitaires à traces fines ou localisées d'inflammation ou légère augmentation du nombre de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 3, traces modérées, plus épaisses ou multiples d'inflammation ou nombre modéré de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 4, pistes d'inflammation coalescentes sévères suffisamment grandes pour remplacer l'architecture tissulaire normale ou un nombre important de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 5, marquée, inflammation présente qui remplace de vastes zones de l'architecture tissulaire normale. c Concentration de TNF-α (pg/mL) dans le plasma quantifiée par ELISA au jour 3 (n = 3), 7 (n = 3) et 30 (n = 5) après l'injection. d Concentration d'IL-6 (pg/mL) dans le plasma quantifiée par ELISA au jour 3 (n = 3), 7 (n = 3) et 30 (n = 5) après l'injection. e Concentration de CAB (moyenne ± écart type) dans le plasma (1215 mg/kg) pendant 90 jours (n = 6 par point de temps). Les valeurs 1 × et 4 × PA-IC90 sont indiquées par des lignes pointillées pour CAB (166 ng/mL et 664 ng/mL, respectivement). Des échantillons de plasma de souris individuelles sont présentés dans la Fig. 7 supplémentaire. Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

L'inflammation systémique a été évaluée par dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour quantifier les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-6 dans le plasma. Les résultats n'ont montré aucune inflammation aiguë ou chronique systémique. Le TNF-α variait entre 0 et 20 pg/mL et était comparable au groupe témoin sans injection (p = 0,5521) (Fig. 3c). Les niveaux d'IL-6 dans le plasma variaient entre 0 et 45 pg/mL (Fig. 3d) et les niveaux étaient comparables à ceux observés dans le groupe témoin sans injection [p = 0,4188 (ANOVA à 2 voies avec comparaisons multiples)]. La variabilité des scores d'inflammation ou des niveaux de cytokines pro-inflammatoires peut être attribuée à la variabilité interindividuelle ou à la variabilité du cycle hormonal chez la souris34. Dans l'ensemble, ces résultats ont démontré que les ISFI CAB étaient généralement bien tolérés et considérés comme sûrs, sans signes manifestes de toxicité ou d'inflammation chronique.

Des études pharmacocinétiques (PK) ont été menées chez des souris BALB/c femelles pendant 90 jours pour évaluer la cinétique de libération de médicament in vivo de CAB ISFI. Les concentrations plasmatiques de CAB ont été quantifiées à l'aide d'une méthode LC / MS-MS par chromatographie liquide à haute performance et spectrométrie de masse en tandem et ont été tracées sur 90 jours (Fig. 3e). En outre, nous avons évalué la cinétique de libération de CAB par rapport à trois modèles mathématiques (ordre zéro, premier ordre et diffusion contrôlée35). Nous avons déterminé que la libération in vivo observée de CAB chez la souris correspond le mieux à un modèle d'ordre zéro (modèle d'ordre zéro R2 = 0,97 ; modèle de premier ordre R2 = 0,87 ; modèle contrôlé par diffusion R2 = 0,86) sur la durée de l'étude PK de 90 jours. De plus, la concentration moyenne de CAB dans le plasma était entre 6 et 53 fois supérieure au 4 × PA-IC90 (664 ng / ml16) entre toutes les souris pendant toute l'étude de 90 jours (Fig. 3e et Fig. 7 supplémentaire).

Sur la base des données prometteuses d'innocuité et de pharmacocinétique chez les souris BALB/c, la formulation CAB ISFI a été sélectionnée pour l'évaluation de l'innocuité, de la pharmacocinétique et de l'efficacité chez les macaques rhésus. Cependant, étant donné que le volume d'injection pour les macaques (deux injections de 1 mL) serait beaucoup plus élevé que pour les souris (50 µL), il était essentiel d'assurer l'injectabilité de la formulation de grands volumes in vitro avant de passer aux études sur les macaques. Pour évaluer l'injectabilité de la formulation CAB ISFI optimisée, nous avons utilisé des hydrogels de polyacrylamide36. Il a été démontré que les hydrogels de polyacrylamide imitent les propriétés mécaniques du tissu sous-cutané in vivo au site d'injection et suscitent une meilleure corrélation avec la libération in vivo des ISFI plutôt que les méthodes de libération in vitro standard par injection directe dans un bain PBS36,37. L'évaluation de l'injectabilité était essentielle pour la formulation CAB ISFI en raison de sa propriété d'inversion de phase rapide lors de l'injection, qui est attribuée à la haute miscibilité des solvants organiques avec l'eau et à la faible PLGA MW24. Si l'inversion de phase est trop rapide, la formulation pourrait se solidifier entre la seringue et l'aiguille et bloquer le flux d'injection.

En tant que tel, nous avons étudié l'injectabilité de plusieurs formulations placebo avec différents rapports polymère/solvant et PLGA MW ainsi que la formulation CAB ISFI optimisée (1:4 w/w PLGA (10 kDa):solvant). L'injectabilité des formulations dans des hydrogels de polyacrylamide a été étudiée avec des aiguilles de calibre 16 (G), 18 G et 19 G avec un volume d'injection de 1 ml (tableau supplémentaire 3). Comme le montre le tableau supplémentaire 3, une injection de 1 ml dans la matrice d'hydrogel avec une aiguille de 19 G de la formulation PLGA 1: 4 w / w (10 kDa): solvant placebo ou CAB ISFI n'a pas réussi en raison d'une inversion de phase rapide et rapide formation de dépôt conduisant à l'obstruction de l'écoulement de la formulation à travers l'aiguille. Cela a probablement été attribué à la combinaison de PLGA à faible poids moléculaire (10 kDa) et de grandes quantités de solvant (1:4 w/w PLGA:solvant). D'autre part, 1 mL d'ISFIs placebo préparés avec un PLGA MW supérieur (27 kDa) ou des quantités inférieures de solvant (1:3 et 1:2 w/w PLGA:solvant) ont été injectés avec succès dans la matrice d'hydrogel. De plus, l'injection de 1 mL de l'ISFI CAB optimisé (500 mg/mL 1:4 PLGA (10 kDa) : solvant) dans la matrice d'hydrogel a été réalisée avec succès avec une aiguille de 18 G ou 16 G. Sur la base de ces résultats, une aiguille de 16 G a été utilisée pour administrer facilement la formulation CAB ISFI dans les études sur les macaques.

Nous avons administré CAB ISFI à six macaques rhésus femelles. Tous les animaux ont reçu deux injections séparées de 1 ml (total de 1000 mg de CAB) à l'exception d'un macaque (RH-1080) qui a reçu une injection de 1,0 ml et 0,5 ml d'ISFI ou un total de 750 mg de CAB. Sur une base par poids, les animaux ont reçu entre 72,8 et 143,9 mg/kg de CAB (médiane = 113,8 mg/kg). Le macaque RH-42012 était un animal infecté par le SHIV et par ailleurs en bonne santé issu d'une étude distincte et a été inclus à des fins pharmacocinétiques uniquement. La figure 4a montre les concentrations longitudinales de CAB dans le plasma. Dans l'ensemble, tous les macaques ont atteint des concentrations plasmatiques de CAB supérieures au 4 × PA-IC90 à la semaine 4, à l'exception du RH-1073, qui a atteint des concentrations de référence à la semaine 24 (1230 ng/ml). Les concentrations plasmatiques médianes (plage) de CAB aux semaines 4, 8 et 12 étaient de 982 [406–1977], 1950 [578–5627] et 2127 [522–2552] ng/mL, respectivement, soit environ 1,5- à 3,2- plier au-dessus du 4 × PA-IC90. Le retrait des deux ISFI CAB chez les macaques RH-1097 et RH-1093 à la semaine 12 a entraîné une réduction de 7 et 48 fois des taux plasmatiques de CAB à 72 h et une baisse d'environ 10 à 100 fois 2 semaines après le retrait, respectivement (Fig. 4a). De même, le retrait de l'un des deux ISFI qui sont restés palpables chez le macaque RH-42012 à la semaine 14 a entraîné une diminution d'environ 2 fois du CAB plasmatique en une semaine (1 550–765 ng/mL) ; Les concentrations de CAB sont restées au-dessus du 4 × PA-IC90 pendant 3 semaines supplémentaires. Chez les trois animaux restants avec des ISFI CAB intacts, les concentrations plasmatiques médianes de CAB aux semaines 16, 20, 24 et 28 étaient de 1923 [534–2082], 2 227 [646–2827], 1230 [971–1585] et 886 [ 473–1415] ng/mL, respectivement, soit 1,3 à 3,4 fois au-dessus du 4× PA-IC90 (Fig. 4b). Notamment, les taux plasmatiques de CAB chez un animal (RH-1048) sont restés au-dessus du 4 × PA-IC90 à la semaine 47 (838 ng/mL). Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que deux injections de 1 ml de la formulation optimisée CAB ISFI peuvent libérer du CAB chez les macaques à des niveaux supérieurs au seuil de protection jusqu'à 6 à 11 mois.

a Évaluation longitudinale des concentrations de CAB dans le plasma. Les deux ISFI CAB ont été retirés des macaques RH-1097 et 1093 (cercles pleins bleus et violets) à la semaine 12 et l'un des deux ISFI CAB a été retiré du macaque RH-42012 à la semaine 14 (cercle plein vert). Les lignes pointillées indiquent les niveaux de CAB après le retrait. b L'astérisque (*) indique les animaux dont les ISFI ont été retirés aux semaines 12 à 14. Les données après le retrait de l'implant ne sont pas incluses dans le calcul des médianes. c Niveaux de CAB détectés dans le plasma, les tissus rectaux et les tissus vaginaux de trois macaques (RH-42012, RA-1048 et RA1080) avec CAB ISFI. Les échantillons ont été prélevés sur les mêmes animaux à trois moments différents après l'implantation (semaine 4, 8 et 12). Les barres noires représentent la médiane. d Rapport des concentrations de CAB dans les tissus vaginaux (VT) et les tissus rectaux (RT) par rapport au plasma.

Les concentrations de CAB ont également été mesurées dans les tissus vaginaux et rectaux de trois macaques (RH-42012, RA-1048 et RA-1080) aux semaines 4, 8 et 12. La figure 4c montre que le CAB a été systématiquement détecté dans les deux tissus, avec le seule exception du macaque RH-1048 qui avait un CAB indétectable dans les tissus vaginaux à la semaine 4. Les concentrations médianes de CAB dans les tissus rectaux ont été multipliées par environ 3 entre la semaine 4 et la semaine 8 (333–1004 ng/g, respectivement) et ont légèrement diminué par semaine 12 (713 ng/g). Les concentrations médianes de CAB dans les tissus vaginaux ont également augmenté d'environ 2,8 fois entre les semaines 4 et 8 (293 à 849 ng/g, respectivement) et sont restées à 823 ng/g à la semaine 12. Les rapports tissu/plasma (Fig. 4d) sont restés stables au fil du temps. et étaient similaires dans le vagin [médiane = 0,18 (0,15–0,32)] et le compartiment rectal [médiane = 0,42 (0,23–0,43)].

Pour déterminer si le CAB délivré par les ISFI pouvait conférer une protection rectale, nous avons effectué une série d'expériences de provocation SHIV à différents moments après l'implantation. Nous avons d'abord évalué la protection à court terme chez deux macaques (RH-1093 et ​​RH-1097) provoqués deux fois par semaine entre les semaines 4 et 8 (total de huit défis par animal) (Fig. 5a). Les deux animaux ont été protégés contre l'infection par le SHIV par opposition à un témoin en temps réel non traité (RH-1092) qui a été infecté après une seule exposition au SHIV. La protection à long terme a été évaluée chez deux macaques supplémentaires (RH-1048 et RH-1080) qui ont été exposés deux fois par semaine au SHIV entre les semaines 14 et 18 (8 provocations par animal) (Fig. 5b). Un animal (RH-1048) qui a maintenu des niveaux plasmatiques de CAB au-dessus de 4 × PA-IC90 a reçu six autres provocations SHIV entre les semaines 25 et 28. Les deux animaux traités par CAB ont été protégés contre l'infection tandis qu'un témoin en temps réel non traité (RH-1084) a été infecté après une seule exposition au SHIV (Fig. 5b). Dans l'ensemble, un seul traitement ISFI a complètement protégé 4 macaques au cours d'un cumul de 38 expositions rectales au SHIV qui ont duré 27 semaines.

a Protection à court terme par les ISFI du CAB. Deux macaques traités au CAB (RH-1093 et ​​RH-1097) et un macaque non traité (RH-1092) ont été exposés par voie rectale au SHIV entre les semaines 4 et 8 après l'implantation. Chaque animal a reçu des provocations rectales au SHIV deux fois par semaine pendant jusqu'à 4 semaines (total de huit expositions). Les flèches indiquent les expositions SHIV. Les ISFI ont été enlevés chirurgicalement à la semaine 12 (cercles pleins bleus et violets) b Niveaux plasmatiques d'ARN SHIV détectés par PCR en temps réel chez les animaux pendant la période de provocation et la période de suivi de 32 semaines. c Protection longue durée par CAB ISFI. Deux macaques traités par CAB (RH-1080 et RH-1048) et un macaque non traité (RH-1084) ont reçu des provocations rectales au SHIV deux fois par semaine entre les semaines 14 et 18 après l'implantation (jusqu'à 8 expositions). L'animal RH-1048 a reçu six provocations SHIV supplémentaires entre les semaines 25 et 28 (total de 14 expositions). Les flèches indiquent les expositions SHIV. d Niveaux plasmatiques d'ARN SHIV détectés par PCR en temps réel chez les animaux pendant la période de provocation et la période de suivi de 24 à 36 semaines.

Pour évaluer la sécurité et la tolérabilité, nous avons examiné la zone entourant les implants chaque semaine jusqu'à 12 semaines ou jusqu'à ce que l'implant soit retiré. Cette évaluation a inclus les six macaques qui ont reçu deux injections pour une analyse cumulative de 12 sites d'implantation et un total de 144 observations cliniques. Sur la base de l'échelle de Draize, tous les sites d'implantation étaient sans particularité et n'ont montré aucun signe de réaction cutanée locale au cours de la période d'étude de 12 semaines (Fig. 6a et Fig. 8 supplémentaire). Une évaluation histopathologique semi-quantitative a été réalisée sur une biopsie dermique au poinçon chirurgical de 3 mm prélevée sur le site de l'implant chez trois macaques lors du retrait de l'implant (12 à 14 semaines après l'implantation). À titre de comparaison, une biopsie chirurgicale à l'emporte-pièce de 3 mm a été prélevée sur un animal n'ayant pas reçu d'injection CAB ISFI. Les biopsies cutanées ne présentaient pas d'infiltrats lymphoplasmocytaires minimes chez les animaux, y compris le contrôle, et aucun signe d'infection ou de corps étranger (implant résiduel) présent dans aucune des coupes de tissu (Fig. 6b et Tableau supplémentaire 4).

une carte thermique des réactions cutanées locales au site de l'implant chez les six animaux traités par ISFI. Les réactions cutanées locales ont été notées à l'aide d'une échelle de Draize (0-aucune à 4-sévère). b Histopathologie de la peau. Une biopsie cutanée par animal a été prélevée à l'implantation chez les animaux traités RH-1093, RH-1097, RH-42012 (n = 3) et un témoin non traité (n = 1). Toutes les barres d'échelle représentent 1 mm (H&E, grossissement d'origine ×4).

Pour évaluer la récupérabilité des implants après les études in vivo, nous avons retiré les ISFI CAB des souris aux jours 30 (n = 6), 60 (n = 6) et 90 (n = 6) après l'administration en faisant une petite incision cutanée à l'euthanasie. Les ISFI ont été retirés avec succès de tous les animaux sans tissu fibrotique entourant le dépôt (Fig. 7a). Les dépôts retirés au jour 30 (n = 6), 60 (n = 6) et 90 (n = 6) ont été traités ultérieurement pour évaluer la dégradation du polymère (n = 3/point de temps) et les concentrations résiduelles de CAB (n = 3/point de temps) . Après 90 jours chez la souris, les résultats de ces analyses ont montré une perte de masse de dépôt de 59, 5 ± 13, 4% (Fig. 7b) et une diminution du poids moléculaire du PLGA de 49, 7 ± 5, 4% (Fig. 7c). Il est important de noter qu'il restait 61, 6 ± 6, 5% de CAB dans les implants récupérés sur des souris au jour 90, démontrant que la libération de CAB par l'ISFI peut être maintenue au-delà de 90 jours (Fig. 7d).

a Image des ISFI CAB extraits de souris BALB/c 30, 60 et 90 jours après l'injection. b Masses ISFI CAB 30, 60 et 90 jours après l'injection chez la souris (moyenne ± écart type ; n = 6/point dans le temps) par rapport à la masse ISFI initiale (jour 0) à partir d'un volume d'injection de 50 µL (60,75 mg) . Les masses du jour 0 ont été calculées sur la base d'un volume d'injection de 50 µL et en utilisant la densité de la formulation (1,215 g/mL) pour déterminer la masse approximative à l'injection. c Quantification du CAB résiduel dans les ISFI 30, 60 et 90 jours après l'injection chez la souris (moyenne ± écart type de n = 3 échantillons) par rapport à la dose initiale (25 mg dans 50 µL d'injection). d Diminution du poids moléculaire du PLGA dans les ISFI CAB 30, 60 et 90 jours après l'injection chez la souris (moyenne ± écart type de n = 3 échantillons) par rapport au PLGA pur (10 kDa). e Quantification du médicament résiduel des implants (injectés dans le haut du dos gauche et droit) récupérés sur trois macaques rhésus 84 et 98 jours après l'injection. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, les deux ISFI CAB ont été retirés de deux macaques (RH-1097 et RH-1093) au jour 84 et un ISFI retiré d'un troisième macaque (RH-42012) au jour 98 après l'injection. Comme le montre la Fig. 7e, il restait en moyenne 48,32 ± 11,44 % de CAB par implant après le retrait du dépôt.

Les taux de clairance individuels du CAB ont été estimés (Fig. 9 supplémentaire) sur la base du profil PK extravasculaire de nos six macaques ayant reçu 1,5 à 2 ml de CAB ISFI sous-cutané [médiane (IQR) = 15,9 (9,1 à 25,2) ml / (h * kg) ] et pour neuf macaques de référence historiques ayant reçu 50 mg/kg de CAB LA intramusculaire 7 et 1 jours avant l'échantillonnage PK [médiane (IQR) = 12,4 (11,7–14,3) ml/(h*kg)]38. Les taux d'entrée pour ces deux formulations à action prolongée ont été dérivés en multipliant la concentration plasmatique observée par le taux de clairance estimé des animaux respectifs corrigé pour le poids au moment de l'administration chez nos six macaques traités par ISFI ou un poids supposé de 8 kg chez les macaques de référence historiques (Fig. 8 ). Les taux d'entrée cibles pour un dosage clinique efficace ont été estimés à l'aide des paramètres moyens d'un modèle PK de population CAB publié (CL = 151 mL/h, V2 = 5270 mL, Q = 507 mL/h et V3 = 2430 mL)39 pour simuler le plasma humain concentrations à divers débits de perfusion IV. Des taux d'apport de 3 et 0,75 mg/jour ont atteint des concentrations plasmatiques supérieures à 4 × PA-IC90 et 1 × PA-IC90, respectivement. Les taux médians d'entrée CAB ISFI observés dans notre étude sur les macaques ont dépassé ce seuil d'efficacité clinique de 3 mg/jour entre le jour 28 et le jour 140 après l'administration. En supposant que le débit d'entrée augmente proportionnellement au volume d'injection, une injection CAB ISFI de 3 ml atteindrait ce seuil entre le jour 21 et le jour 168 ou 5,6 mois après l'administration. Par rapport aux macaques ayant reçu deux injections intramusculaires de CAB LA de 50 mg/kg à 6 jours d'intervalle, les CAB ISFI ont maintenu des taux supérieurs au seuil de protection prévu pendant une médiane de 97 jours supplémentaires (Fig. 8b).

un taux d'entrée CAB ISFI est estimé en multipliant les concentrations plasmatiques observées avec la clairance de chaque animal respectif, telle que déterminée par leur profil PK extravasculaire. Les lignes de référence en pointillés et en pointillés indiquent des taux d'apport de 3 et 0,75 mg/jour qui devraient atteindre des concentrations plasmatiques chez l'homme supérieures à 4 × PA-IC90 et PA-IC90, respectivement. b Les taux d'entrée médians (± IQR) CAB ISFI de a observés dans cette étude (ligne verte) sont superposés aux taux médians projetés pour un volume d'injection de 3 mL (en supposant que le taux d'entrée augmente proportionnellement au volume ; ligne violette) et à ceux estimés pour n = 9 macaques de référence ayant reçu 50 mpk (mg par kg) de CAB LA intramusculaire 7 et 1 jours avant l'échantillonnage PK38.

Nous rapportons un CAB ISFI à action ultra-longue qui prolonge les intervalles de dosage avec de petits volumes d'injection, offre une protection durable contre l'infection rectale par le SHIV et permet la récupération du produit. Nous démontrons la libération de CAB au-dessus des repères de protection PrEP établis jusqu'à 6 à 11 mois chez les macaques et avons utilisé ces données pour estimer les expositions cliniques. Nous avons constaté qu'une injection de 2 ml ou 3 ml de notre formulation maintiendra des concentrations plasmatiques chez l'homme au-dessus du 4 × PA-IC90 pendant plus de 4 mois ou 5 mois, respectivement.

Les ISFI CAB sont restés injectables, n'ont montré aucune dégradation du médicament et ont maintenu une concentration homogène de CAB lorsqu'ils sont stockés jusqu'à 30 jours à 40 ° C / 75% HR et jusqu'à 90 jours à 4 ° C, démontrant la stabilité de la formulation. Bien que les études de libération in vitro post-stockage aient ralenti la libération de CAB dans les deux conditions de stockage, il n'y avait qu'une différence d'environ 3 % dans la libération cumulative de CAB entre la ligne de base et après 90 jours de stockage à 4 °C. Nous avons également réalisé des études d'injectabilité ISFI dans des hydrogels de polyacrylamide pour comprendre si les propriétés d'inversion de phase rapide des ISFI entraînant une solidification potentielle de l'implant pourraient constituer une limitation associée à l'administration de volumes d'injection importants (≥ 1 ml). Nous avons démontré qu'un calibre d'aiguille de 18 G ou 16 G peut être utilisé pour des volumes d'injection ≥ 1 mL. Chez les souris BALB/c, les concentrations plasmatiques de CAB étaient jusqu'à 53 fois supérieures à la 4 × PA-IC90 pendant 90 jours. Chez les macaques rhésus, les CAB ISFI ont maintenu les concentrations plasmatiques de CAB au-dessus du 4 × PA-IC90 pendant 6 à 11 mois, contrairement aux formulations de CAB à action prolongée rapportées précédemment qui documentaient des périodes beaucoup plus courtes de taux plasmatiques de CAB au-dessus des repères protecteurs40,41,42, 43. Nos études de sécurité in vivo chez des souris BALB/c femelles et des macaques rhésus femelles ont montré que les ISFI CAB étaient bien tolérés sans niveaux significatifs d'inflammation locale ou systémique. De plus, les implants palpables étaient toujours récupérables chez les souris et les macaques jusqu'à 90 jours après l'injection, démontrant la capacité d'être facilement retirés en cas d'événements indésirables, ce qui peut éliminer le besoin de couvrir une longue queue pharmacologique avec la PrEP orale comme c'est le cas. avec la formulation actuelle de CAB LA. Nous avons également noté environ 60 % de CAB restant dans l'implant chez les souris et entre 30 et 60 % de CAB restant dans chaque implant chez les macaques après récupération 84 à 90 jours après l'injection, ce qui démontre que les ISFI CAB ont le potentiel de se libérer pendant des périodes beaucoup plus longues. de temps.

Chez les macaques rhésus, une dose de 50 mg/kg de CAB LA injectable fournit des concentrations plasmatiques de CAB supérieures à la référence de protection PrEP établie pendant environ 6 semaines44. Ici, nous montrons que deux injections d'ISFI de CAB de 1 ml qui ne contiennent que 1,5 à 2,9 fois plus de CAB par kg peuvent maintenir des niveaux plasmatiques de CAB au-dessus de cette référence pendant 6 à 11 mois. Dans les tissus rectaux et vaginaux, les concentrations de CAB étaient également dans la gamme de celles observées chez les macaques traités avec CAB LA et environ 2 à 4 fois plus élevées que celles obtenues chez l'homme avec la dose clinique de 600 mg de CAB LA, bien qu'une limitation potentielle soit que notre analyse n'incluait que les 12 premières semaines après l'implantation44,45. De plus, le CAB ISFI à action ultra-longue présente des avantages notables par rapport aux autres formulations de CAB à action prolongée en cours de développement préclinique. Karunakaran et al. ont rapporté des implants CAB radio-opaques en poly (éther-uréthane) hydrophile à longue durée d'action qui ont atteint des niveaux plasmatiques chez les macaques supérieurs au 1 × PA-IC90 pendant 12 semaines, mais sont tombés en dessous du 4 × PA-IC90 après environ 2 semaines après l'implantation avec six implants par macaque41. Chaque implant contenait environ 274 mg de CAB et libérait en moyenne 348 µg de CAB/jour in vivo41. Zhou et al. et Kulkarni et al. ont rapporté un promédicament nanoformulé injectable de CAB qui a démontré une libération prolongée de CAB chez les macaques (45 mg d'équivalents de CAB/kg, volume d'injection intramusculaire d'environ 2 ml) pendant un an, cependant, les concentrations plasmatiques de CAB sont tombées en dessous du 4 × PA-IC90 et PA-IC90 après ~60 jours42 et 200 jours43, respectivement. Le CAB ISFI injectable et biodégradable décrit dans notre étude a démontré des niveaux plasmatiques de CAB supérieurs au 4 × PA-IC90 pendant 6 à 11 mois chez les macaques et a montré une protection à 100% contre de multiples provocations rectales au SHIV avec seulement deux injections sous-cutanées de 1 mL.

Nos résultats montrant une protection à 100 % chez les macaques sur plusieurs mois représentent également à notre connaissance l'activité PrEP documentée la plus longue observée avec une seule administration de CAB. Nous avons limité les défis SHIV aux périodes où les niveaux plasmatiques de CAB étaient supérieurs au 4 × PA-IC90, car cette concentration représente une référence de protection PrEP bien établie chez les macaques et les humains. La protection complète observée malgré un cumul de 38 expositions rectales au SHIV n'était donc pas totalement inattendue. Il sera important de définir plus précisément la durée de l'activité PrEP des ISFI CAB, car des niveaux supérieurs à 1 × PA-IC90 ont également été associés à une protection significative (> 95 %) contre les provocations rectales par le SHIV chez les macaques40,46. Cette analyse peut également informer sur les réductions potentielles des doses ou des volumes d'injection de CAB ISFI et sur l'extension potentielle de la protection au-delà des 5,6 mois prévus avec une injection de 3 ml chez l'homme. Cependant, la documentation d'infections rares chez les humains ayant reçu du CAB LA et maintenu les niveaux cibles peut plaider contre la réduction de la dose de CAB47,48.

L'analyse des concentrations plasmatiques de CAB chez les macaques après le retrait de l'implant après 3 mois a également fourni des informations importantes sur la récupérabilité des ISFI. Chez deux des macaques, le retrait des deux implants a entraîné une diminution rapide de 10 à 100 fois des taux plasmatiques de CAB en 2 semaines, bien que du matériel d'implant résiduel soit évident chez l'un des animaux, comme l'indique la détection persistante de CAB. dans le plasma à des niveaux supérieurs au PA-IC90. Chez un autre macaque, le retrait de l'un des deux implants a entraîné une diminution rapide de 2 fois des taux plasmatiques de CAB en une semaine. Dans tous les cas, environ la moitié de la dose de CAB est restée dans l'ISFI récupéré, ce qui suggère que les ISFI de CAB ont le potentiel de se libérer pendant des périodes beaucoup plus longues. Des études futures sont nécessaires pour définir la fenêtre d'amovibilité et pour comprendre le temps d'épuisement du CAB des ISFI. Bien que le CAB ISFI proposé ait démontré un potentiel prometteur pour la PrEP du VIH, il existe quelques limites à cette formulation. Par exemple, bien que nous n'ayons observé aucun signe de toxicité ou d'effet indésirable dans notre étude sur l'innocuité des souris, nos résultats sont limités en raison de la faible taille de l'échantillon de l'étude (n = 3). Ainsi, les futures études comprendront la réalisation d'une étude de sécurité complète chez la souris avec un échantillon plus important et l'évaluation de la sécurité à long terme jusqu'à 180 jours. Une autre limitation est qu'il y a une baisse initiale de la concentration de CAB chez les macaques au cours des deux premières semaines après l'injection avec une perte potentielle d'activité PrEP lorsque les niveaux tombent en dessous du 4 × PA-IC90. Cette période de faible libération, si elle est confirmée chez l'homme, se traduirait par la recommandation de modalités alternatives de prévention du VIH pendant 28 jours après la première injection CAB ISFI avec un volume d'injection de 2 ml ou 21 jours avec une injection de 3 ml. Les directives actuelles du CDC sur la PrEP recommandent des modalités alternatives de prévention du VIH pendant 7 à 20 jours après le début de la PrEP orale quotidienne en fonction de la voie de transmission potentielle49. Une autre limitation potentielle est que la formulation comprend des solvants organiques, qui pourraient provoquer une toxicité à des quantités élevées. La dose létale médiane (LD50) et la dose sans effet observable (NOEL) de la NMP sont respectivement de 3600 mg/kg et 257 mg/kg chez la souris lorsqu'elles sont administrées par voie intraveineuse50. Alternativement, la LD50 et la NOEL du DMSO sont de 4000 mg/kg et 3300 mg/kg respectivement chez les primates non humains et la LD50 chez la souris est de 14 000 mg/kg lorsqu'il est administré dans la circulation sanguine51. Dans notre étude, environ 300 mg/mL par solvant ont été administrés à des souris (700 mg/kg par solvant) et des macaques (71 mg/kg par solvant) et n'ont montré aucun signe de toxicité chronique ou manifeste. Bien que les ISFI soient bien inférieurs aux limites LD50 et NOEL pour le DMSO et la NMP chez les macaques, les études futures devraient inclure des efforts pour réduire la quantité de solvant afin de réduire les problèmes de toxicité potentiels.

Des études supplémentaires pour remédier à ces limitations et faire avancer cette étude comprennent (1) l'augmentation de la libération en rafale du CAB ISFI, la dose administrée ou la mise en œuvre d'une dose initiale orale pour garantir que les concentrations dans le plasma restent supérieures au 4 × PA-IC90 pendant le premier mois après l'injection (2) déterminer le temps d'achèvement de la libération du CAB et de la dégradation complète du polymère pour évaluer le profil PK complet in vivo, et (3) incorporer du sulfate de baryum pour générer un implant radio-opaque pour la surveillance aux rayons X afin de faciliter la récupération si nécessaires et étudier la migration de l'implant. De plus, nous avons démontré la capacité de charger plusieurs ARV dans un seul ISFI pour obtenir une cinétique de libération à action ultra-longue chez la souris20. Ainsi, des études futures supplémentaires pourraient inclure l'ajout d'un autre ARV à la formulation ISFI CAB actuellement proposée pour les applications de traitement du VIH.

Pris ensemble, ces résultats mettent en évidence la promesse des ISFI CAB en tant que plateforme à action ultra-longue pour administrer la PrEP et soutenir son avancement clinique chez l'homme. L'innocuité préclinique observée et la bioéquivalence pharmacocinétique étendue à CAB LA sont très prometteuses et, si elles sont démontrées cliniquement, peuvent aboutir à une procédure accélérée d'approbation réglementaire, éventuellement sans nécessiter d'essais d'efficacité. Nous prévoyons que les ISFI CAB seront hautement souhaitables avec une adhérence élevée s'ils sont avancés dans un cadre clinique. Des études ont montré que les injectables à action prolongée suscitent la plus grande acceptabilité et adhésion des utilisatrices dans les zones où la prévalence du VIH est la plus élevée par rapport à d'autres formes posologiques potentielles (par exemple, pilule orale quotidienne et anneaux vaginaux)5,10 en raison de la faible fréquence de dosage, de la familiarité, de la facilité d'utilisation et de discrétion. De plus, la formulation proposée pourrait être auto-administrée puisqu'elle est injectée par voie sous-cutanée, ce qui pourrait encore augmenter l'acceptabilité par l'utilisateur et la facilité d'accès. Dans l'ensemble, le CAB ISFI à action ultra-longue a le potentiel d'être administré deux à trois fois par an dans un cadre clinique et peut faire progresser le paysage du VIH et élargir les options de prévention dans le monde entier.

50:50 poly(DL-lactide-co-glycolide, PLGA) a été acheté auprès de LACTEL (Birmingham, AL ; Cat. No. B6010-1P, Lot # A17–142, poids moléculaire 27,2 kDa, viscosité inhérente 0,26-0,54 Dl/ g; Cat. No. B6017-1G, Lot # A15-108, poids moléculaire 10 kDa, viscosité inhérente 0,15-0,25 Dl/g). La N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP, USP) a été reçue d'ASHLAND (Wilmington, DE, code produit 851263, 100 % NMP). Le diméthylsulfoxyde (DMSO, ≥ 99,7 %) a été acheté auprès de Fisher Scientific (Waltham, MA). Le Solutol-HS 15, une solution saline tamponnée au phosphate (0,01 M PBS, pH 7,4) et de l'acétonitrile de qualité HPLC (ACN) et de l'eau ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Gelucire 44/14 (Cat. No. 1356950) a été acheté chez Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Le Tween 20 a été acheté auprès de Fisher Scientific (Hampton, NJ; Cat. No. BP337-100). Le tétrahydrofurane (THF) a été acheté auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, Mo; Cat. No. SHBF9530V). 98,5 % d'acrylamide (AM) et de persulfate d'ammonium (APS) ont été achetés par Acros Organics (Carlsbad, CA ; AM Cat. No. 16435000, APS Cat. No. 40116-1000), et une solution de bis-acrylamide à 2 % et N, N , N', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) ont été achetés auprès de Fisher Scientific (Hampton, NJ; bis-acrylamide Cat. No. BP150-20, TEMED Cat. No. BP1404-250). Le CAB de haute pureté (≥ 99 %) a été acheté auprès de Selleckchem (Houston, TX ; Cat. No. S7766) et le DMSO filtré stérile (≥ 99,7 %) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ; Lot # RNBH5297).

Une analyse HPLC en phase inverse a été réalisée sur un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) avec un détecteur à barrette de diodes et une pompe LC avec échantillonneur automatique. La phase stationnaire utilisée pour l'analyse CAB était une colonne Inertsil ODS-3 (5 μm, 4, 6 × 150 mm 100 Å, [GL Sciences, Torrance, CA]) maintenue à 40 ° C. La séparation chromatographique a été réalisée par élution en gradient en utilisant une phase mobile constituée de 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'eau et de l'ACN (H2O/ACN 95:5 v/v). Le débit était de 1,0 ml/min et la durée totale d'exécution était de 25 min pour chaque injection de 25 ml. Le CAB a été analysé à une longueur d'onde de 254 nm et avait un temps de rétention de 11,4 minutes. La plage d'étalonnage pour le test était de 0,48 à 250 µg/mL. Le logiciel Agilent OpenLab (version C.01.08) a été utilisé pour la collecte des données HPLC.

La concentration de saturation de CAB dans le NMP, le DMSO, divers rapports pondéraux (p/p) de NMP:DMSO (1:1, 9:1 et 2:8 p/p), 9:1 NMP:Gelucire 44/14 ( w/w), 9: 1 w/w (NMP: DMSO): Tween 20 (tableau supplémentaire 1) pour déterminer le solvant optimal dans le système ISFI pour une charge CAB maximale. La solubilité à saturation du CAB a également été mesurée dans les milieux de libération (PBS avec 2 % de Solutol) pour garantir des conditions de puits (inférieures à 1/5 de la solubilité maximale52) lors des études de libération in vitro (tableau supplémentaire 1). L'ajout de Solutol dans les milieux de libération a montré qu'il augmentait la solubilité des médicaments hydrophobes dans les milieux de libération garantissant que les conditions de puits sont maintenues tout au long des études de libération in vitro20. La solubilité à saturation du CAB a augmenté de 4,3 fois avec l'ajout de 2 % de Solutol dans du PBS par rapport au PBS seul.

Pour déterminer la solubilité à saturation du CAB dans les solvants suivants indiqués dans le tableau supplémentaire 1, 100 mg de CAB ont été pesés dans des flacons individuels et 100 mg de chaque solvant respectif ont été ajoutés. Le mélange est agité à 37°C pendant 24h. Les échantillons ont été centrifugés pendant 30 min à 16 000 × g (Eppendorf Centrifuge 5415R, USA) pour éliminer l'excès de médicament non dissous. Des aliquotes d'échantillon (n = 3) ont été prélevées du surnageant saturé et diluées avec de l'ACN20. La concentration de médicament dans les aliquotes saturées a été déterminée par analyse HPLC.

50:50 poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) (poids moléculaire de 27 kDa ou 10 kDa) a été mélangé avec un rapport pondéral de 1:1 (p/p) NMP:DMSO à 1:2 ou 1:4 p/p dans un flacon à scintillation de 7 mL et dissous par mélange à température ambiante pour obtenir une formulation placebo homogène. Le cabotégravir (CAB ; 100-400 mg/g) a ensuite été ajouté à la solution de polymère/solvant respective et a permis de solubiliser le médicament et de produire une solution ou une suspension ISFI stable à sa charge de médicament cible. Pour assurer une dissolution complète du médicament dans la formulation placebo et l'homogénéité de la solution ou de la suspension médicamenteuse, des aliquotes d'échantillons (1 à 2 mg, n = 4) ont été prélevées à partir de la formulation médicamenteuse et dissoutes dans de l'ACN. La concentration de médicament a été quantifiée par analyse HPLC.

Pour les études in vivo, les formulations ISFI ont été préparées dans des conditions aseptiques dans une enceinte de sécurité biologique. Tous les solvants et les formulations de placebo ISFI ont été filtrés de manière stérile (filtre de seringue en nylon stérile Puradisc 13 mm, 0,2 µm ; Cat # 6786-1302). Le CAB a ensuite été ajouté à la solution de polymère/solvant filtrée stérile et solubilisé pour produire une solution ou une suspension ISFI stable à sa charge de médicament cible. Pour assurer une dissolution et une homogénéité complètes du médicament, des aliquotes d'échantillons (1 à 2 mg, n = 3) ont été prélevées à partir de la formulation du médicament et dissoutes dans de l'ACN et la concentration du médicament a été quantifiée par analyse HPLC.

Les microstructures des implants ont été évaluées par microscopie électronique à balayage (MEB) comme décrit précédemment20,30. En bref, pour évaluer la microstructure des ISFI in vitro, 30 ± 3 mg de solution ou de suspension ISFI ont été injectés dans 200 ml de PBS 0, 01 M, pH 7, 4 avec 2% de Solutol à 37 ° C. À des moments prédéterminés (3, 30 et 90 jours après l'incubation), les implants ont été retirés de la solution de bain, congelés instantanément et lyophilisés pendant 48 h (FreeZone Benchtop Freeze Dryer, Labconco, Kansas City, MO) . La préparation des échantillons d'ISFI pour l'imagerie SEM avant le jour 3 n'a pas été possible en raison de la distorsion de l'implant probablement causée par une inversion de phase incomplète et un échange de solvant20,27,53. Après lyophilisation, tous les dépôts ont été coupés en deux pour exposer la coupe transversale pour l'imagerie. Les échantillons lyophilisés ont ensuite été montés sur un talon en aluminium à l'aide d'un ruban de carbone et recouverts par pulvérisation de 9 nm d'alliage or-palladium (60:40) (Hummer X Sputter Coater, Anatech USA, Union City, CA). Les échantillons revêtus ont ensuite été imagés à l'aide d'un microscope électronique à balayage à émission de champ Zeiss Supra 25 avec une tension d'accélération de 5 kV, une ouverture de 30 µm et une distance de travail moyenne de 10 mm (Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, NY). Les ISFI qui ont subi une imagerie / analyse SEM à rayons X à dispersion d'énergie (EDX) ont été montés sur des talons en aluminium à l'aide d'un ruban de carbone et recouverts par pulvérisation de 3 nm de revêtement conducteur en or. Les échantillons revêtus ont ensuite été imagés à l'aide d'un microscope électronique à balayage à émission de champ Hitachi S-4700 à une tension d'accélération de 20 kV, un courant de faisceau de 10 µA et une distance de travail moyenne de 12 nm. L'analyse EDX a été réalisée sur Oxford INCA PentaFet-X3 fixé au microscope à une tension d'accélération de 20 kV.

Des études de libération in vitro ont été réalisées de la même manière que celles décrites précédemment20. En bref, la cinétique de libération de médicament in vitro des ISFI CAB a été étudiée en injectant la solution ou la suspension de polymère chargée de médicament (30 ± 3 mg) dans 200 ml de milieu de libération (0,01 M PBS pH 7,4 avec 2% de Solutol) et en incubant sous évier conditions à 37 °C. L'ajout de Solutol augmente la solubilité du CAB dans le milieu de libération, garantissant ainsi le maintien des conditions de puits52. La solubilité à saturation du CAB a augmenté de 4,3 fois dans du PBS avec 2 % de Solutol par rapport au PBS seul. Les conditions de puits ont été définies comme la concentration maximale de CAB dans du PBS, le Solutol à 2 % étant inférieur à 1/5 fois la solution de saturation52. Le milieu de libération a été complètement retiré et remplacé par du milieu frais chaque semaine pour maintenir les conditions de l'évier. Des aliquotes d'échantillon (1 ml) ont été prélevées quotidiennement pendant une semaine et une fois par semaine par la suite. La concentration de médicament dans le milieu de libération a été déterminée par HPLC. La libération cumulative de médicament a été calculée à partir de l'analyse HPLC et a été normalisée par la masse totale de médicament dans l'implant. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Des études de stabilité ISFI ont été réalisées de la même manière que celles décrites précédemment20. Les formulations CAB ISFI ont été stockées à 4 ° C ou dans une chambre en verre à 40 ° C / 75% d'humidité relative (HR) dans un incubateur Fisher Scientific Isotemp (Pittsburgh, PA). La chambre en verre où les flacons de formulation étaient contenus comprenait une solution aqueuse saline saturée de chlorure de sodium pour atteindre une humidité relative de 75 % à 40 °C54. Un capteur d'humidité a été inclus dans la chambre en verre pour vérifier une humidité relative de 75 %. Les formulations ont été retirées 30 et 90 jours après l'incubation et des aliquotes d'échantillons (1 à 2 mg, n = 4) ont été prélevées et analysées par HPLC pour évaluer la teneur en médicament et la possible dégradation du médicament. Les formulations ont également été inspectées visuellement pour tout changement dans leur état physique (c'est-à-dire la couleur et la viscosité). Une étude de libération in vitro après stockage a été réalisée si la formulation présentait une stabilité physique (c.-à-d. aucune décoloration, séparation de phase ou précipitation), une teneur en médicament similaire au témoin au temps 0 (différence <10 %) et une suspension homogène.

La GPC a été réalisée comme décrit précédemment30. En bref, la GPC a été utilisée pour évaluer la dégradation des polymères des ISFI placebo après stockage ainsi que la dégradation des polymères dans les ISFI CAB qui ont été récupérés 30, 60 et 90 jours après l'injection de souris BALB/c. L'analyse GPC des ISFI placebo, des ISFI CAB et du polymère pur a été réalisée sur Tosoh Biosciences EcoSEC Elite HLC-8420 équipé d'une colonne TSKgel GMH-M. Les dimensions de la colonne sont de 7,8 mm × 30 cm avec une taille de pores de 5 microns. Le tétrahydrofurane a été utilisé comme phase mobile à un débit de 0,5 mL/min. Le poids moléculaire a été rapporté par rapport aux normes de polystyrène et analysé par détection de l'indice de réfraction (IR).

Une étude in vivo de 30 jours a été réalisée pour évaluer l'inflammation systémique et locale des ISFI CAB chez des souris BALB/c femelles (8 à 10 semaines, Jackson Laboratory). Toutes les expériences ont été réalisées avec un protocole approuvé par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Caroline du Nord. Les conditions d'hébergement des souris comprenaient un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 ​​h à une température ambiante de 68 à 72 ° Fahrenheit avec une humidité de 30 à 70 %. Les souris ont reçu une injection sous-cutanée de 50 µL de la formulation CAB ISFI avec une aiguille 19 G (n = 9 souris). Deux souris n'ont pas reçu d'injection et ont été utilisées comme contrôle. Aux jours 3, 7 et 30 après l'administration, les souris ont été sacrifiées (n = 3 / point de temps pour les groupes de traitement CAB ISFI et n = 1 souris témoin au jour 3 et 30 qui n'ont reçu aucun traitement ou injection) et des échantillons de sang par ponction cardiaque ont été prélevés dans des tubes capillaires et stockés à -80 ° C pour quantifier les cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et l'interleukine-6 ​​(IL-6) par dosage immuno-enzymatique (ELISA, MAX ™ Ensembles de luxe, BioLegend®). L'ISFI a été récolté pour l'histologie en excisant circonférentiellement le dépôt et en entourant 1 cm de peau avec de la graisse sous-cutanée sous-jacente et en plaçant l'ensemble du spécimen à plat sur du papier cartonné pour fixer le tissu à plat. L'échantillon a été placé dans du formol tamponné neutre à 10 % dans un rapport de 1:10 tissu : fixateur à température ambiante pendant 72 h, puis transféré dans de l'éthanol à 70 % à température ambiante jusqu'à ce que l'échantillon grossisse. Les échantillons de peau fixés ont été sectionnés par le milieu avec le dépôt orienté au centre et la peau coupée a été intégrée sur le bord dans des blocs de paraffine. Les échantillons ont été sectionnés à 4 µm et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine à l'aide de l'autostainer XL de Leica Biosystems. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline (Richard-Allen Scientific, 7211) pendant 2 min et de l'éosine -Y (Richard-Allen Scientific, 7111) pendant 1 min. Les solutions Clarifier 2 (7402) et Blueing (7111) de Richard-Allen Scientific ont été utilisées pour différencier la réaction. L'inflammation a été notée par un pathologiste vétérinaire certifié par le conseil, comme suit : 0 : cellules inflammatoires présentes dans les limites attendues ; 1 : inflammation minimale, présence de quelques cellules immunitaires dispersées et augmentées ; 2 : inflammation légère, petits amas de cellules immunitaires à traces fines ou localisées d'inflammation ou légère augmentation du nombre de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 3, traces modérées, plus épaisses ou multiples d'inflammation ou nombre modéré de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 4, pistes d'inflammation coalescentes sévères suffisamment grandes pour remplacer l'architecture tissulaire normale ou un nombre important de cellules entourant de manière diffuse le dépôt ; 5, marquée, inflammation présente qui remplace de vastes zones de l'architecture tissulaire normale. L'inflammation locale et systémique des groupes de traitement a été comparée au groupe témoin sans injection.

Une étude in vivo de 90 jours a été menée pour évaluer la pharmacocinétique in vivo des ISFI CAB chez des souris BALB/c femelles (8 à 10 semaines, Jackson Laboratory). Toutes les expériences impliquant des souris ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Caroline du Nord. Les conditions d'hébergement des souris comprenaient un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 ​​h à une température ambiante de 68 à 72 ° Fahrenheit avec une humidité de 30 à 70 %. Les souris ont reçu une injection sous-cutanée de 50 µL de la formulation CAB ISFI avec une aiguille 19 G (n = 6 souris). À 1 h, 1 jour, 3 jours, 7 jours, 30 jours, 60 jours et 90 jours, du sang périphérique a été prélevé sur des souris dans des tubes capillaires recouverts d'EDTA pour isoler le plasma. Tous les échantillons ont été stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse PK. Le CAB a été extrait du plasma de souris par une extraction liquide-liquide suivie d'une analyse par LC-MS/MS. En bref, 25 μL de plasma de souris ont été mélangés avec 40 μL d'eau: méthanol 80:20 contenant le 13C, 2H2, 15N-CAB stable et marqué isotopiquement et 300 μL d'acétate d'éthyle. Après mélange et centrifugation, la couche organique a été retirée et évaporée à sec. Les extraits ont été reconstitués avec 75 μL d'eau à 75:25 avec 0,1 % d'acide formique : acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique avant l'analyse LC-MS/MS. La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne analytique Waters XTerra MS C18 (50 × 2,1 mm, granulométrie 3,5 μm) dans des conditions de gradient avec détection sur un spectromètre de masse triple quadruple AB Sciex API-5000. La plage d'étalonnage pour le test était de 25 à 50 000 ng/mL. Les étalons d'étalonnage et les échantillons de contrôle qualité se situaient à moins de 15 % des concentrations nominales.

Pour évaluer la capacité à retirer en toute sécurité un ISFI après l'administration en cas d'événements indésirables, des ISFI CAB ont été injectés par voie sous-cutanée (50 µL) à des souris femelles BALB/c (8 à 10 semaines, Jackson Laboratory) (n = 18) et les ISFI ont été retirés. au jour 30 (n = 6), 60 (n = 6) et 90 (n = 6). Toutes les expériences impliquant des souris ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Caroline du Nord. Les conditions d'hébergement des souris comprenaient un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 ​​h à une température ambiante de 68 à 72 ° Fahrenheit avec une humidité de 30 à 70 %. Les souris ont été euthanasiées et les ISFI ont été retirés en faisant une petite incision adjacente au site d'injection à 30 (n = 6), 60 (n = 6) et 90 jours (n = 6) après l'administration. Les ISFI extraits aux jours 30, 60 et 90 ont été traités plus avant pour évaluer la perte de masse, la diminution du poids moléculaire du polymère par analyse GPC (n = 3/timepoint) et pour quantifier le médicament résiduel (n = 3/timepoint). Pour quantifier la concentration résiduelle de médicament, l'excès de tissu a été soigneusement retiré des implants. Les implants ont été placés dans l'ACN pour faciliter l'extraction du médicament et la concentration résiduelle du médicament a été quantifiée par analyse HPLC.

Nous avons utilisé des hydrogels de polyacrylamide pour évaluer l'injectabilité CAB ISFI à un volume d'injection similaire administré à des primates non humains (1 ml). La préparation d'hydrogels de polyacrylamide (40 ml) a été adaptée à partir de protocoles rapportés précédemment36,37. En bref, un hydrogel de 40 ml a été préparé en combinant 40 % en poids de solution aqueuse d'acrylamide (16 ml), 2 % en poids de solution aqueuse de bis-acrylamide (2 ml) et 22 ml de PBS 0,01 M pH 7,4. Le mélange a été refroidi à 4 ° C, et 10 % en poids d'APS (2 mL) et 200 µL de TEMED ont ensuite été ajoutés et placés à 4 ° C pendant la nuit pour permettre la polymérisation de la solution. 1 mL de formulation placebo ISFI ou CAB ISFI a été injecté dans l'hydrogel avec une aiguille 16, 18 ou 19 G pour évaluer l'injectabilité.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux des Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Les macaques ont été hébergés au CDC sous la garde de vétérinaires du CDC conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser l'inconfort, notamment en fournissant des conditions de logement appropriées, des compléments alimentaires et de nombreuses possibilités d'enrichissement.

Des macaques rhésus femelles ont reçu des injections sous-cutanées de CAB ISFI (500 mg/mL) à deux endroits différents dans le haut du dos (0,5 à 1 mL par site). Brièvement, des animaux anesthésiés ont été placés en décubitus ventral et la suspension semi-aqueuse d'ISFI chargée dans une seringue de 3 cc a été administrée dans l'espace sous-cutané à l'aide d'une aiguille de 16 G. Une pression digitale a été brièvement appliquée sur le site d'administration après le retrait de l'aiguille.

Pour évaluer la faisabilité du retrait de l'implant et mesurer la queue de médicament, les ISFI qui sont restés palpables ont été extraits chirurgicalement de deux macaques à la semaine 12 (RA-1097 et RA-1093 ; 2 implants chacun) et d'un animal à la semaine 14 (RH- 42012 ; 1 implant récupéré). Les animaux ont été placés en décubitus ventral et les emplacements des implants ont été confirmés par palpation digitale. Un scalpel chirurgical a été utilisé pour faire une seule incision cutanée (~ 1 po) sur chaque implant. Le matériau ISFI a été soigneusement séparé du tissu conjonctif environnant et récupéré presque intact à l'aide d'une pince à épiler. Le site d'incision a été inspecté visuellement à la recherche d'anomalies, puis rincé avec une solution saline stérile avant d'être fermé avec des sutures de polydioxanone. Les animaux ont été surveillés chaque semaine par des vétérinaires traitants pour évaluer les sites chirurgicaux pour une bonne cicatrisation des plaies et pour s'assurer qu'il n'y avait aucun signe d'infection locale.

Pour l'évaluation pharmacocinétique longitudinale, six macaques rhésus femelles ont reçu des ISFI CAB suivis de mesures du niveau de médicament dans le plasma sanguin et les tissus rectaux et vaginaux. Cinq des animaux ont reçu deux injections de 1 ml (total de 1000 mg de CAB) et un animal (RH-1080) a reçu des volumes d'injection de 1 et 0,5 ml (total de 750 mg de CAB). Les taux de CAB ont été mesurés chaque semaine dans le plasma jusqu'à 11 mois et dans les tissus aux semaines 4, 8 et 12 à l'aide d'une méthode LC-MS validée, comme décrit précédemment55. Des biopsies rectales et vaginales ont été prélevées sur des macaques RH-42012, RA-1048 et RA-1080 aux semaines 4, 8 et 12. La limite inférieure de quantification était de 1 ng/mg et 10 ng/mL pour la biopsie et le plasma, respectivement .

Nous avons utilisé un modèle de provocation rectale SHIV162P3 à exposition répétée qui a prédit l'efficacité clinique de tous les régimes de PrEP actuellement approuvés56. SHIV162P3 a été obtenu auprès du NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARP-6526) et développé dans des PBMC de macaque rhésus. Le stock de provocation final a été dilué à 10 TCID50 et stocké individuellement sous forme d'aliquotes de 1 ml dans de l'azote liquide et décongelé avant chaque provocation rectale. Dans ce modèle, des macaques rhésus témoins non traités exposés à 10 TCID50 de SHIV162p3 sont infectés après une médiane de deux provocations56,57. Six macaques rhésus femelles ont été utilisées dans l'étude (10 ans ; 7 à 11 kg). Quatre ont été implantés avec des ISFI CAB et ont été exposés par voie rectale à SHIV162p3 deux fois par semaine pendant les périodes où les concentrations de CAB étaient supérieures à l'IC90 ajusté aux protéines quatre fois (4 × PA-IC90). Parmi ceux-ci, deux ont été testés entre les semaines 4 et 8 après l'implantation pour un total de huit tests SHIV chacun. Les dépôts CAB ISFI ont été retirés chirurgicalement des deux animaux à la semaine 12 pour mesurer la queue de médicament et surveillés pour l'infection par SHIV pendant la période de sevrage médicamenteux. Les deux animaux restants ont été provoqués deux fois par semaine entre les semaines 14 à 18 ; l'un de ces animaux (RH-1048) a reçu six provocations supplémentaires entre les semaines 25 et 28. Le résultat de l'infection des animaux traités par CAB dans chaque groupe a été comparé à deux animaux non traités provoqués simultanément avec le même stock et la même dose de SHIV162p3. Du sang a été prélevé chaque semaine pendant les défis et la phase de suivi pour les tests de diagnostic. L'ARN du SHIV dans le plasma a été quantifié par un test RT-PCR avec une sensibilité de 50 copies d'ARN/ml. Les réponses sérologiques spécifiques au virus ont été mesurées à l'aide d'un dosage immunoenzymatique de peptides synthétiques (BioRad, Genetic Systems HIV-1/HIV-2, Redmond, WA)56. Les animaux étaient considérés comme protégés s'ils étaient séronégatifs et ARN viral négatif pendant les provocations SHIV et une période de suivi de 16 semaines.

Des contrôles de bien-être hebdomadaires ont été effectués chaque semaine pour évaluer la sécurité et la tolérabilité des implants CAB ISFI. Les examens physiques comprenaient la surveillance du poids des animaux, leur état de santé général et une inspection approfondie de la zone entourant les implants à la recherche de réactions cutanées visibles (Fig. 8 supplémentaire). L'érythème et l'œdème ont été évalués visuellement sur l'échelle de Draize et évalués de 0 (aucune réaction) à 4 (réaction sévère)58.

Lors du retrait de l'implant, deux biopsies dermiques chirurgicales à l'emporte-pièce de 3 mm ont été prélevées au niveau de la face médiane et crânienne de l'emplacement de l'implant pour mesurer les niveaux de médicament et pour l'évaluation histologique. Une biopsie a été pesée et congelée pour le dosage du médicament et l'autre fixée dans du formol à 10 % pour l'examen histologique. Les biopsies stockées dans du formol ont été coupées en deux, incluses, sectionnées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E). Les sections ont été évaluées pour le type et l'intensité de l'inflammation, ainsi que l'abondance de la fibrose et la présence de nécrose. Les sections ont été réalisées en aveugle et évaluées indépendamment par deux pathologistes vétérinaires. Nous avons utilisé un score semi-quantitatif basé sur les directives ISO (ISO 10993-6:2007) pour les cellules inflammatoires, y compris les neutrophiles, les lymphocytes, les plasmocytes, les macrophages, les éosinophiles et les fibroblastes réactifs dans le derme et les tissus sous-cutanés et les fibroblastes. La distribution et la gravité de l'infiltration par chaque type de cellule ont été notées sur une échelle de 0 à 5, 0 représentant l'absence de cellules présentes et 5 représentant une infiltration importante par le type de cellule spécifique.

Chaque implant (gauche et droit) a été extrait du tissu puis placé en ACN dans un environnement stérile BSL2+. L'échantillon a ensuite été retiré de l'environnement stérile et placé sur un incubateur à agitation. Des aliquotes d'échantillon (1 ml, n = 3) de la solution d'extraction ont été collectées et analysées par HPLC.

Pour étayer l'estimation des taux d'entrée de CAB ISFI chez les macaques, les taux de clairance individuels de CAB ont été estimés par NCA à l'aide de la règle trapézoïdale linéaire vers le haut et vers le bas dans Phoenix WinNonlin v8.3 pour 4 animaux avec des concentrations plasmatiques recueillies sur 98 à 329 jours après l'administration de l'ISFI ( Fig. 9 supplémentaire). Cette estimation n'a pas pu être effectuée pour les 2 animaux (RH-1093 et ​​RH-1097) dont les implants ont été retirés 84 jours après l'administration. Par conséquent, AUCINF a été dérivé sur la base de l'équation \(f=\left(\right.{C}_{{last}}+\left({kel}*{{AUC}}_{{last}}\right) /({kel}*{{AUC}}_{{INF}})\)59 où f est la fraction de dose absorbée (c.-à-d. masse chargée - masse résiduelle) et kel a été fixé à 0,173 h-1 sur la base des données rapportée dans la demande de nouveau médicament39. La clairance a ensuite été calculée par \({Cl}=({Dose}*F)/({{AUC}}_{{INF}})\). Tous les calculs supposaient la biodisponibilité (F) via la voie d'administration SQ était de 100 %, ce qui est cohérent avec les hypothèses utilisées pour les modèles pharmacocinétiques de population rapportés de l'injection IM LA CAB39.

Pour étayer la comparaison des taux d'entrée de CAB ISFI et de CAB LA chez les macaques, le logiciel Quintessa Graph Grabber v2.0.2 a été utilisé pour extraire les données PK d'un graphique publié de la concentration en fonction du temps de 9 macaques ayant reçu deux injections IM de 50 mg/kg de CAB LA pendant 6 jours. à part38. Le NCA a été utilisé comme ci-dessus pour estimer la clairance des animaux individuels en supposant un poids de 8 kg.

Les analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism version 9.4 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Pour analyser les différences dans les profils de libération de CAB in vitro lors de la variation de la charge de médicament et du poids moléculaire du PLGA, un test ANOVA à deux voies et un test de comparaisons multiples de Tukey ont été effectués en ce qui concerne le point temporel et la formulation. Pour analyser les différences dans les profils de libération de CAB in vitro après stockage par rapport à la ligne de base, un test ANOVA à deux voies et un test de comparaisons multiples de Tukey ont été effectués en ce qui concerne le point temporel et les conditions de stockage. Un test ANOVA à deux voies et un test de comparaisons multiples de Sidak ont ​​été effectués en ce qui concerne le point temporel et les concentrations de TNF-α et d'IL-6 dans le plasma pour analyser les différences d'inflammation systémique in vivo avec le groupe témoin sans injection. Pour tous les tests statistiques, une valeur P <0,05 était considérée comme significative (niveau de confiance de 95 %).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec cet article sous-jacent aux Fig. 1a–c, 2a, c, 3e, 7b–d ainsi qu'aux Fig. 1a–c supplémentaires et 2a, b. Toutes les autres données sont fournies dans le document. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses (numéros de subvention R01AI131430 à SRB et MK, R01AI162246 à SRB, R01AI140799 à JVG), National Center for Advancing Translational Science (numéro de subvention KL2TR001109-04 à SRB), University of North Carolina au Chapel Hill Center for AIDS Research (P30 AI050410) et National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (numéro de subvention DGE-1650116 à ICY). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Les résultats et les conclusions de ce manuscrit sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des Centers for Disease Control and Prevention. Nous tenons à remercier l'UNC Animal Studies Core (ASC) pour son aide dans les injections ISFI de souris, l'UNC Clinical Pharmacology and Analytical Chemistry Core (CPAC), en particulier Lauren Tompkins et Brian Van Horne, et Chapel Hill Analytical and Nanofabrication Laboratory (CHANL ) pour avoir aidé à l'analyse SEM EDX, en particulier Amar Kumbhar.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Isabella C. Young, Ivana Massud.

Ces auteurs ont dirigé conjointement ce travail : Gerardo Garcίa-Lerma, S. Rahima Benhabbour.

Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Isabella C. Young et S. Rahima Benhabbour

Direction des laboratoires, Division de la prévention du VIH, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, États-Unis

Ivana Massud, Andrew Wong-Sam, Chuong Dinh, Tiancheng Edwards, James Mitchell, Walid Heneine, Charles W. Dobard et J. Gerardo Garca-Lerma

Division de pharmacothérapie et de thérapeutique expérimentale, Eshelman School of Pharmacy, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Mackenzie L. Cottrell, Amanda Schauer, Craig Sykes et Angela DM Kashuba

Département conjoint de génie biomédical, Université d'État de Caroline du Nord et Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Roopali Shrivastava, Panita Maturavongsadit, Alka Prasher, Allison Thorson & S. Rahima Benhabbour

Branche de médecine comparée, Division des ressources scientifiques, National Center for Emerging and Zoonotic Infection Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, États-Unis

victoria martz

Branche de pathologie des maladies infectieuses, Division des pathogènes et pathologies à conséquences élevées, Centre national des maladies infectieuses émergentes et zoonotiques, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, États-Unis

Josilène Nascimento Seixas

Département de psychologie et de neurosciences, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Aryani Pallerla

Pathology Services Core, Lineberger Comprehensive Cancer Center, École de médecine de l'Université de Caroline du Nord, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Gabriela De la Cruz et Stéphanie A. Montgomery

Centre international pour l'avancement des sciences translationnelles, Division des maladies infectieuses, Centre de recherche sur le sida, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Martina Kovarova & J.Victor Garcia

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Conceptualisation : SRB, JGG-L., IM, CWD, JVG, MK Méthodologie : JGG-L., SRB, IM, ICY, CWD, PM, AP, MLC, SAM, GDCEnquête : ICY, IM, CWD, PM, AP , RS, AW-S., CS, JM, AT, AP, AS, CD, MLC, SRB, JGG-L. Visualisation : ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L,. TE, VM, JNS Financement acquisition : SRB, JGG-L., JVG, MK Administration du projet : SRB, JGG-L., JVG, MK, ADMK, WH Supervision : SRB, JGG-L., JVG, ADMK Rédaction – original brouillon : ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., MLC, CS, SAM, Rédaction – révision et édition : ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., JVG, MK, WH

Correspondance à J. Gerardo Garcίa-Lerma ou S. Rahima Benhabbour.

SRB, ICY, RS et PM sont les inventeurs d'un brevet décrivant la formulation de médicament à base de polymère injectable pour l'administration de médicaments à action ultra-longue. JGG-L. et WH sont nommés aux États-Unis. Brevets gouvernementaux sur "l'inhibition de l'infection par le VIH par la chimioprophylaxie". JGG-L.,. IM et WH sont nommés aux États-Unis. Brevet gouvernemental sur la "prophylaxie post-exposition au VIH" et un US. Demande de brevet du gouvernement sur la "prophylaxie pré-exposition au VIH". Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Cristian Apetrei et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Young, IC, Massud, I., Cottrell, ML et al. Les implants de formation in situ à action ultra-longue avec cabotégravir protègent les macaques femelles contre l'infection rectale par le SHIV. Nat Commun 14, 708 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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Reçu : 16 septembre 2022

Accepté : 24 janvier 2023

Publié: 09 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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