Détection rapide du SRAS

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering volume 6, pages 944–956 (2022)Citer cet article

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Les tests rapides d'acide nucléique sont au cœur de la surveillance des maladies infectieuses. Ici, nous rapportons un essai pour le test COVID-19 rapide et sa mise en œuvre dans un prototype de dispositif microfluidique. Le test, que nous avons nommé DISCoVER (pour les diagnostics avec rapport enzymatique de coronavirus), implique une lyse d'échantillon sans extraction via des réactifs de longue conservation et à faible coût, une amplification d'ARN isotherme multiplexée suivie d'une transcription T7 et un clivage médié par Cas13 d'un fluorophore désactivé . Le dispositif consiste en une cartouche microfluidique à usage unique insérée dans un instrument compact pour l'exécution automatisée du test et la lecture de la fluorescence en 60 min. DISCoVER peut détecter le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) dans la salive avec une sensibilité de 40 copies μl–1, et était sensible à 94 % et spécifique à 100 % lorsqu'il a été validé (contre PCR quantitative) en utilisant l'ARN total extrait de 63 échantillons d'écouvillonnage nasal (33 positifs pour le SRAS-CoV-2, avec des valeurs de seuil de cycle de 13 à 35). L'appareil a correctement identifié tous les échantillons de salive cliniques testés (10 positifs au SRAS-CoV-2 sur 13, avec des valeurs de seuil de cycle de 23 à 31). Les tests rapides d'acide nucléique au point de service peuvent élargir l'utilisation des diagnostics moléculaires.

La détection rapide des acides nucléiques au point de service est un élément essentiel d'une infrastructure de test robuste pour contrôler la transmission des maladies. Des épidémies telles que la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) ont mis en évidence les limites du modèle de laboratoire de diagnostic centralisé et son long délai entre l'échantillon et la réponse. Des tests développés en laboratoire tels que la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) sont effectués dans des installations qui nécessitent une infrastructure de personnel et d'équipement à forte intensité de main-d'œuvre pour l'acquisition d'échantillons, l'extraction d'acide nucléique, le thermocyclage et l'analyse de données. Le transport des échantillons et le temps de rapport des résultats contribuent également grandement aux délais d'exécution des tests centralisés. Le développement d'un dispositif microfluidique facile à utiliser associé à une détection sur site permettrait d'augmenter le volume et l'accès aux tests moléculaires rapides.

Jusqu'à présent, plus de 6 millions de décès dus au COVID-19 ont résulté de plus de 500 millions d'infections par son agent causal, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Les innombrables défis d'un taux d'infection asymptomatique élevé1, de tests insuffisants et de la fenêtre de temps étroite pour que les tests moléculaires soient très sensibles2,3 peuvent être combattus par un large déploiement de diagnostics moléculaires sur site, comme à l'entrée sur le lieu de travail ou en classe. Il existe également un énorme potentiel pour les tests de surveillance communautaire pour augmenter les flux de travail cliniques, où les cas positifs sont confirmés en référant à un approvisionnement plus restreint de tests de qualité clinique. Des méthodes d'échantillonnage et des technologies de test alternatives peuvent également aider à diversifier la chaîne d'approvisionnement de diagnostic, car le pipeline standard pour les tests cliniques peut être limité par des kits d'extraction d'ARN ou des pénuries d'écouvillons4,5.

Nous avons donc cherché à développer une méthode qui ne nécessite pas d'extraction d'ARN ou d'écouvillons des voies respiratoires supérieures et qui pourrait être intégrée dans un flux de travail microfluidique rapide et automatisé. Les tests basés sur la qPCR ont déjà été développés avec un pic direct d'échantillon et utilisent généralement une température élevée pour la lyse de l'échantillon6. D'autres approches ont exploité les agents chaotropes, la réduction chimique et les inhibiteurs de RNase6,7,8,9. De plus, les échantillons de salive auraient une concordance de 97 % avec les écouvillons nasopharyngés (NP)10,11.

La détection basée sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) est une nouvelle approche prometteuse pour le diagnostic des acides nucléiques. Ces méthodes reposent sur l'activation dépendante de l'ARN guide des nucléases Cas13 ou Cas12 pour induire une activité d'ARN simple brin non spécifique ou d'ADN nucléase simple brin, respectivement, afin de cliver et de libérer une molécule reporter en cage12,13,14, 15,16,17,18,19. Le rapporteur libéré peut être mesuré quantitativement avec un détecteur de fluorescence pour lire le résultat du test. La détection basée sur CRISPR est très spécifique, mais les nucléases Cas13 seules peuvent prendre jusqu'à 2 h pour atteindre la sensibilité attomolaire pour les applications de diagnostic20,21. En revanche, l'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) effectue une amplification d'acide nucléique très sensible en moins de 20 min avec des limites attomolaires de détection20 (LOD). Cependant, malgré la sensibilité et la rapidité de LAMP, ces méthodes isothermes sont souvent sujettes à une amplification non spécifique22,23.

Dans cet article, pour relever ces défis, nous rapportons DISCoVER (pour les diagnostics avec rapport enzymatique du coronavirus), un test sans extraction d'ARN qui combine deux mécanismes d'amplification distincts pour la sensibilité avec une sonde médiée par Cas13 pour la spécificité (Fig. 1). Après la lyse directe et l'inactivation des échantillons de salive par dénaturation et réduction, l'amplification LAMP est suivie d'une transcription T7 pour fournir deux couches d'amplification cible. Pour démontrer le test viral CRISPR dans un format échantillon-réponse, nous avons intégré le flux de travail DISCoVER dans un système microfluidique avec un lecteur de fluorescence compact pour une détection en temps réel. Dans une preuve de concept au point de service, l'inactivation de l'échantillon et l'amplification et la détection ultérieures avec cet appareil peuvent être empilées de sorte que le temps d'inactivation ne limite pas le débit dans le flux de travail (Fig. 1 supplémentaire).

Les échantillons de patients, tels que la salive, sont collectés et inactivés par la chaleur dans un tampon de lyse directe, suivis d'un chargement sur une cartouche microfluidique à usage unique, entraînée par gravité. L'étape d'inactivation varie de 5 à 20 min selon les réglementations institutionnelles37. La cartouche est ensuite insérée dans un instrument compagnon qui exécute automatiquement le test DISCoVER dans un système fermé pour minimiser la contamination de la réaction. À l'étape 1, une réaction rLAMP initiale utilise deux mécanismes pour l'amplification des acides nucléiques cibles. RFU, unités de fluorescence relative. Les enzymes Cas13 sont programmées avec un ARN guide pour reconnaître spécifiquement les molécules d'ARN souhaitées par rapport aux produits amplifiés de manière non spécifique. L'activation ultérieure de l'activité de la ribonucléase Cas13, à l'étape 2, entraîne le clivage des molécules rapporteurs pour les signaux saturés dans les 5 minutes suivant la détection CRISPR. Y compris le temps d'actionnement de l'appareil, le temps de lecture dans un système finalisé est de 48 min. Dans la moitié gauche de la cartouche, des ARN guides ciblant le SRAS-CoV-2 permettent une détection rapide et sélective des concentrations attomolaires de virus. La moitié miroir de la cartouche est utilisée pour un contrôle de processus interne, permettant un résultat de test négatif en garantissant la présence d'échantillons de patients adéquats. En exploitant le changement de modèle et la programmabilité CRISPR, le système DISCoVER au point de service peut contribuer à une surveillance accrue de divers agents pathogènes.

DISCoVER intègre une étape d'amplification de 30 minutes suivie d'une lecture Cas13 de 5 minutes et atteint une sensibilité attomolaire sur des échantillons de salive non extraits. Nous multiplexons également l'amplification avec un contrôle de processus basé sur la détection d'un gène humain de référence pour confirmer la présence d'un matériel cellulaire suffisant dans l'échantillon. Nous avons validé DISCoVER sur une matrice d'échantillons à base de salive contenant le virus SARS-CoV-2 vivant et l'ARN total extrait d'écouvillons nasaux de patients avec des valeurs de seuil de cycle (Ct) allant de 15 à 35. Nous avons observé une valeur prédictive positive (PPV) de 100 % et une valeur prédictive négative (VPN) de 93,75 % pour le test DISCoVER par rapport à la qPCR. Des échantillons de salive positifs artificiels ont été dosés de bout en bout sur un dispositif microfluidique avec détection de fluorescence en temps réel intégrée comme preuve de concept pour la détection automatisée. Un contrôle de processus embarqué a été utilisé pour permettre la discrimination entre les résultats de test positifs, négatifs et invalides. Pour valider davantage la robustesse du système microfluidique automatisé, des échantillons de salive artificiels ont été analysés et ont indiqué une sensibilité attomolaire. Enfin, des échantillons cliniques naturels prélevés sur le terrain ont été analysés sur l'appareil pour démontrer la capacité du test à différencier les échantillons positifs et négatifs de patients réels. Dans l'ensemble, le système DISCoVER permet une détection virale portable, rapide et sensible pour la surveillance des agents pathogènes.

Nous avons d'abord cherché à comparer les propriétés de détection d'acide nucléique des enzymes Cas13 et Cas12, en évaluant l'activité de clivage rapporteur de Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) et de la bactérie Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a) avec des séquences d'espaceur d'ARN guide correspondantes dans une série de dilutions de leurs synthétiques correspondants. molécules activatrices (Fig. 2a). Nous avons observé que la détection de LbuCas13a est nettement plus rapide que LbCas12a à de faibles concentrations d'activateur. À 100 pM de cette séquence d'activateur, LbuCas13a atteint la fluorescence semi-maximale plus de 30 fois plus rapidement que LbCas12a dans leurs conditions de réaction respectives (Fig. 2b et Méthodes). Cependant, la LOD de LbuCas13a est toujours dans la plage femtomolaire après 60 min (réf. 24), ce qui est déjà au-delà du temps maximal entre l'échantillon et la réponse susceptible d'être pertinent pour un test au point de service.

a, cinétique de détection de Cas13 et Cas12 à différentes concentrations d'activateur. Les régions linéaires et ombrées indiquent la moyenne ± l'écart type (sd) avec n = 3 répétitions techniques. b, temps de Cas13 et Cas12 jusqu'à la demi-fluorescence maximale. †, le temps d'obtention de la demi-fluorescence maximale était trop rapide pour une détection fiable. ††, le temps jusqu'à la demi-fluorescence maximale n'a pas pu être déterminé dans la durée d'exécution du test de 120 min. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 2 répétitions techniques. c, schéma de la séquence du génome du SRAS-CoV-2, avec les emplacements des ensembles d'amorces LAMP indiqués. d, Parcelles de fluorescence représentatives de l'amplification LAMP de 100 copies μl–1 d'ARN SARS-CoV-2 synthétique ou NTC. Les régions ombrées indiquent la moyenne ± sd avec n = 3 répétitions techniques. e, Temps jusqu'au seuil de neuf ensembles d'amorces LAMP criblés, ciblant l'ARN SARS-CoV-2 synthétique ou NTC. Les répliques qui n'ont pas été amplifiées sont représentées à 0 min. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± sd des répliques techniques amplifiées, n = 4. f, dosage LOD de LAMP en utilisant N set 1 jeu d'amorces. Les répliques qui n'ont pas été amplifiées sont représentées à 0 min. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± sd des répliques techniques amplifiées, n = 4.

Pour atteindre la sensibilité attomolaire, nous avons choisi LAMP comme méthode rentable et rapide pour l'amplification isotherme. LAMP utilise une transcriptase inverse, une ADN polymérase à déplacement de brin et trois ensembles de paires d'amorces pour convertir l'ARN viral en substrats d'ADN pour LAMP. Nous avons criblé neuf ensembles d'amorces LAMP ciblant des régions distinctes sur toute la longueur du génome du SRAS-CoV-2 (Fig. 2c et tableau supplémentaire 1)25,26,27,28. Lorsqu'ils sont ciblés sur des fragments d'ARN génomique du SRAS-CoV-2 à 100 copies μl–1, tous les ensembles ont donné des signaux LAMP positifs. La fluorescence maximale a été atteinte dans les 20 minutes pour tous les ensembles d'amorces, et le temps jusqu'au seuil a été déterminé via le mode de détermination de la quantification du cycle à seuil unique (Cq), comme indiqué (Fig. 2d). Ensembles d'amorces LAMP ciblant Orf1ab set 1, N set 1 et N set 2 amplifiés de manière cohérente en moins de 15 min (Fig. 2e).

Chaque jeu d'amorces LAMP a entraîné un signal de contrôle sans matrice (NTC), mais avec un retard par rapport à la condition positive contenant de l'ARN viral (Fig. 2d). Ce taux élevé de faux positifs, potentiellement dû à la formation de dimères d'amorces, peut en principe être réduit avec une seconde sonde qui reconnaît sélectivement la séquence d'acide nucléique amplifiée. Nous avons donc cherché à combiner la sensibilité de la détection LAMP avec la spécificité de la reconnaissance de la cible Cas13.

Pour éviter la détection de produits d'amplification non spécifiques par Cas13, les ARN guides doivent avoir un chevauchement de séquence minimal avec les séquences d'amorce. En raison de la complexité de la concatémérisation LAMP, les amorces LAMP se chevauchent fortement et amplifient les régions cibles courtes pour augmenter la vitesse de réaction24,29. Nos ensembles d'amorces LAMP ont généré des amplicons avec des séquences d'amorces non chevauchantes allant de 1 à 60 nt. N set 1, ciblant le gène SARS-CoV-2 N, a été choisi pour une utilisation ultérieure en raison de son faible délai de seuil et d'une taille d'amplicon capable d'accueillir les ARN guides Cas13 (Fig. 2e et Tableau supplémentaire 1). Nous avons ensuite effectué une série de dilutions d'ARN viral génomique et déterminé que la LOD N set 1 était de 25 copies μl–1 (Fig. 2f), comparable aux études précédentes qui rapportaient des LOD entre 10 et 100 copies μl–1 (réfs. 7, 30,31).

Comme Cas13 cible l'ARN simple brin (Fig. 2a), tandis que LAMP amplifie les substrats d'ADN, nous avons utilisé la transcription des produits LAMP pour permettre la compatibilité des substrats. Des séquences de promoteurs d'ARN polymérase T7 ont été incorporées dans les séquences d'amorces LAMP pour une transcription ultérieure et une détection de Cas13. Nous avons appelé cette « conversion de l'amplification LAMP en ARN » ou « rLAMP ». LAMP utilise trois paires d'amorces : des amorces externes avant et arrière (F3/B3) pour le déplacement initial du brin cible, des amorces internes avant et arrière (FIP/BIP) pour former la structure tige-boucle de base de LAMP, et des amorces à boucle avant et arrière (FLoop /BLoop) pour une couche supplémentaire d'amplification en boucle (Extended Data Fig. 1). Grâce à de multiples itérations de liaison et d'extension d'amorce, ces structures tige-boucle s'amplifient en concatémères composés de répétitions inversées de la séquence cible (Fig. 3a).

a, Schéma du mécanisme rLAMP pour l'amplification exponentielle de l'ADN à l'aide des amorces F3/B3 et FIP/BIP, résultant en des structures répétées inversées d'ordre supérieur. Les flèches rouges indiquent l'emplacement de la séquence du promoteur T7, insérée dans l'amorce mBIP. Lors de la transcription T7, l'ARN résultant contient une ou plusieurs copies de la séquence cible Cas13 (orange). b, Schéma de l'emplacement des différents emplacements du promoteur T7 sur la structure en haltère rLAMP et les amorces de boucle. c, temps de rLAMP jusqu'au seuil de six insertions distinctes du promoteur T7. Les répliques qui n'ont pas été amplifiées sont représentées à 0 min. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± sd des répliques techniques amplifiées, n = 4. d, dénaturation des gels PAGE des produits mBIP rLAMP pour vérifier la transcription médiée par T7. AfeI clive dans la région cible de l'ARNc des produits modélisés, ce qui devrait aboutir à une seule espèce transcrite majeure. e, Cinétique de transcription T7 et détection de Cas13 sur les produits mBIP rLAMP. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions techniques. f, détection Cas13 de huit répliques techniques de l'amplification mBIP rLAMP sur l'ARN génomique, représentée par un changement de pli par rapport à NTC à différents points finaux de réaction.

Pour permettre la transcription d'ARN après LAMP (rLAMP), nous avons systématiquement testé l'insertion de séquences promotrices T7 dans trois régions différentes des amorces LAMP : à l'extrémité 5' des amorces FIP et BIP (5' FIP/5' BIP), dans milieu des amorces FIP et BIP (mFIP/mBIP), et à l'extrémité 5' des amorces de boucle (FLoop/BLoop) (Fig. 3b). L'ajout du promoteur T7 n'a pas beaucoup affecté le temps de rLAMP jusqu'au seuil de N set 1, étant donné l'ARN génomique viral à 100 copies μl – 1 (Fig. 3c). Pour confirmer que les séquences cibles ont été spécifiquement amplifiées, nous avons effectué une digestion par enzyme de restriction sur les produits LAMP à l'aide d'AfeI, qui digère dans la région cible de l'ARN guide Cas13 au sein de l'amplicon rLAMP (Fig. 2a, b supplémentaires). L'absence de digestion AfeI dans toutes les conditions NTC a confirmé que le signal NTC résulte d'une amplification non spécifique de séquences dépourvues de la séquence cible correspondant au guide.

Pour tester si le promoteur T7 était correctement incorporé et fonctionnel dans l'amplicon rLAMP, nous avons ensuite effectué une transcription in vitro avec l'ARN polymérase T7. L'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a indiqué que la matrice virale et les conditions NTC entraînaient une transcription d'ARN pour tous les ensembles d'amorces (Fig. 3d). Comme prévu, la digestion par AfeI du produit mBIP rLAMP a produit un seul produit de 147 nt contenant le promoteur T7 (Fig. 2a supplémentaire). La transcription ultérieure de T7 a donné le produit d'ARN de 85 nt attendu (Fig. 3d).

Ensuite, nous avons optimisé les conditions de tampon de réaction pour soutenir la transcription T7 et la détection Cas13 en une seule étape, suivies d'un dépistage systématique de l'activité de clivage Cas13 en présence de produits rLAMP contenant des insertions de promoteur T7 dans différents amplicons rLAMP. Nous avons déterminé que le milieu de la position d'insertion de l'amorce BIP (mBIP) entraînait la détection la plus rapide et avons donc choisi cet ensemble d'amorces pour d'autres études (Fig. 3 supplémentaire et Tableau supplémentaire 2). Cas13 détecte rapidement l'amplicon rLAMP avec une matrice virale, tout en évitant la détection d'amplicons NTC non spécifiques, réalisant un changement de signal de plus de dix fois sur le fond NTC en moins de 2 min (Fig. 3e). La saturation du signal s'est produite dans les 5 minutes, atteignant un rapport signal sur fond de plus de 40.

Pour confirmer la réplicabilité du pipeline DISCoVER, nous avons testé la détection de Cas13 sur huit répliques de réactions mBIP rLAMP avec de l'ARN activateur inclus à une concentration de 100 copies μl–1 dans une réaction de 20 μl. Les huit répliques ont entraîné une augmentation > 25 fois supérieure du signal par rapport au NTC, qui reste stable bien au-delà du temps de détection de 5 minutes utilisé ici (Fig. 3f).

Avec un protocole d'amplification et de détection en place, nous avons ensuite optimisé le traitement des échantillons pour établir un protocole simple de chaleur associé à des réactifs chimiques pour favoriser l'inactivation virale et atténuer l'activité des nucléases dégradant l'ARN présentes dans la salive32. Nous avons dosé deux concentrations de l'agent réducteur de longue conservation Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) associé au chélateur d'ions acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (réfs. 7,8), réactifs disponibles dans le commerce tels que les tampons QuickExtract contenant des détergents et des protéinases , et DNA/RNA Shield contenant du thiocyanate de guanidine chaotropique.

Pour tester la compatibilité de ces réactifs inactivants avec rLAMP, nous avons créé des échantillons de salive simulés positifs en ajoutant les réactifs à de la salive traitée thermiquement à 75 °C (réf. 33) et en ajoutant de l'ARN génomique du SARS-CoV-2 à deux concentrations différentes : 1 000 copies µl-1 et 200 copies µl-1. En l'absence de réactifs inactivants, nous n'avons pu détecter aucun signal rLAMP, suggérant une dégradation de l'ARN dans la salive par les RNases endogènes présentes dans l'échantillon (Fig. 4a). En revanche, l'ARN génomique sans salive a été rapidement amplifié en moins de 15 min. Seule la condition de faible concentration de TCEP – EDTA protégeait l'ARN cible et préservait la sensibilité au rLAMP dans les quatre répétitions (Fig. 4a). Ce cocktail de réactifs rompt simultanément les liaisons disulfure des protéines et séquestre les cations divalents. On s'attend à ce que son activité atténue l'activité de la RNase tout en perturbant simultanément la formation de gel de mucine, réduisant la viscosité variable de la salive pour un traitement plus simple des échantillons34,35.

a, Les conditions de lyse directe de la salive ont été testées pour leur compatibilité avec le flux de travail DISCoVER. Les répliques qui n'ont pas été amplifiées sont représentées à 0 min. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± écart-type des répliques techniques amplifiées, n = 4. IA, réactif d'inactivation ; QE, QuickExtract. b, schéma de la génération artificielle d'échantillons de salive, de la quantification via RT-qPCR et de la détection via DISCoVER pour déterminer la sensibilité analytique. c, changement de pli du signal DISCoVER par rapport au NTC sur des échantillons de salive positifs pour le SRAS-CoV-2 à 5 min de détection de Cas13. Les barres d'erreur montrent la moyenne ± sd avec n = 20 répétitions biologiques. d, changement de pli du signal DISCoVER par rapport au NTC sur 30 échantillons de salive négatifs prélevés avant novembre 2019, à 5 min de détection de Cas13.

Ensuite, nous avons cherché à déterminer la sensibilité et la spécificité analytiques de DISCoVER sur des échantillons de salive (Food and Drug Administration, 2020). Pour déterminer la LOD, les stocks viraux ont été dilués en série dans du milieu et quantifiés avec qPCR avec transcription inverse (RT – qPCR) par rapport à une courbe standard générée à partir d'ARN génomique synthétique. Ces concentrations connues de virus ont été introduites dans des échantillons de salive négatifs prélevés avant novembre 2019 dans des conditions BSL3 et exécutés via le flux de travail DISCoVER (Fig. 4b). Nous avons effectué 20 répétitions DISCoVER pour une gamme de concentrations de virus, en déterminant 40 copies µl-1 de virus dans la salive directement lysée (Fig. 4c) comme étant la concentration la plus faible testée où au moins 19/20 répétitions ont été amplifiées. Pour tester la spécificité de DISCoVER, des échantillons de salive de 30 individus différents négatifs pour le SARS-CoV-2 ont été testés sans aucun faux signal positif (Fig. 4d). L'ajout de l'ARN synthétique de la grippe A H1N1 et H3N2, de la grippe B et du coronavirus humain OC43 n'a pas inhibé la détection du SRAS-CoV-2, ni entraîné une détection non spécifique, validant davantage la spécificité de ce test (Fig. 4a supplémentaire) . De plus, nous avons validé DISCoVER sur plusieurs variants préoccupants du SRAS-CoV-2, y compris le variant B.1.1.7 hautement transmissible36 (Fig. 4b supplémentaire).

Au point de service, l'inactivation et la lyse de l'échantillon seraient idéalement confirmées par un contrôle de processus interne (Fig. 5a). Ceci est particulièrement important pour le dépistage de la population basé sur la salive, car certains individus peuvent avoir des charges de gel de viscosité ou de mucine élevées dans leurs échantillons. Selon les directives de la Food and Drug Administration, un contrôle de processus interne positif est nécessaire pour déterminer si un échantillon est négatif pour le SRAS-CoV-2, tout en indiquant une collecte d'échantillon, une extraction d'acide nucléique, une configuration de test et un fonctionnement de réactif appropriés ('CDC 2019- Panneau de diagnostic RT-PCR en temps réel nCoV - Instructions d'utilisation » ; https://www.fda.gov/media/134922/download). Si le contrôle interne du processus est négatif dans un échantillon clinique, le résultat doit être considéré comme invalide, sauf si le SRAS-CoV-2 est détecté, auquel cas l'échantillon est présumé positif. Pour y parvenir, nous avons multiplexé l'amplification en ajoutant à la fois des amorces de gène N et de gène RNase P humain dans l'étape rLAMP. La détection ultérieure de Cas13 de RNase P sur des échantillons de salive a atteint la saturation en 5 minutes (Fig. 5b).

a, Schéma du multiplexage de rLAMP avec des ensembles d'amorces SARS-CoV-2 (gène N) et de contrôle interne humain (RNase P). b, signal DISCoVER d'échantillons de salive positifs au SARS-CoV-2 après rLAMP multiplexé. Les valeurs sont moyennes ± sd avec n = 3 répétitions techniques. c, changement de pli du signal DISCoVER par rapport au NTC sur 30 échantillons nasaux cliniques négatifs à 5 min de détection de Cas13. d, changement de pli du signal DISCoVER par rapport au NTC sur 33 échantillons nasaux cliniques positifs à 5 min de détection de Cas13.

Données source

Ensuite, nous avons validé DISCoVER dans l'ARN total extrait d'échantillons d'écouvillons respiratoires de patients. L'ARN restant de 30 échantillons négatifs et de 33 échantillons positifs (valeurs Ct de 13 à 35) qui avaient été précédemment testés par RT-qPCR dans un laboratoire de test CLIA37 a été utilisé comme entrée pour le test de paillasse DISCoVER. (Fig. 5c,d). Nous avons pu appeler correctement 30 échantillons négatifs sur 30 dans les 5 minutes suivant la détection de Cas13 : aucun gène N n'a été détecté dans ces échantillons, tandis que le signal RNase P a été détecté de manière robuste. Fait important, nous avons détecté le gène N dans 31 des 33 échantillons positifs dans le même laps de temps. Pour les deux échantillons faussement négatifs, la RNaseP a été détectée mais pas le gène N, ce qui suggère une différence de LOD entre les deux tests. Sur la base de l'ensemble de données d'échantillons cliniques, nous rapportons que la sensibilité de DISCoVER sur l'ARN extrait est de 93,9 % avec une spécificité de 100 %. De plus, nous observons que la VPP est de 100 %, avec une VAN de 93,75 %.

Enfin, nous avons développé un dispositif microfluidique compact et portable pour effectuer le test dans un cadre menant à des applications au point de service. La chimie a été adaptée pour fonctionner sur une cartouche microfluidique entraînée par gravité, avec des chambres de réaction et de détection à température contrôlée (Fig. 6a). L'appareil contient des pompes à déplacement d'air pour un débit fluidique contrôlé, un réchauffeur résistif pour la chambre rLAMP et un refroidisseur/réchauffeur thermoélectrique (TEC) pour le refroidissement et le chauffage de la chambre Cas13 (Fig. 6b). La détection de la fluorescence du test a été effectuée par un détecteur personnalisé compact pour la lecture des échantillons en temps réel.

a, Gauche : illustration de l'instrument final dans lequel la cartouche est insérée. L'encart montre une image de l'ensemble de la cartouche microfluidique entraînée par gravité. À droite : images de la chambre de mesure de l'échantillon et de réaction rLAMP (1), de la chambre de mesure rLAMP et de mélange Cas13 (2) et de la chambre de détection (3). b, Illustration avant (gauche) et arrière (droite) des composants de l'instrument, y compris le système de détection, les réchauffeurs, les vannes pneumatiques et les vannes mécaniques. c, Schéma de la fonction cartouche. La réaction peut être séparée en quatre étapes : dosage de la salive (1), réaction d'amplification (2), dosage post-amplification + mélange Cas13 (3) et réaction Cas13 dans les chambres de détection (4). Les réactifs stockés sur la cartouche sont séparés via une solution hydrophobe exclusive pour éviter l'initiation prématurée des réactions. Après la réaction LAMP, l'échantillon peut être divisé en deux réactions : la partie gauche de la cartouche exposera l'échantillon au gène N crRNA (étape 3a), tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec uniquement la RNase P crRNA (étape 3b). Les échantillons de salive ne sont passés que par l'étape 3a, tandis que les échantillons cliniques sont passés par les étapes 3a et 3b.

Une cartouche microfluidique a été développée pour la détection d'échantillons de salive positifs ou négatifs (Fig. 6c). Dans la première itération de la conception du test de cartouche, un échantillon de salive commercial positif inactivé (75 ° C pendant 30 min) est chargé sur la cartouche et dosé activement dans la chambre rLAMP, où il est mélangé avec des amorces de gène N et un mélange maître rLAMP. La solution est ensuite chauffée à 65 ° C pendant 30 min tandis que les réactifs Cas13 sont maintenus à 25 ° C avec le TEC. À la fin de la réaction rLAMP, la vanne active sous la chambre s'ouvre, permettant l'écoulement par gravité de 4 μl de la solution amplifiée dans un canal de dosage. Seul le canal gauche (Fig. 6c, étape 3a) était ouvert, permettant aux réactifs Cas13 et à son ARN CRISPR ciblant le gène N (ARNcr) d'être poussés à travers le canal de dosage dans la chambre de mélange, où il a ensuite été chauffé à 37 ° C pendant 10 min. Le canal droit (Fig. 6c, étape 3b) a été ajouté dans la dernière version de la cartouche. Cas13 mélangé à la solution rLAMP a été aspiré vers la chambre de détection et la réaction a été surveillée à l'aide d'un détecteur de fluorescence. Les temps d'actionnement microfluidique étaient d'environ 8 min sur l'ensemble du test embarqué. Nous démontrons la détection d'une série de dilutions de 200 à 40 copies μl−1 d'ARN génomique du SRAS-CoV-2 dans la salive entière, avec un temps de réaction de bout en bout (y compris l'étape d'inactivation) de 78 min (Fig. 7a) . Cela indique l'application potentielle au point de service de ce système microfluidique, où DISCoVER peut détecter l'ARN du SRAS-CoV-2 à partir d'échantillons de salive avec une sensibilité attomolaire.

a, carte thermique illustrant le changement de pli du signal DISCoVER sur des échantillons de salive négatifs et positifs par rapport au NTC. b, carte thermique illustrant le changement de pli dans les échantillons cliniques positifs et négatifs pour l'ARN du SRAS-CoV-2 provenant d'écouvillons nasaux, par rapport au NTC. Les valeurs Ct pour la cible du gène N par détection qPCR sont répertoriées sur l'axe de la carte thermique. c, graphique illustrant la fluorescence brute au fil du temps pour les deux chambres de détection (bleu pour la RNase P et rouge pour le gène N) dans les échantillons NTC (à gauche), négatifs (au milieu) et positifs (à droite, Ct 16). L'encart dans chaque parcelle est des images fluorescentes de la chambre de détection pour la cartouche NTC (pas d'échantillon viral), l'échantillon clinique négatif et positif (avec RT – qPCR Ct allant de 16 à 21). La chambre de détection de gauche est spécifique à la détection du gène N, tandis que la chambre de droite est spécifique à la RNase P. d, Résultats du DISCoVER embarqué sur dix échantillons de salive cliniques et trois échantillons de salive cliniques négatifs. L'augmentation du pli est calculée sur une cartouche vierge. Une augmentation de fluorescence de deux fois par rapport aux cartouches vierges à 50 min était le critère déterminé expérimentalement pour des résultats positifs. Les échantillons avec une valeur inférieure à ce seuil à 5 ​​min ont été déclarés négatifs.

Données source

Ensuite, nous avons optimisé la conception de la cartouche en multiplexant la détection du gène N et de la RNase P pendant l'étape rLAMP pour ajouter un contrôle de processus interne (étape 3b sur la figure 6c). Le rLAMP multiplexé a été réalisé avant que la réaction amplifiée ne soit divisée en deux chambres de détection Cas13, chacune contenant un seul ARNc ciblant soit le gène N (chambre de gauche, étape 3a) soit la RNase P (chambre de droite, étape 3b) amplicon rLAMP (Fig. 6c) .

Nous avons ensuite retesté les ARN de trois échantillons cliniques respiratoires négatifs et de trois positifs (Ct 16–21) sur le dispositif DISCoVER complet (Fig. 7b). Nous avons correctement détecté le SRAS-CoV-2 dans les trois échantillons positifs (Fig. 7c, en bas) et détecté uniquement le signal RNase P pour les trois échantillons négatifs (Fig. 7c, au milieu). Des cartouches NTC sans aucun échantillon viral ont été initialement analysées pour déterminer la fluorescence de base, ce qui nous a permis de déterminer le changement de pli d'un échantillon positif par rapport à la ligne de base (Fig. 7c, en haut).

Pour démontrer la robustesse et la reproductibilité de ce système, nous avons analysé 25 échantillons artificiels supplémentaires sur l'appareil DISCoVER (20 échantillons positifs artificiels à 500 copies μl–1 et 5 échantillons négatifs attendus à 0 copies μl–1) (Extended Data Fig. 2 ). Pour permettre un contrôle de processus robuste sur des échantillons artificiels fabriqués à partir d'échantillons de salive commerciaux, nous avons optimisé l'amplification multiplexée hors carte et à bord en utilisant des amorces de gène ACTB humain (β-actine) dans l'étape rLAMP au lieu de l'amorce RNase P (Extended Data Fig. .2a,b). Pour les échantillons de salive artificiels, nous avons pu raccourcir l'étape d'inactivation à 5 min à 95 ° C et conçu une cartouche simplifiée sans l'étape de dosage (Extended Data Fig. 2c) pour raccourcir le temps de dosage global à environ 50 min, y compris l'échantillon temps d'inactivation38 et d'activation microfluidique. Les échantillons avec un signal intégré d'au moins deux fois le changement par rapport au bruit de fond ont été appelés positifs, et les échantillons qui n'ont pas atteint ce seuil ont été considérés comme négatifs (Extended Data Fig. 2d). Nous avons ensuite validé l'appareil sur dix échantillons de salive cliniques naturels prélevés sur le terrain d'individus testés positifs par RT – qPCR pour COVID-19 et trois échantillons de salive cliniques naturels d'individus testés négatifs (Fig. 7d et tableau supplémentaire 5). En raison des directives de santé et de sécurité environnementales concernant les échantillons de salive prélevés sur le terrain, le temps d'inactivation de l'échantillon a été prolongé à 20 min à 95 ° C, ce qui porte le temps total de test à 63 min pour cette validation. Les 13 échantillons de salive cliniques collectés sur le terrain et les 25 échantillons commerciaux artificiels ont été correctement détectés avec une sensibilité attomolaire sur un système microfluidique entièrement automatisé avec une interaction minimale de l'utilisateur (vidéo supplémentaire).

Nous avons développé un flux de travail de détection sans extraction d'ARN, démontrant la détection attomolaire de l'ARN du SRAS-CoV-2 dans la salive non extraite. Le test DISCoVER combine une étape rLAMP de 30 minutes suivie d'une transcription T7 et d'une détection basée sur Cas13, créant un protocole de test rapide avec une sensibilité attomolaire et une spécificité élevée. Comme chaque produit LAMP modifié peut servir de substrat pour l'initiation de la transcription, le signal Cas13 maximal est atteint en moins de 5 minutes en raison de la génération rapide de concentrations de substrat nanomolaires (Fig. 3 supplémentaire). La combinaison de l'amplification sensible des acides nucléiques avec la spécificité et la programmabilité médiées par CRISPR a le potentiel de permettre des diagnostics flexibles pour la détection de divers agents pathogènes.

Nous avons d'abord démontré le système DISCoVER sur de la salive non extraite, dans le but de permettre les étapes clés d'un diagnostic au point de service. Comme un test basé sur la salive peut ne pas nécessiter de personnel médical pour le prélèvement d'échantillons, il est préférable aux écouvillons NP, et le confort accru du prélèvement d'échantillons incitera probablement le patient à s'y conformer et à s'engager à effectuer des tests fréquents. Il a également été démontré que la salive est une matrice d'échantillon fiable pour les tests asymptomatiques dans le cadre de la surveillance communautaire, car les échantillons de salive ont des titres viraux comparables aux écouvillons NP11. Pour diversifier la chaîne d'approvisionnement d'échantillonnage, DISCoVER peut également être appliqué à d'autres échantillons tels que les écouvillons NP et les écouvillons nasaux auto-administrés.

En comparaison avec d'autres méthodes de détection CRISPR telles que DETECTR et STOPCovid V2, DISCoVER n'utilise pas d'étape d'extraction ou de purification d'échantillon39,40, éliminant ainsi la dépendance aux kits d'extraction d'ARN commerciaux tout en conservant une sensibilité comparable. La méthode de lyse directe employée ici exploite des réactifs communs pour la réduction chimique et la chélation des ions qui sont simples, largement disponibles à faible coût et stables à température ambiante. DISCoVER maintient la sensibilité attomolaire par rapport aux autres tests de détection basés sur CRISPR qui incluent l'extraction et la purification de l'ARN viral20,39,41.

Nous validons en outre la capacité de DISCoVER à détecter plusieurs variantes du SRAS-CoV-2, en particulier la variante B.1.1.7 préoccupante, qui a suscité un large intérêt médical en raison de sa transmissibilité accrue potentielle36. Avec le développement supplémentaire d'ensembles de sondes DISCoVER spécifiques aux mutants, il peut être possible de détecter une variante préoccupante par rapport à une autre de manière plus sélective. Ici, nous avons optimisé la surveillance pan-SARS-CoV-2, en utilisant des amorces conçues pour détecter autant de variantes du SARS-CoV-2 que possible. Pour tester davantage la spécificité de DISCoVER, nous avons analysé la reconnaissance croisée de l'ARN génomique viral d'autres agents pathogènes respiratoires courants, notamment la grippe A H1N1 et H3N2, la grippe B et le coronavirus humain OC43. Nous n'avons pas observé d'effet perceptible sur la cinétique ou la spécificité de DISCoVER.

Nous démontrons également la détection multiplexée du SARS-CoV-2 avec un contrôle interne humain pendant l'étape d'amplification DISCoVER. Cela pourrait être étendu à la détection multicolore en utilisant des enzymes Cas supplémentaires avec des motifs de clivage orthogonaux, chacun agissant sur des rapporteurs spécifiques pour des canaux fluorescents distincts42. Le multiplexage d'ordre supérieur peut être développé plus avant pour les types de grippe A et B et d'autres virus respiratoires courants qu'il serait souhaitable de détecter dans un seul test. La capacité inhérente des enzymes de base de DISCoVER à convertir entre n'importe quelle séquence d'ARN et d'ADN implique que tout agent pathogène inactivé et lysé par notre protocole peut être détecté.

Nous avons validé DISCoVER sur 33 échantillons de patients positifs et 30 négatifs, rapportant une VPP de 100 % et une VPN de 93,75 % pour l'ARN total extrait des écouvillons nasaux. Nous observons une spécificité de 100 % et une sensibilité de 93,9 % par rapport aux tests qPCR pour des échantillons avec des valeurs de Ct allant de 13 à 35. Enfin, nous démontrons l'intégration de DISCoVER avec un système microfluidique et un dispositif de détection. Avec de simples éléments de chauffage et de refroidissement et des pompes à déplacement d'air, la cartouche microfluidique entraînée par gravité peut effectuer le flux de travail DISCoVER sur la salive positive artificielle et les échantillons de patients en moins de 50 min, y compris l'inactivation, avec une lecture de fluorescence en temps réel. La poursuite du développement et du déploiement de cet assemblage montre un potentiel vers un système de point de service, ce qui facilitera grandement les diagnostics moléculaires fréquents et sur place.

Pour la bactérie Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a), l'ARNc et l'ADN activateur ont été synthétisés via Integrated DNA Technologies (IDT). La détection avec Cas12a a été réalisée en utilisant 1 × tampon NEB 2.1 (B7202S), 100 nM de protéine LbCas12a, 100 nM d'ARNc, différentes concentrations (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM et 10 pM) d'ADN double brin activateur et 200 nM DNaseAlert (IDT). LbCas12a et crRNA ont été pré-mélangés à une concentration de 10 × à un rapport molaire de 1: 1 et incubés à température ambiante pendant 15 min avant de l'ajouter à la réaction. La réaction a été chauffée à 37 ° C avec une détection à intervalle de 15 s avec un lecteur de microplaques multimode Tecan Spark. Pour la soustraction de fond, les valeurs de fluorescence de la réaction sans activateur ont été soustraites des valeurs de fluorescence des réactions d'échantillon à chaque instant. La fluorescence maximale a été obtenue en mélangeant la DNase I et 200 nM de DNaseAlert avec un tampon 1 × NEB 2.1. Cette valeur de fluorescence maximale saturée a été divisée par deux ; le temps pour atteindre cette demi-fluorescence maximale a été calculé pour chaque concentration d'activateur.

Pour Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a), le crARN et l'activateur ont été synthétisés commercialement à partir de Synthego. La détection avec Cas13a a été réalisée à l'aide d'un tampon de réaction Cas13 1 ×, de protéine LbuCas13a 100 nM, d'ARNc 100 nM, de concentrations variables (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM et 10 pM) d'ARN simple brin et 200 nM Journaliste Cas13 (IDT). LbuCas13a et l'ARNc ont été pré-mélangés à une concentration de 10 × dans un rapport de 1: 1 et incubés à température ambiante pendant 15 minutes avant de l'ajouter à la réaction. Le reste de la réaction, et le temps jusqu'à la demi-fluorescence maximale, ont été réalisés ou analysés comme décrit ci-dessus. La fluorescence maximale a été obtenue en mélangeant la RNase A et le rapporteur Cas13 200 nM avec un tampon 1 ×. Le tampon de réaction 5× Cas13 (pH 6,8) est composé de 100 mM HEPES – Na pH 6,8 (Sigma), 250 mM KCl (Sigma), 25 mM MgCl2 (Sigma) et 25 % de glycérol (Thermo Fisher).

L'expression et la purification de Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) ont été réalisées comme décrit précédemment24 avec des modifications, résumées ici : His6–MBP–TEV-tagged Cas13a a été préparé dans Escherichia coli Rosetta2 (DE3) cultivé dans TB à 37 °C. À une DO600 de 0, 6 à 0, 8, les cultures ont été refroidies sur de la glace pendant 15 min avant induction avec 0, 5 mM d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside et expression pendant une nuit à 16 ° C. Des culots cellulaires mesurant près de 10 ml dans un tube Falcon de 50 ml ont été remis en suspension dans 100 ml de tampon de lyse chacun. His6–MBP–TEV Cas13a soluble a été clarifié par centrifugation à 15 000 g, puis chargé sur une colonne HiTrap NiNTA de 5 ml (GE Healthcare) et élué sur un gradient d'imidazole linéaire (0,01–0,3 M) via une chromatographie liquide protéique rapide (ÄKTA Pure) . Après une nuit de dialyse et de digestion au TEV, LbuCas13a a été purifié par échange d'ions et élimination de MBP (5 ml HiTrap SP, MBP trap HP, GE Healthcare). Enfin, une chromatographie d'exclusion de taille a été réalisée (S200 16/60, GE Healthcare) avec 1 mM de TCEP ajouté dans le tampon de filtration sur gel, et les fractions de pic ont été regroupées, concentrées et aliquotées dans des tubes à bande PCR, puis congelées dans de l'azote liquide.

L'expression et la purification de la bactérie Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCas12a) ont été réalisées comme décrit précédemment avec l'ajout de 1 mM d'EDTA dans le tampon de dialyse pour empêcher la précipitation des protéines lors de l'élimination de l'étiquette His par la protéase TEV43.

Les réactions d'amplification d'ADN LAMP et rLAMP ont été menées avec 2 × LAMP Mastermix (NEB, E1700), 0,4 µl de colorant LAMP (NEB, E1700), 2 µl de mélange d'amorces 10 × (IDT ; 16 μM de FIP/BIP, 4 μM FLoop/ BLoop et 2 µM de F3/B3), et 7,6 µl d'échantillon. Huit microlitres d'échantillon ont été ajoutés à des réactions dans lesquelles aucun colorant n'a été ajouté. Pour la LAMP multiplexée, 1 μl d'amorce RNase P avec le promoteur T7 sur l'amorce BIP 5 'a été ajouté à la réaction de 20 μl. La détection a été effectuée à 65 ° C pendant 30 à 60 min dans une machine de PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad) ou un système de PCR en temps réel QuantStudio 3 (Thermo). Le temps jusqu'au seuil a été calculé en utilisant le mode d'analyse à seuil unique. La LOD pour LAMP a été déterminée comme la concentration à laquelle une amplification a été observée avec au moins 95 % des échantillons. Les réactions d'amplification LAMP pour les échantillons cliniques ont été réalisées avec 2 × LAMP Mastermix, 2 µl de mélange d'amorces de gène 10 × N, 1 µl de mélange d'amorces RNase P et 5 µl d'échantillon dans une réaction de 20 µl.

Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (Twist Bioscience, SKU 102024) a été utilisé comme modèle pour effectuer le criblage d'amorces et établir les plages LOD. Le volume de matrice à utiliser et la concentration finale de matrice dans la réaction ont été calculés sur la base de la concentration initiale fournie par le vendeur à 106 copies µl-1.

La digestion par restriction des produits d'ADN rLAMP a été réalisée sur 3 µl de produit rLAMP amplifié en utilisant 2 µl d'AfeI (NEB R0652L), 2 µl de tampon 10X CutSmart et 13 µl d'eau. Ces 20 ul de réaction ont été chauffés à 37°C pendant 30 min. Les produits rLAMP non digérés et digérés ont été traités avec 4 µl de 1 U µl-1 RQ DNase I et 1 µl de tampon de réaction 10 × (Promega, M6101). La réaction a été chauffée à 37 °C pendant 30 min et 1 µl de solution STOP (Promega M6101) a été ajouté, suivi d'une incubation à 65 °C pendant 10 min. Les produits rLAMP ont été analysés à l'aide de gels TBE-urée à 15 % (Thermo Fisher, EC68855BOX).

La salive SARS-CoV-2-negative (Lee Biosolutions, 991-05-S-25) a été utilisée pour vérifier la compatibilité de la salive avec le flux de travail DISCoVER. Tous les échantillons de salive ont été prélevés avant novembre 2019 selon le fournisseur. Lorsque de l'ARN synthétique viral a été utilisé, Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (isolat de SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1) a été dopé dans la salive commerciale et utilisé comme modèle pour des échantillons factices. Pour la détermination de LOD, les stocks de semences viraux SARS-CoV-2 ont été dopés dans un fond de salive négatif sous confinement BSL-3 et utilisés comme modèle pour des échantillons fictifs.

La salive commerciale a été mélangée avec des réactifs de lyse et chauffée à 75 °C pendant 30 min ou à 95 °C pendant 5 min à l'aide d'un bloc chauffant. Twist Synthetic RNA a été ajouté après l'achèvement de l'inactivation thermique de la salive. Les stocks de semences virales ont été dopés dans la salive dans l'installation BSL3 avant l'inactivation par la chaleur. Le réactif d'inactivation 1 était 2,5 mM de TCEP/1 mM d'EDTA à une concentration de 1x lorsqu'il était mélangé avec de la salive. Le réactif d'inactivation 2 était 100 mM de TCEP/1 mM d'EDTA à une concentration de 1x lorsqu'il était mélangé avec de la salive. Le réactif d'inactivation 3 était l'ADN Quickextract (Lucigen QE09050), le réactif d'inactivation 4 était l'ARN Quickextract (Lucigen QER090150) et le réactif d'inactivation 5 était l'ARN/DNAShield (Zymo 76020-420).

Des échantillons de salive cliniques prélevés sur le terrain provenant de l'étude des ouvriers agricoles de la vallée de Salinas ont été lysés dans un bain de billes réglé à 95 ° C pendant 20 min. Selon réf. 37, le temps d'inactivation utilisé pour les échantillons artificiels fabriqués à partir de salive commerciale peut également être utilisé ici, mais nous n'avons pas pu le tester en raison des restrictions imposées par l'UC Berkeley Environment, Health, and Safety (EH&S) sur les protocoles d'inactivation des échantillons cliniques.

Pour déterminer la LOD, les stocks viraux SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020 ; BEI Resources, NR-52281) amplifiés une fois dans des cellules Vero-E6 (ATCC) ont été dilués dans du milieu (DMEM + 10 % FBS + 1 % pénicilline –streptomycine) pour obtenir différentes concentrations, ajoutées à la salive et inactivées en ajoutant 1× de réactif d'inactivation à faible teneur en TCEP/EDTA et en chauffant les échantillons à 75 °C. Les dilutions de virus dans le milieu ont été inactivées par chauffage à 75 ° C pendant 30 min pour se conformer aux exigences EH & S (UC Berkeley) et RT – qPCR a été réalisée à l'aide du kit Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB E3006) et du gène E -des amorces de ciblage pour déterminer la concentration finale d'ARN viral. Des fragments d'ARN génomique synthétique (Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2) ont été utilisés pour obtenir une courbe standard pour les calculs. L'échantillon factice a été détecté comme positif si le changement de pli (rapport de la valeur de fluorescence de l'échantillon à la valeur de fluorescence de l'absence de contrôle de matrice) est supérieur à 2 en 5 min. La LOD pour les échantillons fictifs a été déterminée comme la concentration où il y avait détection avec au moins 95 % des échantillons.

L'ARN extrait d'échantillons d'écouvillons respiratoires a été obtenu auprès du laboratoire clinique de l'Innovative Genomics Institute (IGI). Ces échantillons ont été prélevés à des fins de diagnostic du SRAS-CoV-2, et le test LuNER37 avait déjà été effectué sur eux. En bref, des échantillons respiratoires ont été prélevés sur des patients (de l'oropharynx, des narines antérieures ou du cornet moyen) par un professionnel de la santé. L'ARN a été extrait dans le laboratoire clinique IGI à l'aide d'un flux de travail automatisé basé sur le kit d'isolement d'acide nucléique viral/pathogène MagMAX (Thermo Fisher A42352), puis dosé pour les gènes N et E et la RNaseP. Les échantillons ont été anonymisés et l'ARN extrait a été fourni avec des valeurs cliniques de Ct pour les expériences décrites ici.

Nous avons déterminé qu'un double changement entre un signal positif et un contrôle négatif à 5 min dans la détection de Cas13 est suffisant pour distinguer les échantillons de salive positifs et négatifs prévus. Ce seuil dérivé expérimentalement a été utilisé pour appeler les positifs et les négatifs dans les échantillons cliniques. Un échantillon est déterminé comme étant positif si le gène N et le changement de pli du signal de contrôle du processus sont supérieurs à deux fois en 5 min. Un échantillon est déterminé positif si le gène N montre un double changement dans les 5 min, même si le contrôle du processus ne montre pas un double changement, car cela pourrait indiquer une perte ou une dégradation du matériel cellulaire humain dans la salive. Un échantillon est déterminé comme étant négatif si le contrôle du processus montre un changement > 2 fois dans les 5 min alors que le signal du gène N n'apparaît pas. Si le gène N et le changement de facteur de contrôle du processus sont inférieurs à 2, le test est considéré comme invalide.

Un guide LbuCas13a ciblant le SARS-CoV-2 a été conçu en priorisant la sensibilité, la spécificité et la structure secondaire prédite. Vingt-six espaceurs candidats de 20 nucléotides ont été identifiés dans la région de l'amplicon N set 1 du génome de référence du SRAS-CoV-2 (wuhCor1), ciblant à la fois les brins avant et arrière. La sensibilité a été déterminée en alignant par paires les génomes SARS-CoV-2 disponibles de GISAID avec le génome de référence et en calculant le nombre de mésappariements entre l'échantillon et le génome de référence pour chaque espaceur candidat. Le pourcentage de génomes du SRAS-CoV-2 détectés par chaque espaceur, avec pas plus d'un mésappariement, a ensuite été calculé, et les espaceurs correspondant à moins de 99 % des génomes du SRAS-CoV-2 ont été rejetés. Pour garantir la spécificité, les espaceurs candidats qui ont été déterminés comme étant sensibles ont été alignés sur d'autres génomes de référence de coronavirus humains, en particulier le SRAS, le MERS, le 229E, le NL63, l'OC43 et le HKU1. Les entretoises qui correspondaient à l'un de ces autres coronavirus avec deux incompatibilités ou moins ont été rejetées. Les espaceurs restants ont également été alignés sur le transcriptome humain, permettant à nouveau deux inadéquations, et les espaceurs avec des alignements ont été rejetés pour garantir que le guide ne serait pas complémentaire aux transcriptions humaines hors cible. Pour s'assurer que les séquences d'espacement permettraient la liaison de Cas13a à l'échafaudage de répétition directe, la séquence de répétition et d'espacement concaténée a été pliée à l'aide d'ARNfold et évaluée pour la structure en épingle à cheveux correcte dans la répétition directe et le simple brin dans la séquence d'espacement. Sur cinq espaceurs SARS-CoV-2 possibles répondant à nos critères de sensibilité, de spécificité et de structure, un a été choisi pour être utilisé comme ARN guide. Un guide de contrôle ciblant la RNase P a été sélectionné avec les mêmes critères pour éviter de faire correspondre les transcrits du SRAS-CoV-2 et humains et pour assurer une structure d'ARN appropriée. Dans l'expérience de validation (Fig. 7d et données étendues Fig. 2d), en raison de la différence de composition de la salive entre les échantillons commerciaux et cliniques, l'amplification multiplexée a été optimisée hors carte et à bord en utilisant des amorces de gène ACTB humain dans le rLAMP étape au lieu de l'amorce RNase P. Les guides ACTB ont été choisis en utilisant le même pipeline que N set 1 et RNase P.

La transcription a été effectuée sur le produit rLAMP amplifié en utilisant 2 µl de 1 mg ml-1 de polymérase T7, 4 µl de mélange NTP 100 mM (NEB N0450), 1 µl de DTT 200 mM, 4 µl de tampon de transcription 5×, 2 µl de Produit LAMP et 7 µl d'eau. Ces 20 ul de réaction ont été chauffés à 37°C pendant 30 min. Le tampon de transcription 5 × est composé de Tris-Cl 150 mM, pH 8,1 à température ambiante, MgCl2 125 mM, Triton X-100 0,05 % (Sigma Aldrich, X100) et spermidine 10 mM et stocké à -20 °C.

La détection de Cas13 a été réalisée sous la forme d'une réaction de 20 µl en utilisant 2 µl de produit de transcription dilué à 1:100 de LAMP, 1 µl de tampon de réaction Cas13 5×, 2 µl de rapporteur Cas13 2 µM, 2 µl de ribonucléoprotéine 10× (RNP), 13 µl de 1 × tampon de réaction Cas13. Le RNP 10 × a été fabriqué sous la forme d'un rapport 2: 1 de Cas13: ARNcr avec une concentration finale de Cas13 de 20 nM et incubé à température ambiante pendant 15 minutes avant de l'ajouter à la réaction. Cette réaction de 20 µl a été chauffée à 37 ° C et lue toutes les 30 s dans un lecteur de microplaques multimode TECAN Spark utilisant le canal FAM (excitation 485 nm, émission 535 nm).

Le T7 et le Cas13 en un seul pot ont été réalisés en combinant 2 µl de 1 mg ml-1 de polymérase T7, un mélange NTP 20 mM, du DTT 10 mM et du MgCl2 25 mM avec le mélange réactionnel Cas13. Deux microlitres de dilution 1:100 de produit rLAMP sont utilisés pour 20 µl de réaction T7-Cas13 en un seul pot. Pour tester les échantillons cliniques, 2 µl de produit 1× rLAMP sont utilisés pour 20 µl de réaction T7–Cas13 en un pot.

L'ARN viral synthétique de la grippe A H1N1 (Twist Bioscience, SKU 103001), de la grippe A H3N2 (Twist Bioscience, SKU 103002), de la grippe B (Twist Bioscience, SKU 103003) et du coronavirus humain OC32 (Twist Bioscience, SKU 103013) a été inactivé salive (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), avec et sans Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2. rLAMP et la transcription T7 en un seul pot comme décrit ci-dessus ont été réalisées avec le gène N crRNA.

L'ARN viral synthétique de la variante SARS-CoV-2 B.1.1.7_710528 Control 14 (Twist Bioscience, SKU 103907) et de la variante SARS-CoV-2 B.1.1.7_601443 Control 15 (Twist Bioscience, SKU 103909) a été dopé dans de la salive inactivée (Lee Biosolutions, 991-05-S-25). La transcription de rLAMP et de T7 en un seul pot telle que décrite ci-dessus a été réalisée avec le crARN du gène N.

Un instrument prototype a été conçu et fabriqué par Wainamics Inc. L'instrument a été conçu spécifiquement pour démontrer la faisabilité du système et avec des caractéristiques qui permettraient une transition facile vers un instrument d'utilisation finale manufacturable. Une combinaison de composants prêts à l'emploi, de composants conçus sur mesure (conçus dans SolidWorks), d'une carte électronique personnalisée basée sur un microcontrôleur Teensy 3.2 et d'un logiciel personnalisé (écrit en C) ont été intégrés pour fabriquer un instrument prototype. Le système était destiné à démontrer la faisabilité de l'essai à bord d'un prototype de dispositif thermoplastique de manière automatisée. Des précautions ont été prises pour s'assurer que tous les éléments de conception seraient transférables aux méthodes de fabrication à grand volume couramment utilisées (par exemple, découpe à l'emporte-pièce, moulage par injection, etc.).

Les composants conçus sur mesure pour le système prototype ont été fabriqués à l'aide de méthodes de fabrication courantes, notamment l'usinage commercial par commande numérique par ordinateur (CNC) (Protolabs) de composants en aluminium et en Delrin, la modélisation par dépôt de fil fondu (FDM), l'impression 3D (Dremel 3D45) et la stéréolithographie (SLA) 3D impression (Formlabs Form3). Les composants disponibles dans le commerce utilisés consistaient en une pompe à seringue Norgren Kloehn V6c avec vanne rotative à huit voies, des électrovannes à trois voies Burkert Type 6724, un contrôleur de température Laird Thermal Systems (TC-XX-PR-59) contrôlant une unité TEC Marlow Industries (NL2064T-11AB), ventilateurs de contrôle (Sunon Fans MF25101V1-1000U-A99) et cartouches chauffantes résistives (E3D, 12 V 40 W). Une interface utilisateur graphique personnalisée sur un PC Windows 10 a permis à l'utilisateur de contrôler diverses fonctionnalités du système et de la cartouche (c'est-à-dire, actionner les valeurs, contrôler les volumes d'air déplacés dans la cartouche par la pompe, contrôler le débit d'air déplacé, contrôler les températures du réchauffeur, etc). L'enregistrement de scripts a permis à l'utilisateur de générer et d'enregistrer des scripts de système d'instrument qui ont été utilisés pour exécuter automatiquement le test à bord de la cartouche afin d'assurer la précision et la cohérence entre les cycles de test de la cartouche.

Le temps d'actionnement fluidique a été mesuré à environ 8 min. Un élément clé de l'instrument est un collecteur personnalisé qui forme un joint hermétique à la cartouche en plastique lorsqu'il est engagé, permettant l'actionnement du liquide à l'intérieur de la cartouche. Le collecteur se compose de sept orifices reliés par des vannes commerciales à une seule pompe à seringue personnalisée. Les orifices sont scellés à la cartouche à l'aide de joints intégrés au collecteur. Sur la cartouche en plastique, chacun des orifices est isolé de l'instrument par une membrane hydrophobe qui permet le passage de l'air mais pas des fluides aqueux, protégeant ainsi l'instrument de la contamination par tout réactif de dosage ou salive. Lorsqu'une pression d'air positive ou une pression négative est appliquée aux orifices appropriés du collecteur, la pression pousse ou tire le liquide à l'intérieur de la cartouche en fonction du débit et du volume d'air déplacé. Les vannes du collecteur peuvent également s'évacuer vers l'atmosphère, permettant à la pression à l'intérieur de la cartouche de s'équilibrer. Le volume d'air déplacé et les débits de la pompe sont ajustés pour permettre un mélange complet des réactifs et une perte minimale de volume résiduel à l'intérieur des canaux.

L'instrument prototype global mesure environ 12′ de large, 18′ de profondeur et 12′ de haut. Un instrument conçu sur mesure avec une carte électronique personnalisée, un collecteur personnalisé avec des pompes et des vannes intégrées et une optique personnalisée peut être aussi petit que 8′ × 9′ × 9′.

Le chauffage résistif et le TEC sont ajustés en mesurant les températures atteintes à l'intérieur de la cartouche pendant le fonctionnement à l'aide d'une cartouche avec des thermocouples intégrés. La température de consigne est généralement supérieure de 5 à 8 °C à la température réelle à l'intérieur de la cartouche en raison des pertes de transfert de chaleur à travers le plastique. Les points de consigne des éléments chauffants sont réglés en conséquence avec un décalage correspondant. Pour la cartouche utilisée dans les tests cliniques, le réchauffeur de la chambre de réaction LAMP a été réglé sur 72 °C et la chambre de détection Cas13 sur 39 °C.

La cartouche a été conçue par Wainamics Inc. dans SolidWorks. Les cartouches prototypes ont été conçues et fabriquées en tenant compte de la fabricabilité. Des couches de polyméthacrylate de méthyle découpées au laser de différentes épaisseurs (0, 25 à 1 mm, Clarex Precision de Nitto Jushi Kogyo Co.) ont été laminées ensemble à l'aide d'adhésifs sensibles à la pression compatibles PCR (Adhesive Research AR90880 et AR92712) pour obtenir les géométries de canal souhaitées. Toutes les géométries de canal ont été conçues pour être facilement traduites et reproduites par des techniques de fabrication de masse telles que le moulage par injection et la découpe rotative. Chaque couche a été découpée au laser CO2 (BossLaser) et l'ensemble de la cartouche a été assemblé à la main par Wainamics Inc. Des membranes hydrophobes (Sterlitech PTFE029025) ont été utilisées pour permettre le passage du gaz, et non du liquide, afin d'éviter la contamination du prototype d'instrument. Une feuille de caoutchouc de silicone (McMaster-Carr 1460N11) a été utilisée pour fabriquer des vannes à cartouche actionnables pour contrôler le débit de la solution.

Une cartouche contenant des thermocouples (Omega Engineering) intégrés dans de l'époxy thermique (McMaster-Carr, #7548A11) a été utilisée à des fins d'étalonnage de la température. Les réglages de puissance pour les éléments chauffants résistifs et le TEC ont été ajustés manuellement à l'aide des lectures de la cartouche d'étalonnage de la température. Une course d'étalonnage de la température utilisant la rétroaction d'une cartouche de test thermique est illustrée à la Fig. 5 supplémentaire. La différence entre la température réglée et la température enregistrée augmente à des températures plus élevées (non stables). Il est donc important de calibrer le système en vérifiant la température de consigne nécessaire pour correspondre à la température de réaction requise.

En raison des pertes de réactifs le long des canaux, plusieurs expériences d'étalonnage ont été réalisées pour garantir des volumes de réaction corrects (tableau supplémentaire 3). Pour mesurer la quantité de volume perdu entre le « réservoir de départ » et la « chambre de destination », le protocole expérimental était le suivant : Un volume donné de colorant fluorescent était chargé dans le réservoir de départ. D'autre part, un volume connu de PBS avec 0,1 % de Tween-20 a été ajouté à la chambre « destination ». La séquence fluidique expérimentale a été exécutée pour faire circuler le colorant du réservoir vers la chambre. Une fois mélangé, le colorant dilué dans la chambre a été retiré et sa fluorescence a été évaluée via un lecteur de plaque. Sur le lecteur de plaque, un titrage connu du colorant a été simultanément évalué pour créer la courbe d'étalonnage. En comparant la fluorescence du colorant extrait de la cartouche à la courbe d'étalonnage, nous avons pu déduire le volume de colorant récupéré après l'écoulement fluidique et la quantité de colorant perdu dans les canaux. Une solution de fluorescéine 100 nM (Sigma F6377) dans du PBS 1 × (Sigma P5493) avec 0, 1% de Tween-20 (Sigma P1379) a été utilisée à des fins de test fluidique visuel. FamT10 (IDT) dans du PBS 1 × à diverses concentrations (0 nM à 200 nm) a également été utilisé comme solution d'étalonnage pour la caractérisation optique de la cartouche avec le système de détection.

Pour l'imagerie des volumes d'échantillons de 40 pi dans les chambres de réaction, nous avons besoin d'un champ de vision assez large (FOV) et d'une ouverture numérique modeste (NA) permettant une profondeur de champ suffisante sans que les images des puits d'échantillons adjacents ne se chevauchent. Pour ce faire dans un appareil compact et relativement peu coûteux, nous avons conçu un système personnalisé utilisant une paire d'oculaires (Edmund Optics, PN # 66-208 et 66-210), produisant un système avec NA 0,09, FOV diamètre 12,0 mm, et grossissement de 0,54 (choisi pour faire correspondre la taille du capteur de la caméra Thorlabs CS165MU1 au champ de vision ; l'échantillonnage à ≥ Nyquist n'est pas nécessaire dans cette application « light-bucket ») (tableau supplémentaire 4). Le système global est compact, avec une longueur de piste nominale (de l'échantillon à la caméra) d'environ 75 mm. Les filtres de fluorescence provenaient de Chroma Technologies, ET470/40x, T495lpxr et ET535/70m, avec une excitation fournie par une LED de 965 mW, 470 nm (Thorlabs M470L4 pilotée par une LEDD1B), fournissant un maximum d'environ 225 mW dans l'échantillon de 12 mm de diamètre FOV dans une géométrie d'épi-illumination Kohler. Le contrôle personnalisé du matériel d'imagerie a été implémenté dans MATLAB (2020a), en utilisant les pilotes Thorlabs et le SDK (ThorCam) pour contrôler l'acquisition de la caméra, et la communication série vers une carte Arduino Bluefruit Feather pour déclencher électroniquement l'éclairage LED en synchronisation avec l'acquisition d'image de la caméra.

La cartouche multiplex possède deux chambres de détection pour le gène N et le contrôle interne (RNaseP ou ACTB). Chaque jour, avant d'exécuter le test sur des échantillons de salive, une cartouche vierge remplie de tampon ainsi qu'une lame fluorescente ont été imagées pour les corrections d'uniformité de fond et d'éclairage, respectivement. Une région d'intérêt (ROI) (150 × 400 pixels) a été sélectionnée dans chaque chambre, et la cartouche vierge a été imagée avec le même gain et le même temps d'exposition que les expériences ultérieures (2 dB et 150 ms). L'intensité mesurée dans chaque ROI a été utilisée pour normaliser les images d'échantillon en arrière-plan. Pour corriger la non-uniformité d'éclairage, une lame fluorescente propre a été imagée avec un gain de 1 et une exposition de 0,1 s.

La correction de l'uniformité du fond et de l'éclairage a été effectuée à l'aide d'une méthode de correction prospective44. En bref, les intensités mesurées pour chaque pixel, x, des chambres de réaction sont liées aux intensités réelles par

où S est un facteur d'échelle linéaire qui modélise les distorsions d'une image dues à un éclairage non uniforme ; B est le signal de fond dépendant de l'éclairage qui tient compte de la diffusion et de la fluorescence de fond des chambres d'échantillons ; et D est un terme additif de lumière nulle, qui est dû au décalage de la caméra et au bruit thermique à motif fixe. S, B et D ont été déterminés à partir d'images d'une cartouche vierge et d'une lame fluorescente uniforme acquise avant les expériences au début de chaque journée. Les images expérimentales ont été traitées selon l'équation (1) pour récupérer les signaux d'échantillons corrigés. Un script MATLAB personnalisé a été développé pour contrôler les paramètres d'éclairage et de détection, le temps d'exposition, le gain, l'intervalle de temps entre chaque acquisition d'image et le nombre total d'images à capturer. Le script a également permis un aperçu en direct de la cartouche pour un alignement et une sélection optimaux des retours sur investissement à l'intérieur des chambres de réaction. Une fois le test démarré, le script déclenchait également automatiquement l'acquisition d'images lorsque le mélange réactionnel était pompé dans les chambres de détection. À ce stade, le script affichait des images capturées à chaque instant et l'intensité moyenne correspondante des retours sur investissement sélectionnés au cours de l'expérience.

Un système de preuve de concept a été initialement développé avec un seul canal de réaction pour la détection du gène N positif ou négatif. La salive commerciale (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), dopée avec de l'ARN Twist Synthetic SARS-CoV-2 comme échantillon positif ou avec de l'eau pour l'échantillon négatif, a été utilisée sur ce système pour l'étalonnage de l'instrument et des résultats rapides. Comme le montre la figure 5, la réaction peut être séparée en quatre étapes : (1) dosage de la salive, (2) réaction LAMP, (3) dosage LAMP + mélange de gène crARN Cas13/N et (4) réaction Cas13 dans la chambre de détection. En raison des pertes de réactifs le long des canaux, plusieurs expériences d'étalonnage ont été effectuées comme décrit précédemment, pour garantir des volumes de réaction corrects (comme indiqué ici ; les volumes de chargement peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 3). À l'étape 1 (partie supérieure), 16 μl de salive sont activement aspirés par une pompe à seringue dans le canal de dosage. La pompe à seringue peut alors pousser activement l'amorce (4 μl) et le mélange maître (20 μl), séparés par une solution hydrophobe exclusive (35 μl), à travers le canal de dosage dans la chambre de mélange LAMP. 50 μl d'air supplémentaires (à 250 μl min-1) sont poussés dans la chambre pour permettre aux bulles d'air de mélanger la réaction LAMP (étape 2). Le chauffage résistif est allumé pour chauffer la chambre LAMP à 65 ° C pendant 30 min et permettre à la réaction de se produire. Simultanément, le TEC est réglé à 25 oC pour maintenir le mélange Cas13, T7, l'extincteur de fluorescence (FQ) et les réactifs crRNA à température ambiante. Après la réaction LAMP (étape 3), la vanne active inférieure s'ouvre et la gravité entraînera 4 μl du produit LAMP à s'écouler à travers le canal de dosage gauche. La pompe à seringue pousse activement 32 ul de T7mix + FQ avec 4 ul d'ARNc du gène Cas13 + N à travers les canaux de dosage dans la chambre de mélange gauche. Un supplément de 50 ul d'air est poussé dans les deux chambres pour le mélange. A l'étape 4, 45 μl de la solution sont activement aspirés dans les chambres de détection respectives. Le TEC est monté à 37 ° C et les images de fluorescence sont acquises toutes les 15 s pendant 15 à 30 min.

Une fois que la cartouche a détecté des échantillons de salive positifs et négatifs, nous avons conçu une nouvelle cartouche pour la détection clinique d'ARN extrait. Ces échantillons étaient des restes d'échantillons cliniques extraits du laboratoire de test CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments). Comme nous ne pouvions accéder qu'à 5 μl par échantillon clinique, la fluidique de dosage de la salive (étape 1 sur la Fig. 5c) n'a pas été utilisée. Au lieu de cela, l'échantillon clinique a été directement chargé dans la chambre LAMP. La réaction peut être séparée en trois étapes suivantes de la Fig. 5c : (2) réaction LAMP, (3) dosage LAMP + mélange Cas13/ARNcr et (4) réaction Cas13 dans des chambres de détection. Nous avons également multiplexé les étapes 3 et 4 afin que la partie gauche de la cartouche expose l'échantillon au gène N crRNA (étape 3a) tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec la RNase P crRNA (étape 3b), pour montrent que suffisamment de matériel cellulaire était présent dans l'échantillon. Ci-dessous, nous rapportons les volumes de réaction ; les volumes de chargement peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 3. À l'étape 2, les 5 μl d'échantillon clinique sont directement chargés dans la chambre LAMP. La pompe à seringue peut alors pousser activement l'amorce (4 μl) et le mélange maître (20 μl), séparés par une solution hydrophobe exclusive (35 μl), dans la chambre de mélange LAMP. 50 ul supplémentaires d'air sont poussés dans la chambre pour permettre aux bulles d'air de mélanger la réaction LAMP. Le chauffage résistif est allumé pour chauffer la chambre LAMP à 65 ° C pendant 30 min et permettre à la réaction de se produire. Simultanément, le TEC est réglé à 25 ° C pour maintenir les réactifs Cas13 et crRNA à température ambiante. L'étape 3 divisera l'échantillon LAMP en deux réactions : la partie gauche de la cartouche exposera l'échantillon à l'ARNc du gène N (étape 3a), tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec uniquement l'ARNc RNase P (étape 3b ). Après la réaction LAMP, les deux vannes actives inférieures s'ouvrent et la gravité entraînera 4 μl du produit LAMP à s'écouler à travers les canaux de dosage passifs gauche et droit. La pompe à seringue pousse activement 32 ul de mélange T7 + FQ avec 4 ul de Cas13 + crARN (gène N dans le réservoir gauche et RNase P dans le réservoir droit) à travers les canaux de dosage dans le gène N respectif (gauche) et la chambre RNase P (droite). Un supplément de 50 ul d'air est poussé dans les deux chambres pour le mélange. A ce stade, 45 μl de la solution sont activement aspirés dans les chambres de détection respectives (étape 4). La chambre de gauche contiendra le produit LAMP mélangé avec le gène Cas13 et N, tandis que la chambre de droite, le contrôle interne, mélangera la LAMP avec l'ARNc Cas13 et la RNase P. Le TEC est monté à 37 ° C et les images de fluorescence sont acquises toutes les 15 s pendant 15 à 30 min.

En raison de la difficulté d'accéder à un grand nombre d'échantillons cliniques, nous avons démontré la robustesse du système en analysant la salive d'individus distincts (Lee Biosciences) où des échantillons positifs ont été générés en ajoutant de l'ARN Twist Synthetic SARS-CoV-2 dans la matrice salivaire. En raison de la composition différente de la salive des échantillons commerciaux, nous avons examiné des contrôles de processus alternatifs (Extended Data Fig. 2a) pour traiter le signal variable de la RNase P. Tout d'abord, nous avons systématiquement testé l'insertion de séquences promotrices T7 dans différentes régions des amorces LAMP pour l'ACTB, à la fois sur la salive commerciale et sur l'extrait d'ARN de cellules HEK 293FT (Extended Data Fig. 2b), et avons effectué un petit écran guide pour l'intégrer dans le Pipeline DISCoVER (Extended Data Fig. 2c). En raison de la baisse des signaux du gène N dans les expériences initiales par rapport à l'ACTB, nous avons optimisé l'amplification multiplexée pour qu'elle consiste en une réaction avec un rapport de 2: 1 du gène N à l'amorce ACTB et l'ajout de polymérase Bst 2.0 supplémentaire. Nous avons ensuite analysé 25 échantillons de salive individuels, c'est-à-dire 20 échantillons en tant que positifs artificiels contenant de l'ARN génomique du SRAS-CoV-2 et 5 échantillons négatifs (Extended Data Fig. 2d) pour démontrer la reproductibilité et la robustesse de ce flux de travail.

La conception de la cartouche a été simplifiée pour permettre une conception plus compacte, un mélange amélioré et une précision de volume (Extended Data Fig. 2d). La réaction peut être séparée en les étapes suivantes : (1) réaction LAMP, (2) dosage LAMP + mélange Cas13/ARNcr et (3) réaction Cas13 dans des chambres de détection. L'étape 2 et l'étape 3 ont été multiplexées de sorte que la partie gauche de la cartouche expose l'échantillon au gène crRNA du gène N (étape 2a) tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec le crRNA ACTB (étape 2b), pour montrer que suffisamment de matériel cellulaire était présent dans l'échantillon. À l'étape 1, 18 μl d'échantillon de salive sont directement chargés dans la chambre d'échantillon. La pompe à seringue pourrait pousser activement une solution hydrophobe exclusive (30 μl) ainsi que l'amorce (10 μl) et le mélange maître (40 μl), séparés par une solution plus hydrophobe (15 μl), dans la chambre de mélange LAMP. 50 ul supplémentaires d'air sont poussés dans la chambre pour permettre aux bulles d'air de mélanger la réaction LAMP. Le chauffage résistif est allumé pour chauffer la chambre LAMP à 63 ° C pendant 45 min et permettre à la réaction de se produire. Un peu d'air est poussé toutes les 15 min pour mélanger la solution et améliorer le résultat de la réaction. Simultanément, le TEC est réglé à 25 ° C pour maintenir les réactifs Cas13 et crRNA à température ambiante. L'étape 2 divisera l'échantillon LAMP en deux réactions : la partie gauche de la cartouche exposera l'échantillon au gène crRNA du gène N (étape 2a), tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec uniquement le crRNA ACTB (étape 2b) . Après la réaction LAMP, les deux vannes actives inférieures s'ouvrent et la gravité entraînera 4 μl du produit LAMP à s'écouler à travers les canaux de dosage passifs gauche et droit. La pompe à seringue pousse activement 40 μl T7 mix + FQ, 15 μl de solution hydrophobe et 10 μl Cas13 + crRNA (gène N dans le réservoir gauche et ACTB dans le réservoir droit) à travers les canaux de dosage dans le gène N respectif (gauche) et ACTB ( droite) chambre. Un supplément de 50 ul d'air est poussé dans les deux chambres pour le mélange. A ce stade, 45 μl de la solution sont activement aspirés dans les chambres de détection respectives (étape 3). La chambre de gauche contiendra le produit LAMP mélangé avec Cas13 et l'ARNc du gène N, tandis que la chambre de droite, le contrôle interne, aura également le produit LAMP mais mélangé avec l'ARNc Cas13 et ACTB. Le TEC est tourné jusqu'à 37 ° C et les images de fluorescence sont acquises toutes les 10 s pendant 30 min. Le changement de pli a été déterminé entre 5 et 10 min pour appeler le résultat du test (Fig. 5g et Extended Data Fig. 2d).

Des échantillons de salive cliniques prélevés sur le terrain ont été prélevés sur des adultes âgés de 18 ans ou plus qui résidaient en Californie et recevaient un test COVID (antigène, PCR ou test d'amplification médiée par la transcription) à la Clinica de Salud del Valle de Salinas ou tout autre test de la vallée de Salinas site (numéro de protocole UC Berkeley IRB 2021-04-14268). Les participants dont les échantillons sont discutés dans cet ensemble de travaux comprenaient à la fois des travailleurs agricoles et non agricoles. Les femmes enceintes étaient également invitées à participer. Le dépistage et l'inscription ont eu lieu en personne dans les cliniques effectuant des tests COVID-19, ainsi que par téléphone pour les patients récemment testés positifs à la Clinica de Salud del Valle de Salinas. Pour tout recrutement et collecte de données, le personnel de recherche et clinique portait des masques et des gants. Pour la collecte en personne, les chercheurs sur le terrain ont fourni au participant un récipient à bouche ouverte et lui ont demandé de cracher dedans jusqu'à une marque prédéterminée d'environ 3 ml. Le participant a ensuite reçu un couvercle pour le récipient, une lingette désinfectante et une serviette en papier. Le participant a ensuite été invité à bien refermer le récipient et à essuyer tout l'extérieur du récipient avec la lingette. Le chercheur sur le terrain, portant des gants et d'autres équipements de protection individuelle, a reçu le conteneur, l'a étiqueté avec un autocollant contenant le numéro d'identification du participant et la date de collecte, et l'a placé dans une glacière avec des packs de glace. Pour le recrutement à domicile d'individus positifs au COVID, les chercheurs sur le terrain ont téléphoné aux patients qui avaient été testés positifs et ont déterminé leur intérêt à participer à une étude de recherche. Le chercheur sur le terrain a ensuite livré un kit de prélèvement d'échantillons au domicile du participant. Le kit comprenait des instructions visuelles et écrites pour le prélèvement d'échantillons ainsi qu'un récipient à gueule ouverte pré-étiqueté. Le chercheur sur le terrain a guidé le participant tout au long de la collecte d'échantillons par téléphone. Le chercheur sur le terrain a récupéré le kit du participant à la fin et a placé l'échantillon de salive dans une glacière avec des packs de glace. Les échantillons ont ensuite été stockés à -80 ° C jusqu'à leur transport à UC Berkeley sur de la neige carbonique, puis conservés à nouveau à -80 ° C. Tous les échantillons ont été prélevés sous la surveillance éthique du Comité de l'UC Berkeley pour la protection des sujets humains.

Lorsqu'ils étaient prêts à être testés, les 66 échantillons dont nous disposions de l'étude ont été décongelés et inactivés par la chaleur pendant 20 min à 95 ° C conformément aux directives EH&S universitaires en BSL-2, bien que 5 min soient suffisantes pour l'inactivation de la salive37. Comme les échantillons de salive eux-mêmes n'avaient pas été testés auparavant, une RT-qPCR a été réalisée sur chaque échantillon pour obtenir un profil de positivité de l'ensemble d'échantillons. La RT-qPCR a été réalisée à l'aide du kit Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB E3006) sur des amorces de ciblage du gène N pour déterminer la concentration finale d'ARN viral et des amorces de ciblage ACTB comme contrôle de processus. Parmi les 66 échantillons examinés, 13 échantillons ont été choisis (10 positifs, 3 négatifs) sur une plage de valeurs Ct (tableau supplémentaire 5) pour être exécutés sur le dispositif microfluidique DISCoVER afin de valider la capacité du dispositif à différencier les échantillons négatifs et positifs déjà confirmés par un test de référence en RT–qPCR. Chacun de ces échantillons de donneur de salive a été exécuté dans le système microfluidique selon le protocole décrit dans le flux de travail des échantillons artificiels et analysé de la même manière avec une observation d'une augmentation de fluorescence double sur les cartouches de fond comme indicateur de positivité pour chaque cible (Fig. .5g).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les séquences d'acides nucléiques utilisées sont fournies dans le manuscrit ou dans les informations supplémentaires. Les données brutes des échantillons cliniques sont fournies en tant que données sources. Tous les ensembles de données bruts et analysés générés au cours de cette étude sont disponibles à des fins de recherche auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code utilisé pour contrôler le matériel d'imagerie est disponible en tant qu'informations supplémentaires.

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Nous remercions tous les membres des laboratoires Hsu, Savage, Fletcher et Doudna pour leur soutien et leurs conseils, et AJ Ehrenberg, E. Charles et B. Thornton pour des discussions utiles. Nous remercions M. Ott et R. Kumar pour leur aide dans la coordination de la collecte d'échantillons de salive naturelle. Ce travail a été soutenu par la Fondation Shurl & Kay Curci, des donateurs anonymes, Emergent Ventures, les National Institutes of Health (NIH) et la DARPA sous le prix N66001-20-2-4033. Les points de vue, opinions et/ou conclusions exprimés sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant les points de vue ou politiques officiels du ministère de la Défense ou du gouvernement américain. Nous remercions les NIH pour leur soutien (PDH R01GM131073, DP5OD021369 et DFS R01GM127463). JAD est chercheur au Howard Hughes Medical Institute (HHMI). AF a été soutenu par une bourse de recherche de troisième cycle de la NSF.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid.

Département de bioingénierie, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Maria Diaz de Leon Derby, Andrew R. Harris, Liana F. Lareau, Daniel A. Fletcher et Patrick D. Hsu

Innovative Genomics Institute, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Noam Prywes, Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Qi Dang, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Jennifer R. Hamilton, Henry Lin-Shiao, Elizabeth C. Stahl, Connor A. Tsuchida, Peter Giannikopoulos, Matthew McElroy, Shana McDevitt, Arielle Zur, Iman Sylvain, Alison Ciling, Madeleine Zhu, Clara Williams, Alisha Baldwin, Erica A. Moehle, Liana F. Lareau, Jennifer A. Doudna & Patrick D. Hsu

University of California, Berkeley–University of California, San Francisco Graduate Program in Bioengineering, Berkeley, CA, États-Unis

Sita S. Chandrasekaran, Alison Fanton, Bérénice Charrez, Abdul Bhuiya & María Díaz de León Derby

Wainamics Inc., Pleasanton, Californie, États-Unis

Arthur M. Escajeda, Roger Mcintosh, Huyen Tran et Ming X. Tan

Département de physique et d'astronomie, Université d'État de San José, San José, Californie, États-Unis

Neil A. Switz

Division de biophysique moléculaire et de bioimagerie intégrée, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, Californie, États-Unis

Maxim Armstrong et Jennifer A. Doudna

Département de biologie moléculaire et cellulaire, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Erik Van Dis, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Sarah A. Stanley, Jennifer A. Doudna et David F. Savage

Division des maladies infectieuses et de la vaccinologie, École de santé publique, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Scott B. Biering et Eva Harris

Centre de biologie computationnelle, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Amanda Mock

Monash Biomedicine Discovery Institute, Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université Monash, Clayton, Victoria, Australie

Gavin J. Knott

Centre de recherche environnementale et de santé communautaire (CERCH), École de santé publique, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Katherine Kogut et Brenda Eskenazi

École de santé publique, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Sarah A. Stanley

Howard Hughes Medical Institute, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Jennifer A. Doudna

Département de chimie, Université de Californie, Berkeley, Berkeley, Californie, États-Unis

Jennifer A. Doudna

Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology, Gladstone Institutes, San Francisco, Californie, États-Unis

Jennifer A. Doudna

Arc Institute, Palo Alto, Californie, États-Unis

Patrick D. Hsu

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SSC, SA, AF, ARJ ont conçu et réalisé des expériences, analysé les données et préparé le manuscrit. PDH a conçu le projet, conçu des expériences, assuré la supervision générale de ce travail et rédigé le manuscrit, avec la contribution de tous les auteurs. DFS et JAD ont fourni une contribution expérimentale, édité le manuscrit et co-supervisé ce travail. BC a fourni une expertise microfluidique et édité le manuscrit. AME, HT, RM et MXT ont conçu et construit la cartouche microfluidique et l'instrument de diagnostic. SS, AB, NAS, MA, ARH et MDdLD ont conçu et construit l'instrument optique intégré au dispositif microfluidique, sous la supervision du DAFNP, ont édité le manuscrit et, avec ML, ont contribué à la conception expérimentale. QD a effectué des expériences de quantification standard. DCJS, TYL et GJK ont purifié des protéines pour des essais et, avec ED et SK, ont fourni une expertise biochimique. AM a développé des méthodes de calcul pour la sélection d'ARN guide avec LFL, et SBB et EVD ont effectué des travaux BSL-3 sous la supervision d'EH et SAS Le consortium de test IGI (JRH, EL-S., ECS, CAT, PG, MM, SM, AZ, IS, AC, MC et CW) ont effectué des tests qPCR de diagnostic sur les échantillons d'écouvillons respiratoires. EAM, KK et BE ont coordonné la collecte des échantillons de salive dans l'étude sur les ouvriers agricoles de la vallée de Salinas.

Correspondance avec Jennifer A. Doudna, David F. Savage ou Patrick D. Hsu.

Les régents de l'Université de Californie et Wainamics ont déposé des brevets liés à ce travail. PDH est co-fondateur de Spotlight Therapeutics et Moment Biosciences et siège au conseil d'administration et au conseil consultatif scientifique, et est membre du conseil consultatif scientifique de Vial Health et Serotiny. DFS est co-fondateur de Scribe Therapeutics et membre du conseil consultatif scientifique de Scribe Therapeutics et Mammoth Biosciences. JAD est co-fondateur de Caribou Biosciences, Editas Medicine, Scribe Therapeutics et Mammoth Biosciences. JAD est membre du conseil consultatif scientifique de Caribou Biosciences, Intellia Therapeutics, eFFECTOR Therapeutics, Scribe Therapeutics, Mammoth Biosciences, Synthego, Algen Biotechnologies, Felix Biosciences et Inari. JAD est directeur chez Johnson & Johnson et a des projets de recherche parrainés par Biogen, Pfizer, AppleTree Partners et Roche. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biomedical Engineering remercie Jin Wang et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Les amorces FIP et BIP, assistées par les amorces F3 et B3 à XX, se lient à l'ADN cible en F2c et B2c, ajoutant des régions complémentaires d'ADN à l'amplicon (F1c et B1c). Leur complémentarité avec F1 et B1 se traduit par des structures en boucle, qui facilitent davantage la liaison de FIP et BIP au niveau des boucles (F2c et B2c) et l'extension, amplifiant la cible via la formation de concatémères longs. Les amorces Floop et Bloop peuvent en outre se lier aux boucles et s'étendre, augmentant encore l'amplification. L'ajout du promoteur T7 à l'extrémité 5' de l'amorce de boucle fournit un substrat pour la polymérase T7 à transcrire, résultant en un produit d'ARN contenant des répétitions inversées de l'amplicon cible.

(a) Écran des ensembles d'amorces de contrôle de processus sur des échantillons de salive commerciaux. ( b ) Dépistage des emplacements du promoteur T7 sur l'ensemble d'amorces ACTB sur l'extrait d'ARN et les échantillons de salive commerciaux. (c) Schéma de la conception de la cartouche. La réaction peut être séparée en trois étapes : 1. réaction d'amplification ; 2. mesure post-amplification + mélange Cas13 ; 3. Réaction Cas13 dans les chambres de détection. Les réactifs stockés sur la cartouche sont séparés via une solution hydrophobe exclusive pour éviter l'initiation prématurée des réactions. Après la réaction LAMP, l'échantillon est divisé en deux réactions : la partie gauche de la cartouche exposera l'échantillon au crRNA du gène N (étape 2a) tandis que le côté droit de la cartouche servira de contrôle interne avec uniquement le crRNA ACTB (étape 2b ). (d) Résultats de DISCoVER à bord sur 25 échantillons de salive individuels (20 échantillons avec de l'ARN génomique du SARS-CoV-2 à 500 cp/μL, 5 échantillons négatifs attendus). Une augmentation de fluorescence de 2 fois par rapport aux cartouches vierges à 10 minutes était le critère déterminé expérimentalement pour des résultats positifs. Les échantillons dont la valeur était inférieure à ce seuil à 10 minutes ont été déclarés négatifs.

Tableaux supplémentaires, figures et légende vidéo.

Séquences pour LAMP, rLAMP, RT–qPCR et Cas13.

Démonstration du flux de travail DISCoVER.

Script MATLAB pour le contrôle du matériel d'imagerie.

Données sources pour les Fig. 5c,d et 7d.

Springer Nature ou son concédant détient les droits exclusifs sur cet article en vertu d'un accord de publication avec l'auteur ou les autres titulaires de droits ; l'auto-archivage par l'auteur de la version manuscrite acceptée de cet article est uniquement régi par les termes de cet accord de publication et la loi applicable.

Réimpressions et autorisations

Chandrasekaran, SS, Agrawal, S., Fanton, A. et al. Détection rapide de l'ARN du SRAS-CoV-2 dans la salive via Cas13. Nat. Biomédical. Eng 6, 944–956 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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Reçu : 01 décembre 2020

Accepté : 30 juin 2022

Publié: 11 août 2022

Date d'émission : août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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