Endocytose

Oct 21, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5524 (2022) Citer cet article

7573 Accès

3 Citations

109 Altmétrique

Détails des métriques

On pense généralement que le transfert horizontal de gènes dans les bactéries se produit par conjugaison, transduction et transformation. Ces mécanismes facilitent le passage de l'ADN à travers la paroi cellulaire protectrice à l'aide de machines sophistiquées. Ici, nous rapportons que les bactéries déficientes en paroi cellulaire peuvent engloutir l'ADN et d'autres matériaux extracellulaires via un processus de type endocytose. Plus précisément, nous montrons que les formes L de l'actinomycète filamenteux Kitasatospora viridifaciens peuvent absorber l'ADN plasmidique, les polysaccharides (dextrane) et les nanoparticules lipidiques de 150 nm. Le processus implique l'invagination de la membrane cytoplasmique, conduisant à la formation de vésicules intracellulaires qui encapsulent le matériel extracellulaire. L'absorption d'ADN n'est pas affectée par la suppression de gènes homologues à comEC et comEA, qui sont nécessaires à la transformation naturelle chez d'autres espèces. Cependant, l'absorption est inhibée par l'azoture de sodium ou l'incubation à 4 °C, ce qui suggère que le processus dépend de l'énergie. Les matériaux encapsulés sont libérés dans le cytoplasme lors de la dégradation de la membrane de la vésicule. Étant donné que les bactéries déficientes en paroi cellulaire sont considérées comme un modèle pour les premières formes de vie, nos travaux révèlent un mécanisme possible permettant aux cellules primordiales d'acquérir de la nourriture ou du matériel génétique avant l'invention de la paroi cellulaire bactérienne.

Les bactéries sont constamment exposées à des conditions environnementales changeantes et dépendent de leur enveloppe cellulaire pour se protéger. L'enveloppe cellulaire se compose d'une membrane cellulaire et d'une paroi cellulaire pour séparer l'environnement interne de l'environnement externe. La membrane cellulaire est une bicouche phospholipidique qui renferme le cytoplasme et fonctionne comme une barrière sélective. La paroi cellulaire est constituée d'une couche épaisse de peptidoglycane (PG) pour les bactéries Gram-positives et d'une couche plus fine de PG entourée d'une membrane externe pour les bactéries Gram-négatives. La couche de peptidoglycane est une structure importante en forme de maille qui non seulement offre une protection contre les contraintes mécaniques et la pression de turgescence, mais définit également la forme et la rigidité des cellules.

Pour faciliter le passage sélectif des macromolécules à travers l'enveloppe cellulaire, les bactéries ont développé des systèmes de transport spécialisés et sophistiqués1. Par exemple, les bactéries naturellement transformables reposent sur des complexes protéiques pour l'absorption d'ADN, avec des composants similaires aux pili de type IV ou aux systèmes de sécrétion de type II. Le transport actif de l'ADN à travers la paroi cellulaire est facilité par la rétraction des structures pilus qui se lient à l'ADN2,3. Les protéines de liaison à l'ADN et de formation de pores sont ensuite utilisées pour déplacer l'ADN à travers la membrane cellulaire.

Bien que la paroi cellulaire soit une structure vitale pour la plupart des bactéries, certaines bactéries manquent naturellement de paroi cellulaire ou peuvent perdre leur paroi dans des conditions spécifiques. Les exemples incluent les membres des Mollicutes, qui sont des parasites et vivent dans des environnements protecteurs osmotiquement spécifiques tels que les surfaces muqueuses humaines ou les tubes tamis du phloème des plantes4. Une exposition prolongée à des facteurs de stress environnementaux tels que des agents ciblant les parois cellulaires génère ce que l'on appelle des formes L, qui sont des cellules qui peuvent proliférer sans leurs parois cellulaires. La reproduction des formes L est indépendante de la machinerie de division canonique basée sur FtsZ et est entraînée par un déséquilibre du rapport surface / volume des cellules causé par la régulation à la hausse de la synthèse membranaire conduisant à un saignement, une tabulation et une vésiculation spontanés. Ces caractéristiques cellulaires primitives font des formes L un système modèle attrayant pour étudier l'évolution du début de la vie8,9.

Certains actinomycètes filamenteux, tels que le Kitasatospora viridifaciens formant du mycélium, ont la capacité de perdre leur paroi cellulaire de manière transitoire dans des conditions de stress hyperosmotique (Fig. 1a)7. Contrairement aux formes L, les cellules S ne sont pas capables de proliférer sans leur paroi cellulaire, bien que ces cellules soient capables de revenir au mode de croissance mycélienne après avoir reconstruit leur paroi cellulaire. Des cellules temporairement déficientes en paroi cellulaire peuvent également être générées artificiellement à partir de bactéries à paroi via l'élimination enzymatique de la paroi cellulaire, par exemple, par l'action du lysozyme qui dégrade le peptidoglycane. Cela conduit à la formation de protoplastes ou de sphéroplastes, qui sont largement utilisés à des fins de génie génétique, impliquant souvent l'utilisation de polyéthylène glycol (PEG) pour permettre l'entrée de l'ADN dans la cellule10. Bien que cette transformation à base de PEG soit une technique largement utilisée pour la transformation des actinomycètes filamenteux, il n'a jamais été démontré sans ambiguïté si les cellules à paroi de K. viridifaciens, ou ses cellules naturelles déficientes en paroi cellulaire, sont capables de transformation génétique naturelle sans utiliser de PEG. La manière dont l'absence de paroi cellulaire affecte l'absorption naturelle de macromolécules telles que l'ADN de l'environnement est inconnue.

a Représentation schématique de la génération de cellules déficientes en paroi cellulaire de K. viridifaciens. Les cellules temporairement déficientes en paroi comprennent les protoplastes, obtenus à partir de cellules mycéliennes par l'action du lysozyme, et les cellules S, extrudées à partir des extrémités des hyphes dans un milieu à haute pression osmotique. Des formes L à paroi déficiente en permanence sont générées après une incubation prolongée du mycélium sous une pression osmotique élevée (ligne M1), avec la supplémentation facultative de lysozyme (Lys) et de pénicilline G (PenG) (lignes alpha et delta). b Mycélium (n = 3), protoplastes (n = 5 à partir de deux expériences), cellules S (n = 7 à partir de deux expériences) et lignées de forme L alpha (n = 3 pour les cellules âgées de 4 et 6 jours ), delta (n = 2 pour les cellules âgées de 3 et 7 jours) et M1 (n = 1 pour les cellules âgées de 3 jours) ont été incubés avec de l'ADN plasmidique (pRed*) pendant 18 à 24 h, étalés sur milieu sélectif et incubé à 30 °C pour sélectionner les cellules transformées. Un gros plan de la morphologie de la colonie des formes L est donné. Les barres d'échelle indiquent 1 mm. Notez que seules les formes L montrent une absorption d'ADN cohérente. c Efficacité de transformation à base de polyéthylène glycol (PEG) du mycélium, des protoplastes, des cellules S et des formes L de K. viridifaciens à l'aide d'ADN plasmidique (pRed*) comme indiqué en pourcentage de colonies transformées. n = 3 répétitions biologiques sauf pour les cellules S (n = 4). d Efficacité de transformation d'alpha et alphaΔcomEA/EC âgés de 7 jours après incubation de 24 h avec pFL-ssgB. UFC = unités formant colonie. ns = non significatif (n = 5 répétitions biologiques, test t indépendant bilatéral, t(8)=1,572, P = 0,155). e Efficacité de transformation d'alpha de 1, 3 et 7 jours après 24 h d'incubation avec pFL-ssgB. Les astérisques (**) indiquent P ≤ 0,01 (n = 4 répétitions biologiques, ANOVA unidirectionnelle, F (2, 9) = 12,16, test post hoc de Tukey, P = 0,006 (1–3 jours) et 0,005 (1–7 jour)). f Efficacité de transformation d'alpha âgé de 7 jours incubé avec pRed* pendant 6, 24 ou 48 h. L'astérisque (*) indique une différence statistiquement significative entre 6 et 24 h d'incubation (test bilatéral de Kruskal-Wallis, H(2) = 8,769, P = 0,012 avec le test par paires de Dunn, y compris la correction de Bonferroni, donne P = 0,010 pour 6 et 24 h, P = 0,233 pour 6 et 48 h et P = 0,718 pour 24 et 48 h). ns non significatif. n = 4 répétitions biologiques. g Polarisation généralisée (GP) en tant que mesure de la fluidité membranaire de l'alpha de 1, 3 et 7 jours à l'aide du colorant membranaire Laurdan. Un GP inférieur indique une fluidité membranaire plus élevée. n = 3 répétitions biologiques. Les données en (c – g) sont représentées sous forme de moyenne ± SD avec des points de données individuels. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Dans ce travail, nous montrons que les formes L de l'actinomycète filamenteux K. viridifaciens peuvent absorber l'ADN indépendamment de la machinerie de transformation génétique naturelle canonique. Au lieu de cela, l'absorption est facilitée par un mécanisme de transfert horizontal de gènes qui implique l'invagination de la membrane cellulaire conduisant à la formation de vésicules internes. De plus, nous montrons que ce mécanisme est robuste et permet également l'absorption non spécifique d'autres macromolécules de l'environnement. Étant donné que les formes L sont considérées comme un modèle de la vie cellulaire précoce, notre travail donne un aperçu de la façon dont ces cellules anciennes peuvent avoir acquis de grandes biomolécules et nanoparticules de l'environnement sans avoir besoin de machines de transport complexes.

On ne sait pas si les cellules à paroi ou sans paroi de K. viridifaciens sont capables de transformation génétique naturelle. Pour analyser cela, des cellules mycéliennes à paroi, des cellules S et des protoplastes temporaires sans paroi et des formes L (alpha) sans paroi en permanence ont été fraîchement récoltées et remises en suspension dans un milieu LPB osmotiquement stable. Par la suite, les cellules ont été incubées pendant 18 à 24 h avec de l'ADN plasmidique (pRed*) contenant une cassette de résistance aux antibiotiques et étalées sur des milieux sélectifs et non sélectifs pour permettre la détection des cellules transformées. Notamment, les formes L étaient systématiquement capables d'absorber l'ADN, contrairement au mycélium, aux protoplastes et aux cellules S (Fig. 1b). L'absorption d'ADN n'était pas limitée à une lignée de forme L, mais a été observée avec des lignées cellulaires de forme L distinctes obtenues à partir de cellules à paroi de K. viridifaciens cultivées dans un milieu LPB avec (lignes alpha et delta) ou sans (ligne M1) pénicilline et lysozyme7 ,11. Aucun transformant n'a été obtenu avec alpha lorsque de l'ADN génomique intact ou fragmenté a été utilisé, ou lors de l'utilisation d'un plasmide méthylé (Fig. 1a, b supplémentaires). Alors que la transformation génétique naturelle était limitée aux formes L, toutes les cellules déficientes en paroi pouvaient être transformées chimiquement à l'aide de polyéthylène glycol (PEG), les protoplastes, les cellules S et les formes L ayant une efficacité de transformation moyenne comprise entre 1, 7 et 2, 5% (Fig. 1c). L'ajout de PEG a également permis la transformation d'alpha avec de l'ADN génomique, même s'il était présent dans un extrait cellulaire brut (Fig. 1c supplémentaire). D'autre part, l'utilisation d'ADN méthylé a empêché la transformation chimique, indiquant que la transformation à base de PEG est possible avec différents types d'ADN, mais est limitée par la présence d'un schéma de méthylation différent. En revanche, les cellules à paroi ne pouvaient pas être transformées avec ou sans PEG (Fig. 1b, c). Ces résultats montrent que dans ces conditions, les formes L peuvent capter naturellement l'ADN, contrairement aux cellules à paroi, aux cellules S et aux protoplastes.

Les bactéries naturellement transformables utilisent une machinerie spécialisée de translocation d'ADN présentant des similitudes avec les pili de type IV ou les systèmes de sécrétion de type II pour absorber l'ADN externe2. Des composants similaires de ce système canonique pourraient également être impliqués dans l'absorption d'ADN par les formes L. Une recherche BlastP utilisant la protéine de liaison à l'ADN ComEA et la protéine de canal ComEC de la bactérie naturellement transformable Bacillus subtilis str. 168 contre K. viridifaciens a donné deux résultats significatifs : BOQ63_029625 (protéine contenant le domaine hélice-épingle à cheveux-hélice) et BOQ63_029630 (protéine de compétence de la famille ComEC/Rec2), respectivement (Tableau supplémentaire 1 et Fig. 1d supplémentaire). L'hélicase/translocase d'ADN de B. subtilis ComFA a entraîné une atteinte à un gène putatif codant pour Mfd (BOQ63_020315), une protéine bactérienne largement conservée qui intervient dans la réparation de l'ADN couplée à la transcription12. Aucun autre orthologue n'a été trouvé corrélé aux protéines impliquées dans le transport de l'ADN à travers l'enveloppe cellulaire pour B. subtilis, Neisseria gonorrhoeae à Gram négatif13 ou pour le système d'absorption d'ADN lié au T4SS de Helicobacter pylori14 (tableau supplémentaire 1). Les formes L n'ont pas de paroi cellulaire intacte à base de peptidoglycane et, par conséquent, l'ADN ne doit traverser la membrane cellulaire que pour l'internalisation. Dans les bactéries naturellement transformables, la ComEA et la ComEC fonctionnent dans le transport de l'ADN à travers la membrane cellulaire13,15,16. Bien que le rôle des gènes putatifs comEC et comEA chez K. viridifaciens soit inconnu, comme ses cellules à paroi ne montraient pas d'absorption d'ADN, nous nous sommes demandé si ces protéines pouvaient être impliquées dans l'absorption d'ADN dans les formes L. Par conséquent, nous avons remplacé les gènes putatifs comEC et comEA dans la souche alpha de forme L par une cassette de résistance à l'apramycine (Fig. 1d, e supplémentaire). De manière frappante, la suppression simultanée des gènes comEA et comEC n'a pas affecté l'efficacité de la transformation (test t indépendant bilatéral, t(8) = 1,572, P = 0,155), indiquant que l'absorption d'ADN par les formes L se produit indépendamment des gènes homologue à cette machinerie canonique de translocation d'ADN (Fig. 1d).

La capacité à absorber l'ADN pour la transformation naturelle est régulée différemment parmi les bactéries naturellement transformables et peut être constitutivement active ou limitée à une phase de croissance spécifique, comme l'a examiné Blokesch (2016)17. L'un des facteurs contrôlant le développement de la compétence pour l'absorption d'ADN chez B. subtilis est la phase de croissance18,19. Pour étudier si l'âge de la culture affecte également la capacité d'absorption d'ADN des formes L, des cellules de cultures d'âges différents ont été soumises à un test de transformation. Les cellules de cultures d'alpha âgées de 1 jour absorbent plus facilement l'ADN que celles de cultures âgées de 3 ou 7 jours (ANOVA unidirectionnelle, F (2,9) = 12,16, test post hoc de Tukey, P = 0,006 et 0,005 respectivement) (Fig. 1e). Pour tester si des temps d'incubation plus courts ou plus longs affectent l'absorption d'ADN, l'efficacité de transformation de l'alpha de 7 jours a été déterminée après 6, 24 et 48 heures d'incubation avec de l'ADN (Fig. 1f). La transformation a été détectée après 6 h d'incubation et a augmenté après 24 h (test de Kruskal-Wallis bilatéral, H(2) = 8,769, P = 0,012 et le test par paires de Dunn avec correction de Bonferroni donne P = 0,010 pour 6 et 24 h, P = 0,233 pour 6 et 48 h, et P = 0,718 pour 24 et 48 h). Il n'est pas improbable que des différences dans les propriétés membranaires qui se produisent pendant la croissance cellulaire puissent à leur tour affecter la capacité d'absorption de l'ADN. La fluidité membranaire est une mesure de la viscosité moyenne de la bicouche lipidique, qui peut affecter le positionnement et le mouvement des protéines et des lipides dans la membrane20. Une fluidité membranaire plus élevée est caractérisée par un désordre accru des acides gras, un tassement lipidique plus faible et des taux de diffusion plus élevés, ce qui peut entraîner une perméabilisation accrue de la membrane21,22. L'analyse de la fluidité membranaire des cultures d'âge différent a indiqué que la capacité accrue d'absorption d'ADN peut être corrélée positivement avec la fluidité de la membrane, comme déduit de la polarisation généralisée (GP, un GP inférieur indiquant une fluidité plus élevée)23 (Fig. 1g), bien qu'aucune différence statistiquement significative n'ait été observée (analyse de variance unidirectionnelle de Welch, F(2, 2,798) = 13,226, P = 0,038, avec test post hoc de Games-Howell : 1 à 3 jours P = 0,068 ; 1 à 7 jours P = 0,134 ; 3–7 jours P = 0,711, n = 3). Une fluidité relativement faible pourrait expliquer pourquoi les protoplastes et les cellules S temporairement déficients en paroi ne peuvent pas absorber l'ADN naturellement. Cependant, la fluidité des protoplastes se situait dans la plage des cultures âgées de 1 à 7 jours, mesurée à l'aide d'un test sur plaque (Fig. 2a supplémentaire). Une analyse ultérieure du GP par imagerie par microscopie à fluorescence a montré que bien que les protoplastes et les cellules S aient tendance à avoir moins de membranes fluides, ces valeurs restent dans la plage de fluidité membranaire des formes L âgées de 1 à 7 jours (Fig. 2b). Par conséquent, bien que la fluidité membranaire puisse contribuer à une absorption efficace de l'ADN, elle n'est pas suffisante pour expliquer ce processus.

Pour étudier plus avant le mécanisme facilitant l'absorption d'ADN par les formes L, nous avons ajouté de l'ADN plasmidique marqué au Cy5 aux formes L exprimant l'eGFP cytoplasmique. Après 3 jours d'incubation, de l'ADN plasmidique marqué a été trouvé soit à l'extérieur de la membrane cellulaire en forme de L, soit dans une vésicule interne apparente (Fig. 2a, Film supplémentaire 1 et Contrôle supplémentaire Fig. 3a). Comme ces vésicules internes étaient dépourvues d'eGFP, nous avons pensé qu'elles pouvaient provenir d'un processus d'invagination de la membrane, par lequel le matériel extracellulaire est piégé à l'intérieur des vésicules. Pour tester cela directement, nous avons incubé des formes L exprimant eGFP avec le colorant fluorescent SynapseRed C2M (SynapseRed). Étant donné que les colorants styryle, tels que SynapseRed (équivalent à FM5-95), ne peuvent pas diffuser à travers les membranes cellulaires24,25, tout signal fluorescent sur les membranes entourant les vésicules internes serait un argument fort que ces vésicules sont dérivées de la membrane cellulaire. En effet, il a été constaté que SynapseRed colorait non seulement la membrane cellulaire des formes L, mais également les membranes des vésicules internes après une nuit d'incubation (Fig. 2b). La coloration avec SYTO 9 a en outre indiqué que l'ADN chromosomique était présent dans le cytoplasme mais pas à l'intérieur des vésicules internes (Fig. 2c). L'incubation de protoplastes produisant de l'eGFP cytoplasmique avec SynapseRed a montré que les zones avec moins de fluorescence d'eGFP cytoplasmique étaient causées par la présence de structures membranaires internes plutôt que par la formation de vésicules internes (Fig. 2d). Une incubation similaire de cellules S a montré la présence de structures ressemblant à des vésicules internes dépourvues d'eGFP cytoplasmique. Cependant, contrairement aux formes L, la coloration ultérieure des cellules S qui produisent mCherry cytoplasmique avec SYTO 9 a indiqué que ces régions sombres étaient remplies d'ADN chromosomique. Comme SynapseRed est un colorant imperméable à la membrane, la coloration des structures membranaires dans les cellules S peut refléter une perméabilité membranaire accrue au lieu d'une coloration due à l'invagination de la membrane cellulaire. Pour tester la diffusion du colorant à travers la membrane cellulaire, les formes L et les cellules S ont été incubées avec SynapseRed à 30 ° C et à 4 ° C pour permettre et empêcher une éventuelle invagination de la membrane, respectivement. Alors que la membrane interne était colorée dans les cellules S à 30 ° C et à 4 ° C, cela n'a été observé qu'à 30 ° C pour les formes L (Fig. 3b supplémentaire). Cela suggère que la coloration d'une membrane dans les cellules S par SynapseRed est due à la perméabilité de la membrane cellulaire pour le colorant, contrairement aux formes L, dans lesquelles la coloration est le résultat de l'invagination de la membrane cellulaire.

une micrographie de fluorescence représentative d'alpha pIJ82-GFP (eGFP cytoplasmique; vert) incubée avec de l'ADN plasmidique marqué au Cy5 (pFL-ssgB; magenta) pendant 3 jours (n = 3 observations d'une expérience). Fond clair BF. Voir également le film supplémentaire 1. b Incubation d'alpha pIJ82-GFP après une nuit d'incubation avec le colorant imperméable à la membrane SynapseRed C2M (SynapseRed; magenta), montrant deux tranches z à différentes hauteurs d'une cellule en forme de L. Une micrographie représentative de six observations d'une expérience est montrée. c Micrographie représentative de alpha (n = 7 observations d'une incubation) et alpha pRed* (n = 9 observations d'une incubation) colorées avec SYTO 9 (vert) pour indiquer l'ADN chromosomique. alpha est coloré avec SynapseRed C2M (SynapseRed ; magenta) pour visualiser les membranes cellulaires, tandis que (l'absence de) mCherry cytoplasmique pour alpha pRed* (magenta) indique la présence d'une vésicule interne. Les cellules ont été imagées directement après l'ajout des colorants fluorescents. d Images représentatives de protoplastes et de cellules S de K. viridifaciens pIJ82-GFP produisant de l'eGFP cytoplasmique incubé avec SynapseRed (SR) pendant 72 h (rangées du haut, au moins six observations de deux expériences indépendantes avec des cellules S et des protoplastes), et S -cellules de K. viridifaciens pRed* produisant mCherry cytoplasmique incubées avec SynapseRed et SYTO 9 pendant 72 h (rangée du bas, trois observations d'une expérience). Notez que la présence de structures membranaires internes et/ou d'ADN peut entraîner une réduction de l'émission de fluorescence cytoplasmique. e Images fixes d'une expérience d'imagerie accélérée de 950 min de DivIVA-eGFP produisant de l'alpha (alpha pKR2) (vert) incubée avec 3 kDa Dextran-Texas Red (D-TR ; magenta) (n = 1). Les flèches indiquent la localisation de DivIVA-eGFP. Voir également le film supplémentaire 2. f Micrographie représentative de la formation de foyers et de structures annulaires de DivIVA-eGFP dans alpha pKR2 (vert) après une nuit d'incubation avec D-TR (magenta) (plus de 50 observations d'une expérience). Notez que les formes L sont capables d'absorber l'ADN et le dextrane colorés par fluorescence par la formation de vésicules internes. g Efficacité de transformation d'alpha et d'alphaΔdivIVA âgés de 7 jours à l'aide de pFL-ssgB. ns non significatif (test t bilatéral indépendant, t(8) = 0,489, P = 0,638). Unités formant des colonies d'UFC. Les données ont été représentées sous forme de moyenne ± SD avec des points de données individuels, n = 5 répétitions biologiques. h Les formes L sans DivIVA peuvent produire des vésicules internes comme indiqué pour l'alphaΔdivIVA pIJ82-GFP âgé de 5 jours produisant de l'eGFP cytoplasmique (n = 2 observations d'une culture). Les barres d'échelle indiquent 2 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour comparer la présence de structures de vésicules internes putatives dans les différents types de cellules, le pourcentage de formes L, de protoplastes et de cellules S avec ces structures a été quantifié. Les cellules produisant mCherry cytoplasmique (alpha pRed* ou cellules S et protoplastes dérivés de K. viridifaciens pRed*) ont été incubées avec SynapseRed pendant 0 et 3 jours pour colorer les membranes. L'ADN a été visualisé avec SYTO 9 avant l'imagerie. Le nombre de cellules avec des régions dépourvues d'émission de fluorescence du cytoplasme, de l'ADN et de la membrane, ce qui pourrait indiquer la présence de vésicules internes, a été quantifié (tableau supplémentaire 2). En utilisant cette méthode, les formes L ont une occurrence environ 6 à 11 fois plus élevée de ces régions que les cellules S (formes L : 24,5 et 14,7 % ; cellules S : 2,2 et 2,6 % après 0 et 3 jours d'incubation, respectivement), et des vésicules putatives ont été rarement observées pour les protoplastes (<0,5 %). Si ces régions dans les cellules S et les protoplastes étaient de véritables vésicules internes, leur présence n'est probablement pas suffisante pour détecter une transformation cohérente avec l'ADN. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que les vésicules observées à l'intérieur des formes L proviennent de l'invagination de la membrane cellulaire, par laquelle l'ADN extracellulaire peut être piégé à l'intérieur de ces vésicules, alors que cela n'est pas évident pour les cellules S et les protoplastes.

Chez les eucaryotes, l'endocytose est un processus qui permet l'absorption de cargaison externe via la formation de vésicules internes, qui est finalement dégradée ou recyclée26,27. Les dextranes marqués par fluorescence sont largement utilisés comme marqueurs de l'endocytose chez les eucaryotes car ils ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire28,29. Pour déterminer si un tel processus de type endocytose pourrait être présent dans les formes L et pour visualiser l'absorption de matériaux externes, nous avons incubé les cellules avec du Dextran-Texas Red (D-TR) et effectué une imagerie en accéléré. La souche de forme L utilisée exprime également DivIVA-eGFP, qui a une forte affinité pour les régions membranaires à courbure négative (alpha pKR2)30. On s'attend à ce que de telles régions se forment lors de l'invagination de la membrane. Après 290 minutes d'incubation, D-TR était visible à l'intérieur de la forme L et des points faibles de DivIVA-eGFP ont commencé à apparaître à côté de cette région (Fig. 2e et Film supplémentaire 2). Cela a progressé vers un renflement clair vers l'intérieur de la membrane cellulaire avec deux foyers de DivIVA-eGFP de chaque côté de la membrane invaginée et un afflux de D-TR (t = 560 min). Après 640 minutes, une vésicule interne contenant du D-TR s'est formée. Dans d'autres cellules, DivIVA-eGFP semblait former une structure en forme d'anneau, qui enveloppait parfois la membrane d'invagination (Fig. 2f cellules 1 et 2). La présence de DivIVA près du site d'invagination implique la présence de régions à courbure négative dans la membrane. Notamment, DivIVA n'est pas nécessaire pour la formation de vésicules ou l'absorption d'ADN, car la suppression de divIVA (alphaΔdivIVA) n'a eu aucun effet sur la transformation (test t indépendant bilatéral, t (8) = 0, 489, P = 0, 638) (Fig. 2g ), et des vésicules internes étaient encore formées par cette souche (Fig. 2h). De plus, l'internalisation de D-TR a également été observée dans des formes L qui n'exprimaient pas DivIVA-eGFP, indiquant que l'absorption n'est pas une conséquence de la présence de la protéine de fusion (Fig. 3c supplémentaire). L'incubation de protoplastes et de cellules S avec du D-TR jusqu'à 72 h n'a pas entraîné d'encapsulation claire du D-TR dans les vésicules internes (Fig. 3d supplémentaire). Pour quantifier cela, les cellules produisant de l'eGFP cytoplasmique ont été incubées avec du D-TR ou du PBS pendant 72 h. Le pourcentage de cellules avec des régions dépourvues d'eGFP mais contenant du D-TR dans cette région a été compté. Une incubation répétée (en duplo) a entraîné une absorption de D-TR dans environ 6% des cellules de forme L et aucune absorption pour le contrôle avec du PBS (tableau supplémentaire 3). Aucune absorption nette n'a été observée pour les cellules S et les protoplastes incubés avec du D-TR par rapport aux cellules témoins incubées avec du PBS (cellules S : 0,9 et 1,7 % avec du D-TR contre 0 et 2,1 % avec du PBS ; protoplastes : 0 et 1,1 % avec D-TR versus 0 et 0,8% avec PBS). Au total, ces résultats montrent que l'invagination de la membrane cellulaire des formes L peut conduire à la formation de vésicules internes et peut représenter un mécanisme de type endocytose permettant l'absorption de molécules, y compris l'ADN, de l'environnement.

Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont des particules non virales utilisées pour délivrer des acides nucléiques et des médicaments aux cellules humaines par endocytose31. Les LNP n'ont pas de structure bicouche lipidique, mais consistent en un noyau hydrophobe dense aux électrons de lipides qui encapsulent les acides nucléiques par des interactions électrostatiques et sont entourés d'une couche de PEG-lipides31. Les LNP internalisés sont situés dans des endosomes qui sont des organites liés à la membrane de la voie endocytaire. L'acidification ultérieure amène les lipides ionisables des LNP à se charger positivement, ce qui permet au LNP de déstabiliser la membrane endosomale et de livrer sa cargaison dans la cellule. Les LNP peuvent également être marqués par fluorescence par l'incorporation de phospholipides conjugués à un fluorophore. Pour explorer davantage la capacité des formes L à absorber de grosses particules externes, les cellules ont été incubées avec des LNP marqués à la rhodamine (LNP-LR, contenant 18: 1 Liss Rhod PE) d'une taille moyenne de 150 nm, pour permettre leur détection à l'intérieur des formes en L. Après l'ajout de LNP-LR à des formes L âgées de 7 jours, un signal fluorescent clair, probablement généré par plusieurs particules de LNP, a pu être détecté à l'intérieur des cellules après une nuit d'incubation, ainsi que la localisation des LNP sur la membrane cellulaire (Fig. 3a et Supplémentaire Fig. 4a, b). Lorsque des formes L ont été utilisées pour produire de l'eGFP dans le cytoplasme, les vésicules ne contenaient que des LNP et non de l'eGFP, ce qui suggère fortement que les LNP avaient été internalisés dans des vésicules dépourvues de cytoplasme (Fig. 3b, c et contrôle d'imagerie Fig. 4c supplémentaire). Il est important de noter que l'ajout de l'azoture de sodium inhibiteur métabolique (1, 2, 5 ou 10 mM), qui cible la chaîne respiratoire32, ou l'incubation de cellules à 4 ° C a affecté la localisation de LNP-LR (Fig. 3d, e et Fig. . 4d–i). Ces conditions sont couramment utilisées pour inhiber l'endocytose en réprimant la production d'énergie33,34. Dans de telles conditions, les LNP semblaient se localiser sur la membrane cellulaire plutôt qu'à l'intérieur de la cellule. L'effet inhibiteur de l'azoture de sodium et de l'incubation à 4 ° C sur l'absorption de matériel extracellulaire par les formes L a été quantifié à l'aide de D-TR, car la capture de l'absorption de LNP-LR était trop rare pour être quantifiée avec précision. De manière frappante, une réduction significative de l'absorption de D-TR par les formes L a été observée en présence d'azoture de sodium 2,5 mM (5,9 % contre 1,9 % des cellules montrant l'absorption de D-TR pour le contrôle et l'azoture de sodium, respectivement (z- test, z = 3,111, P unilatéral <0,001), et l'incubation des formes L à 4 ° C a complètement inhibé l'absorption de D-TR (Fig. 3f).Ces résultats sont cohérents avec un processus d'absorption des formes L qui est dépendant de l'énergie, par lequel le matériau externe est intériorisé par un processus d'invagination membranaire.

a, b Micrographies représentatives de la localisation de LNP-LR (nanoparticules lipidiques contenant 18: 1 Liss Rhod PE; magenta) dans les vésicules internes de alpha (a; n = 5 observations) et alpha pIJ82-GFP (b; n = 2 observations) après une nuit et une incubation de 3 jours à 30 °C, respectivement. c Tracé du profil de densité des valeurs de gris (intensité des pixels) de la sélection de ligne correspondante d'alpha pIJ82-GFP (b) incubé avec LNP-LR montrant qu'une diminution de l'émission cytoplasmique d'eGFP est corrélée à une augmentation de l'émission LNP-LR. d, e Localisation du LNP-LR pendant l'incubation avec alpha à 4 °C (d) ou en présence d'azoture de sodium 2,5 mM (NaN3) à 30 °C (e) après 0, 24 et 48 h d'incubation . Des résultats similaires ont été obtenus avec de l'azide de sodium 1 et 10 mM (voir Fig. 4 supplémentaire). Des images ont été obtenues à partir d'une expérience. f Pourcentage de cellules alpha pIJ82-GFP présentant une absorption de Dextran-Texas Red (D-TR) après 3 jours d'incubation à 30 °C (témoin), en présence d'azide de sodium 2,5 mM (NaN3) ou incubées à 4 °C. Une réduction significative de l'absorption de D-TR a été observée pour l'azide de sodium (test z à deux proportions, z = 3,111, unilatéral, P = 0,00093) et après incubation à 4 ° C, aucune absorption n'a été détectée (ND). Les astérisques (***) indiquent P ≤ 0,001. Le pourcentage de cellules avec absorption de D-TR et le nombre total de cellules analysées sont donnés pour chaque condition et sont basés sur des comptages cellulaires combinés à partir de deux incubations répétées. Notez que l'incubation des formes L avec des nanoparticules lipidiques (taille moyenne de 150 nm) entraîne leur localisation à l'intérieur des vésicules internes, et que l'absorption de particules externes est inhibée par une incubation à 4 oC ou avec de l'azoture de sodium. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour mieux comprendre l'ultrastructure et la composition des vésicules intracellulaires, les formes L ont été imagées à l'aide de la lumière cryo-corrélative 3D et de la microscopie électronique (cryo-CLEM) (Fig. 4a). Cryo-FIB-SEM (microscopie électronique à balayage à faisceau ionique focalisé) permet l'imagerie 3D haute résolution des formes en L et des vésicules internes. La préparation et l'imagerie cryogéniques des échantillons garantissent que les formes L sont visualisées dans un état proche de l'état natif via une congélation rapide dans des conditions de haute pression qui permettent la transformation du liquide en glace amorphe35,36,37.

a Exemple de micrographies de fluorescence et d'électrons corrélées d'alpha pIJ82-GFP (image Zen Connect) réalisées avec toutes les cellules imagées. Une trame finderTOP visible à la fois en microscopie fluorescente et électronique facilite l'alignement entre les deux modules d'imagerie. Les carrés indiquent différentes régions d'intérêt, imagées à une résolution plus élevée. Faisceau d'ions focalisé FIB-SEM - microscopie électronique à balayage, lumière de fluorescence FL. b Exemple d'une image à plus haute résolution d'une région d'intérêt (ROI) sélectionnée, montrant de nombreuses cellules fluorescentes. c Micrographie de fluorescence de la forme L représentée par la boîte blanche en (b), montrant une sphère sombre intracellulaire (~ 1 μm, flèche blanche), comme cela a été effectué pour sélectionner toutes les cellules d'intérêt. Les flèches X, Y et Z dans (b–d) indiquent l'orientation 3D de la cellule imagée telle qu'observée dans le FIB-SEM 3D. d Image au microscope électronique à balayage (MEB) (SE, Inlens) de la cellule en (c) (taille ~ 6 μm) avec une flèche indiquant la vésicule interne (n = 1 cellule). e Superposition de cinq tranches consécutives (images rétrodiffusées) de la cellule en (d). Encart : tracé du profil de densité (blanc) des valeurs de gris moyennes (intensité des pixels) pour la région dans la boîte blanche (n = 1 cellule). f – i FIB-SEM tranches montrant différents types de vésicules internes de trois cellules imagées. Vésicules tapissant la membrane cellulaire des cellules d'une taille d'environ 3,5 μm (f, g). Les astérisques indiquent des vésicules dans (f, g). Complexe de vésicules (h) avec différentes épaisseurs de membrane de vésicules indiquées par des flèches blanches. Voir également la Fig. 7a supplémentaire et le film supplémentaire 3. (i) Saillies de la membrane comme indiqué par une flèche blanche. j–q Analyse des vésicules interconnectées de la cellule en (i) (n = 1). j–l Trois coupes consécutives montrant l'interaction de différentes vésicules. n – p montrent un grossissement plus élevé des régions dans les cases blanches en j – l, respectivement. m, q Segmentation 3D de n–p. Alors que certaines des vésicules sont intracellulaires, d'autres dépassent de la cellule. Une structure complète de vésicules connectées est représentée en vert (m, q) et indiquée par des flèches blanches (i, j, l, m). Voir la Fig. 7b – d supplémentaire et le film supplémentaire 4. La cellule dans les panneaux h – q mesure environ 4 μm. r – u Les régions avec un contraste différent (indiquées par des régions colorées) sont bordées de particules noires représentant des corps lipidiques putatifs comme indiqué pour une cellule (régions similaires observées dans trois cellules). Cette cellule a une taille d'environ 3,6 μm et se rapporte au panneau (g). La distribution en taille des particules noires est de 25 à 60 nm. Les barres d'échelle représentent 500 nm sauf indication contraire. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Après congélation à haute pression, des cellules avec des vésicules intracellulaires putatives ont été détectées sur la base de régions internes plus sombres dépourvues d'eGFP cytoplasmique à l'aide d'alpha pIJ82-GFP (Fig. 5 supplémentaire). Des formes L spécifiques (exemple de sélection sur les Fig. 4b, c) ont été imagées en détail à l'aide de cryo-FIB-SEM. La réduction de l'eGFP cytoplasmique correspondait en effet à la présence de vésicules internes détectées par FIB-SEM (Fig. 4c, d, flèche blanche), conformément aux résultats précédents (Fig. 2b). De plus, la composition du contenu du cytoplasme et des vésicules internes était différente, telle que mesurée à l'aide du détecteur à rétrodiffusion sélective d'énergie InLens (EsB) qui fournit un contraste basé sur la distribution des éléments plus lourds (Fig. 4e). L'analyse de l'intensité des pixels a indiqué que le niveau de contraste à l'intérieur de la vésicule interne était similaire à l'environnement extracellulaire, alors que le cytoplasme avait un contraste plus élevé. De plus, une expérience de surexposition a montré que la vésicule a la même capacité à absorber la dose d'électrons que le milieu extérieur, différente du reste de la cellule (Fig. 6a, b supplémentaires). Ces résultats confirment la découverte que les vésicules internes contiennent un milieu extracellulaire et sont formées par invagination membranaire (Fig. 2).

Une imagerie à haute résolution supplémentaire a indiqué la présence de plusieurs vésicules internes dans des cellules individuelles (Fig. 4f – i, Fig. 6c – e supplémentaire). La plupart des vésicules détectées tapissaient la membrane cellulaire (Fig. 4g et Supplémentaire Fig. 6c – e), variaient en taille et en épaisseur de membrane (Fig. 4h) et pouvaient même être présentes à l'intérieur de vésicules plus grandes (Fig. 4h et Supplémentaire Fig. 7a) . La présence de vésicules dans d'autres vésicules a également été observée en utilisant la microscopie à fluorescence (Fig. 3c supplémentaire, flèche blanche), montrant une vésicule non fluorescente dans une vésicule plus grande encapsulant D-TR. De plus, des vésicules ont pu être observées bourgeonnant hors de la membrane cellulaire (Fig. 4i). La reconstruction 3D des vésicules bourgeonnantes basée sur le traçage des contours a révélé qu'il s'agissait soit d'une extension d'une vésicule interne, soit qu'elles restaient connectées à des vésicules internes, formant un complexe (Fig. 4j – q, Supplémentaire Fig. 7a – d et Films supplémentaires 3 , 4).

Dans certains cas, les cellules contenaient des régions intracellulaires avec des valeurs de gris différentes du reste de la cellule (Fig. 4r – u). Ces régions avaient une distribution de taille de 300 à 800 nm, ne tapissaient pas la membrane cellulaire et étaient entourées de particules sombres d'environ 25 à 60 nm de diamètre. Il est possible que ces particules sombres soient des corps lipidiques, par rapport aux précédentes observations cryo-FIB-SEM38,39. Une interprétation potentielle est que les régions internes sont des vésicules dont la membrane lipidique englobante s'est partiellement dégradée. Les lipides et les produits de dégradation lipidique peuvent s'être accumulés dans des gouttelettes lipidiques qui se traduisent par les particules noires observées. Pour capturer la dégradation des vésicules internes, une imagerie accélérée pendant la nuit a été réalisée sur des formes L exprimant mCherry cytoplasmique (alpha pRed *). Les vésicules ont été identifiées par manque de mCherry cytoplasmique, et les cellules ont été imagées à différentes hauteurs Z pour confirmer que la vésicule n'avait pas simplement changé d'emplacement. Une rupture des vésicules a été observée à l'aide de formes L âgées de 2 jours remises en suspension dans du milieu LPB frais (film supplémentaire 5). Deux autres événements de perturbation des vésicules ont été capturés après avoir effectué un timelapse successif sur le même échantillon, mais avec des cellules différentes (films supplémentaires 6, 7). Toutes les vésicules imagées étaient déjà présentes dans les cellules au début du timelapse. Alors que le temps écoulé jusqu'à la rupture de la vésicule variait considérablement (après 1 h ou après 13 et 17 h pour la deuxième expérience), le processus de rupture lui-même s'est produit dans les 15 min, qui était l'intervalle de temps entre les images consécutives. Ces découvertes renforcent le modèle selon lequel les vésicules internes des formes L peuvent perturber et, de cette manière, libérer leur contenu dans le cytoplasme.

Ces résultats confirment en outre que les vésicules internes observées dans les formes L de K. viridifaciens contiennent un milieu externe et peuvent être formées par l'invagination de la membrane cellulaire. Les formes L peuvent contenir plusieurs vésicules de tailles variables, formant dans certains cas des grappes ou des complexes de vésicules qui peuvent dépasser de la membrane cellulaire. Les vésicules internes peuvent libérer leur contenu dans la cellule après la dégradation des vésicules. Ces découvertes soutiennent un modèle pour l'absorption de macromolécules telles que l'ADN par engloutissement, suivie de la libération de la cargaison après la rupture de la vésicule (Fig. 5).

L'invagination de la membrane cellulaire conduit à la formation de vésicules internes en forme de L. Lorsque la membrane cellulaire se gonfle vers l'intérieur, le liquide extracellulaire contenant de l'ADN ou d'autres macromolécules est englouti. Le mécanisme sous-jacent au processus d'invagination dépend de l'énergie et pourrait être basé sur une synthèse membranaire accrue et une fluidité membranaire élevée ou médié par des protéines similaires à celles impliquées dans l'endocytose eucaryote, telles que les protéines cytosquelettiques. L'ADN est libéré des vésicules internes par un processus inconnu (indiqué par une flèche en pointillés), qui peut impliquer une rupture des vésicules. Image créée avec BioRender.com.

La paroi cellulaire bactérienne est une importante barrière protectrice vis-à-vis de l'environnement, offrant une résistance au stress et permettant le passage sélectif des molécules. Cependant, ces dernières années, il est devenu clair que dans certaines conditions, les bactéries peuvent également prospérer sans cette couche. Une exposition prolongée à des stress environnementaux, tels que des agents ciblant la paroi cellulaire ou une pression osmotique élevée, peut induire la formation de formes L qui prolifèrent efficacement sans leur paroi cellulaire7. Les conséquences d'un tel mode de vie bactérien à paroi déficiente sur leur capacité à absorber l'ADN sont largement inconnues. Ici, nous apportons la preuve que les formes L peuvent absorber l'ADN et d'autres macromolécules via l'engloutissement et la formation ultérieure de vésicules internes (Fig. 5).

Les mécanismes bien connus de HGT sont la transformation naturelle, la transduction et la conjugaison40. Ces mécanismes nécessitent des machines sophistiquées pour permettre le transport de l'ADN à travers l'enveloppe cellulaire. Nous montrons ici que les cellules déficientes en paroi telles que les protoplastes, les cellules S et les formes L de K. viridifaciens absorbent l'ADN à l'aide de PEG. Il est important de noter que les formes L sont les seules cellules déficientes en paroi qui réalisent une transformation spontanée cohérente en utilisant de l'ADN plasmidique sans PEG. Aucune transformation n'a été observée lors de l'utilisation d'ADN génomique sans utiliser de PEG. Cela est probablement dû au nombre ~ 200 fois inférieur de molécules d'ADNg utilisées par rapport à l'ADN plasmidique, ainsi qu'à la nécessité d'une double recombinaison de l'ADN génomique avec le chromosome pour une intégration stable de la cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui conduit probablement à une moindre efficacité de transformation.

Les bactéries naturellement transformables utilisent un système canonique et complexe pour l'absorption d'ADN à travers la paroi cellulaire et la membrane cellulaire. Cette dernière étape nécessite la protéine de liaison à l'ADN ComEA et la protéine de canal porogène ComEC, avec des homologues trouvés dans des espèces Gram-positives et Gram-négatives naturellement transformables (par exemple, ComE et ComA dans N. gonorrhoeae). La perturbation de l'une ou l'autre de ces protéines entraîne généralement une réduction drastique ou même une absence de transformation15,16,41,42. Cependant, la perturbation des gènes présentant une homologie avec la comEA et la comEC dans les formes L de K. viridifaciens n'a eu aucun effet sur leur capacité à absorber l'ADN, suggérant un mécanisme indépendant de la machinerie de transformation génétique naturelle canonique.

L'endocytose est un processus fondamental et hautement régulé chez les eucaryotes qui est impliqué dans l'absorption des nutriments, la régulation de la composition de la membrane plasmique, la détection de l'environnement extracellulaire et la signalisation43. L'invagination de la membrane et la scission membranaire et la formation de vésicules qui en résultent permettent aux cellules d'internaliser un large éventail de cargaisons telles que des fluides, des ligands, des protéines de la membrane plasmique et parfois même des bactéries entières. L'invagination est souvent suivie du passage de la cargaison par la voie endosomale et de la dégradation lysosomale26. Des cellules de mammifères spécifiques peuvent capter l'ADN, suivies de l'expression active du gène44, qui se produit potentiellement par endocytose, bien que le mécanisme exact ne soit pas clair45. Ce travail montre que les formes L utilisent un mécanisme de type endocytose pour l'absorption de l'ADN, par lequel l'invagination membranaire conduit à la formation de vésicules intracellulaires qui, lors de leur formation, ont encapsulé du matériel extracellulaire (Fig. 5). Grâce à ce processus, non seulement l'ADN, mais également d'autres macromolécules telles que le dextrane de 3 kDa et même des nanoparticules lipidiques de 150 nm ont été encapsulés, ce qui suggère fortement que le processus d'absorption est non spécifique. Le processus d'absorption est inhibé par des conditions qui réduisent l'activité métabolique et la production d'énergie. Fait intéressant, une étude plus ancienne rapporte également l'absorption de dextranes fluorescents dans les vésicules internes des formes L de Bacillus subtilis, ce qui a été proposé par endocytose en phase fluide46.

Le mécanisme exact sous-jacent à la formation de vésicules intracellulaires dans les formes L est inconnu, mais peut dépendre d'une dynamique membranaire accrue due à une synthèse membranaire excessive6,47. Un déséquilibre dans le rapport surface/volume cellulaire dû à une synthèse membranaire excessive peut conduire à la formation de vésicules internes dans les mutants sphériques de forme E. coli et B. subtilis6,48. Des vésicules ou vacuoles internes peuvent également se former dans des protoplastes et des sphéroplastes élargis (ces derniers contenant une membrane externe) qui sont maintenus dans des conditions permettant l'expansion de la membrane cellulaire49,50. En effet, un manque de production excessive de membranes peut également expliquer pourquoi nous n'avons pas observé d'absorption constante d'ADN dans les protoplastes et les cellules S, qui sont tous deux incapables de proliférer sans leur paroi. Cependant, nous ne pouvons pas exclure si des protéines similaires à celles impliquées dans l'endocytose eucaryote, telles que les protéines d'enveloppe, la machinerie de scission ou les protéines du cytosquelette43, sont impliquées dans la formation de vésicules internes dans les formes L. Cependant, il convient de noter que les formes L de B. subtilis ne reposent pas sur des protéines cytosquelettiques connues pour la déformation et la prolifération de la membrane51.

L'imagerie par microscopie électronique à haute résolution a révélé plusieurs vésicules internes à l'intérieur des cellules en forme de L. Fait intéressant, les formes en L contenaient également des régions non entourées d'une membrane mais étaient bordées de taches plus sombres. Ces taches sombres, qui sont générées par le chargement local des électrons avec le matériau, étaient précédemment décrites comme des corps protéiques ou lipidiques38,39, et peuvent éventuellement provenir des produits de dégradation de la membrane des vésicules internes. La désintégration probable des vésicules internes a également été capturée à l'aide de l'imagerie timelapse. Cette désintégration conduirait à la libération de la cargaison de vésicules dans le cytoplasme. Chez les eucaryotes, la fuite des agents thérapeutiques des vésicules endosomales peut être médiée par des agents bactériens, viraux et chimiques ou par des nanoparticules52,53. Les mécanismes d'échappement comprennent la formation de pores, la déstabilisation de la membrane, le gonflement des nanoparticules ou la rupture osmotique. Des niveaux élevés de saccharose ou l'effet d'éponge à protons facilitent l'afflux de protons suivi d'une accumulation d'ions chlorure et d'un afflux d'eau, conduisant à la rupture de la vésicule54,55. L'acidification des endosomes se produit via des ATPases vacuolaires localisées sur la membrane (V-ATPases) qui pompent des protons dans les vésicules56. Les bactéries ont des pompes à protons similaires appelées F-ATPases sur leur membrane plasmique et ont été trouvées sur la membrane des vésicules intracellulaires de protoplastes agrandis57. Compte tenu de la complexité des mécanismes d'échappement connus, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre comment les vésicules internes de forme L peuvent se désintégrer pour libérer leur contenu dans le cytoplasme.

Les formes de vie modernes sont des systèmes biologiques complexes, qui ont probablement évolué à partir de cellules beaucoup plus simples. Deux systèmes modèles pour étudier les formes de vie précoces putatives sont les vésicules lipidiques géantes et les formes L en raison de leur absence de paroi cellulaire et de leur mode de prolifération biophysique8,9. On pense que le transfert horizontal de gènes a joué un rôle central dans l'évolution de la petite enfance58. Cela peut s'être produit dans des cellules qui n'ont pas encore développé de paroi cellulaire, permettant la recombinaison génétique après la fusion cellulaire ou l'électroporation déclenchée par la foudre59,60, mais d'autres mécanismes de HGT étaient inconnus. Des vésicules internes ont été observées dans les formes L d'autres espèces bactériennes, avec différentes fonctions et mécanismes de formation de vésicules décrits61,62. Les formes L de Listeria monocytogenes sont capables de former des vésicules internes contenant de l'ADN le long de l'intérieur de la membrane cellulaire, qui lors de leur libération deviennent métaboliquement actives63,64, ainsi que de former des vésicules internes via l'invagination de la membrane, qui contiennent probablement un milieu extracellulaire47. De plus, l'invagination secondaire de la membrane de la vésicule elle-même peut entraîner des vésicules contenant du cytoplasme et représenter une progéniture viable.

Fait intéressant, des travaux préliminaires montrent que les formes L de L. monocytogenes ont également la capacité d'absorber l'ADN plasmidique extracellulaire et de se transformer sans l'utilisation de PEG65. Cette espèce bactérienne n'est pas connue pour être naturellement transformable et ne contient pas de système de compétence fonctionnelle. Cela suggère qu'un mécanisme similaire à l'endocytose, tel qu'observé dans les formes L de K. viridifaciens, pourrait être responsable de l'absorption d'ADN. Ces exemples fournissent un support supplémentaire pour l'existence d'une endocytose bactérienne.

Une étude récente rapporte des similitudes entre les microfossiles sphériques et les protoplastes sans paroi66. Lorsque les protoplastes ont été cultivés dans des conditions qui imitent les conditions présumées de l'éon archéen, la période où la vie s'est formée sur Terre, des vésicules intracellulaires se sont formées. Ces vésicules ont également été observées dans des microfossiles vieux de 3,5 à 2,4 milliards d'années, ce qui suggère que des cellules sans paroi auraient pu être présentes dans l'Antiquité. Cependant, il convient de noter que des cellules sans paroi peuvent également être formées à partir de bactéries à paroi. Par exemple, il a été démontré que les mycoplasmes sans paroi sont dérivés de bactéries à paroi via une évolution dégénérative67, et les formes L générées en laboratoire proviennent également de cellules à paroi. Les formes L n'étaient peut-être pas les cellules primordiales elles-mêmes, mais fonctionnaient plutôt comme un modèle pour étudier les premières formes de vie supposées. Par conséquent, nous proposons que le processus de type endocytose observé dans les formes L reflète un mécanisme ancien de la façon dont les cellules primordiales peuvent avoir acquis du nouveau matériel génétique et des nutriments via l'engloutissement avant l'invention de la paroi cellulaire.

En conclusion, nos travaux montrent que la perte permanente de la paroi cellulaire bactérienne permet l'absorption d'ADN, de dextrane et de nanoparticules lipidiques de taille 150 nm via la formation de vésicules internes. L'invagination de la membrane cellulaire conduit à l'engloutissement des fluides externes et à la formation ultérieure de vésicules. Finalement, la vésicule peut se rompre, entraînant la libération de la cargaison dans le cytoplasme. Il s'agit d'un processus dépendant de l'énergie qui présente des similitudes avec une forme simple d'endocytose comme on le voit chez les eucaryotes. Des études futures sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires derrière ce processus.

Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans les tableaux supplémentaires 4 et 5, respectivement. Les lignées cellulaires bactériennes sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Kitasatospora viridifaciens DSM4023968 a été cultivé de manière confluente sur un milieu maltose-extrait de levure (MYM) pour obtenir des spores, qui ont été récoltées après 3 à 4 jours de croissance69. En bref, les spores ont été remises en suspension dans MilliQ à l'aide d'un coton-tige et filtrées à travers une seringue remplie de coton. Les spores ont été remises en suspension dans du glycérol à 20 % (v/v) (G1345, Duchefa Biochemie) et conservées à -80 °C jusqu'à utilisation. Pour la croissance mycélienne dans un liquide, K. viridifaciens a été cultivé pendant une nuit à une densité de 1 × 106 spores ml-1 dans un bouillon en phase L (LPB) sans saccharose à 200 tr/min. Les souches ont été cultivées pendant 2 jours dans du LPB avec du saccharose (S0809, Duchefa Biochemie) à 100 tr/min pour induire la formation de cellules S7. Les formes L ont été cultivées sur de la gélose solide en phase L (LPMA) ou du LPB7 liquide. Des cultures liquides ont été inoculées avec des spores pour les souches de K. viridifaciens ou avec une aliquote congelée d'une culture de forme L âgée de 1 à 2 jours dans le cas de souches de forme L. Les formes L ont été cultivées en culture liquide pendant 3 à 4 jours pour la transformation chimique et 7 jours pour toutes les autres expériences, sauf indication contraire. Les formes L ont été ajustées à 5–7,5 × 107 UFC ml−1 pour les tests de transformation (sur la base d'une DO600 de 3 pour les cellules âgées de 3 et 7 jours et de 0,2 pour les cellules âgées d'un jour) et de 2,5–5 × 107 UFC ml-1 (OD600 de 2) pour toutes les autres expériences avec des cellules âgées de 7 jours. Toutes les cultures de Kitasatospora ont été cultivées à 30 °C.

Si nécessaire, antibiotiques (100 µg ml−1 ampicilline, K029, Roth ; 25 µg ml−1 chloramphénicol, C0113 ; Duchefa Biochemie ; 5 µg ml−1 thiostrepton, 598226, Calbiochem ; 50 µg ml−1 apramycine, A0164, Duchefa Biochemie ; 100 µg ml-1 d'hygromycine B, K547, Amresco, à l'exception de 200 µg ml-1 d'hygromycine B pour le milieu LB) ont été ajoutés au milieu de culture. Les souches d'Escherichia coli ont été cultivées sur un milieu LB solide ou liquide (tout en secouant à 250 tr/min) à 37 ° CE. ADN.

Toutes les PCR ont été réalisées à l'aide de PFU ou d'ADN polymérase haute fidélité Q5® (NEB). Les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 6. Le mélange d'échelles d'ADN GeneRuler (SM0334, Thermo Scientific) a été utilisé pour confirmer la taille des molécules d'ADN par électrophorèse sur gel. Pour créer pFL-ssgB (tableau supplémentaire 5), une cassette de résistance à l'hygromycine a été amplifiée à l'aide de la paire d'amorces Hyg_F-231_EEV et Hyg_R + 1237_HEV avec pMS8272 comme matrice. Les produits de PCR ont été digérés avec EcoRV et clonés dans pWHM3-oriT73 pour générer pWHM3-oriT-hyg (tableau supplémentaire 5). Le flanc 3' de ssgB a été digéré à partir de pKR17 et cloné dans pWHM3-oriT-hyg en utilisant Xbal et HindIII pour générer le plasmide final. Toutes les enzymes de restriction ont été commandées auprès de New England Biolabs.

pRK1 (tableau supplémentaire 5) a été créé en amplifiant la région flanquante en amont de comEA par PCR avec les amorces FL1-comEA/comEC-FW et FL1-comEA/comEC-REV, introduisant ainsi des sites de restriction EcoRI et XbaI uniques, tandis que la région flanquante en aval de comEC, fabriqué par synthèse de gènes (Baseclear, Leiden, Pays-Bas) était flanqué de sites XbaI et HindIII. Les régions flanquantes et la cassette d'apramycine ont été clonées dans pWHM3-oriT en utilisant les sites de restriction EcoRI, HindIII intercalés avec une cassette de résistance à l'apramycine contenant des sites Xbal flanquants, créant ainsi le plasmide final. Le mutant de délétion comEA/comEC a été créé dans la souche alpha7 de forme L en utilisant pRK1, qui a remplacé les nucléotides +58 par rapport au codon de départ de comEA (BOQ63_029625) jusqu'à + 2489 par rapport au codon de départ de comEC (BOQ63_029630) avec une résistance à l'apramycine cassette. Notez que l'annotation du gène de Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (accession CP023698) a été utilisée pour déterminer les codons putatifs de démarrage et d'arrêt corrects pour comEC, ce qui a entraîné l'emplacement du génome 5 041 836 à 5 044 433 sur CP090841.

Pour créer pIJ82-GFP, la région contenant le gène eGFP avec un promoteur gap1 a été amplifiée à partir de pGreen74 en utilisant la paire d'amorces gap1_FW_BglII et egfp_RV_EcoRI. Le produit de PCR résultant a été cloné dans pIJ82 en utilisant BglII et EcoRI pour générer le plasmide final.

Pour créer de nouvelles souches de forme L, la transformation de l'alpha avec l'ADN plasmidique a été réalisée en utilisant une transformation chimique à base de polyéthylène glycol (PEG) 10 comme décrit ci-dessous. L'ADN plasmidique a été isolé d'Escherichia coli ET12567/pUZ8002 pour obtenir un ADN déficient en méthylation. Les souches de forme L alpha pIJ82-GFP et alphaΔdivIVA pIJ82-GFP ont été créées en utilisant la transformation chimique de alpha et alphaΔdivIVA avec pIJ82-GFP, respectivement, suivie d'une sélection avec de l'hygromycine B (tableau supplémentaire 4). Les souches ont été vérifiées en utilisant la détection de la production d'eGFP fluorescente en utilisant la microscopie à fluorescence. La souche alphaΔcomEA / EC a été obtenue par transformation chimique de alpha avec pRK1 suivie d'une sélection pour l'apramycine (tableau supplémentaire 4). La croissance ultérieure sur un milieu non sélectif a permis une double recombinaison homologue conduisant au remplacement de la région comEA/EC par une cassette de résistance à l'apramycine, conduisant à des cellules sensibles au thiostrepton et résistantes à l'apramycine. La souche a été vérifiée par PCR en utilisant la paire d'amorces ComEA_Apra_check_FW et ComEC_Apra_check_RV pour confirmer le remplacement de la région par la cassette d'apramycine. Pour confirmer davantage la suppression de cette région, la PCR a été réalisée à l'aide de paires d'amorces ComEC_Presence_Check_1_FW/RV et ComEC_Presence_Check_2_FW/RV, qui amplifient des parties de comEC uniquement si cette région génomique est toujours présente.

L'ADN génomique a été isolé à partir d'une culture de 5 jours d'alphaΔssgB7 en utilisant une extraction au phénol: chloroforme10. En bref, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 10,3 % (p/v) de saccharose contenant 0,01 M d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 20296.291, VWR Chemicals BDH) pH = 8, après lyse avec 10 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS , 20765.02, Serva). Une extraction avec du phénol:chloroforme (mélange 1:1 de phénol, 10001173, Fisher BioReagentsm et de chloroforme, 32211, Honeywell) a été réalisée et les acides nucléiques ont été précipités à l'aide d'isopropanol (33539, Honeywell). Le culot a été dissous dans du tampon Tris-EDTA (base Trizma®, RDD008, Sigma-Aldrich), suivi d'un traitement à la RNase A (EN0531, Thermo Fisher) et à la protéinase K (19131, Qiagen). L'ADNg a été isolé à l'aide d'une extraction au phénol: chloroforme et précipité à l'aide d'éthanol absolu (5250501, Biosolve) avant remise en suspension dans de l'eau sans nucléase. L'ADNg fragmenté a été obtenu en battant l'ADNg intact pendant 12 min en utilisant des billes de verre de 2 mm de diamètre dans un Mikro-Dismembrator U (Sartorius) à 2 000 tr/min. Les concentrations d'ADN chromosomique ont été vérifiées à l'aide du kit de test d'ADNdb à large plage Quant-IT™ (Q33130, Invitrogen).

La souche DSM40239 de K. viridifaciens a été inoculée à une densité de 5 × 106 spores ml−1 dans un milieu liquide TSBS:YEME (1:1) avec 0,5 % (p/v) de glycine (G0709, Duchefa Biochemie) et 5 mM MgCl2 (M0533 , Duchefa Biochimie). La culture a été cultivée pendant 48 h sous agitation à 200 tr/min, après quoi des protoplastes ont été préparés10. Des cultures de 72 h ont été utilisées pour K. viridifaciens pIJ82-GFP et K. viridifaciens pRed*. Les cellules ont été lavées avec du saccharose à 10, 3% (p / v) avant que le traitement au lysozyme ne soit effectué par l'ajout de 10 mg ml -1 de lysozyme de blanc d'œuf de poulet (~ 70 000 U mg -1, 62971, Sigma-Aldrich). Les cellules ont été incubées pendant 2 à 3 h à 100 tr/min et 30 °C, après quoi les fragments mycéliens ont été séparés des protoplastes par filtration à travers un filtre en coton. Les cellules ont été concentrées par centrifugation à 1000 xg si nécessaire.

Les cellules S ont été isolées des cultures de LPB par filtration7. En bref, la culture a été filtrée à travers un filtre EcoCloth™ stérile (AMEC0003, Contec) et ensuite passée à travers un filtre à membrane Isopore™ de 5 µm (TMTP01300, Merck). Les cellules ont été concentrées par centrifugation douce à 1000 xg pendant 20 min, après quoi 90 % du surnageant a été éliminé. Le culot cellulaire a été remis en suspension avec précaution dans le liquide restant. Pour tester une concentration élevée de cellules S pour l'absorption spontanée d'ADN, K. viridifaciens a été inoculé à 1 × 107 spores ml-1, et la filtration n'a été effectuée qu'à travers le filtre EcoCloth™.

Les protoplastes fraîchement préparés, les cellules S, les formes L ou les cellules mycéliennes ont été conservés sur de la glace avant la transformation. Pour la transformation chimique, 50 µl de cellules ont été mélangés avec 1 µg de pRed*75, 150 ng d'ADNg de la souche alphaΔssgB, des cellules lysées au sel stérilisées sur filtre (35 ng d'ADN de alphaΔssgB) ou MilliQ. Ensuite, 200 µl de PEG 1000 à 25 % (p/v) (14805-B, NBS Biologicals) dans du tampon P 10 ont été ajoutés aux cellules, puis on a doucement mélangé et dilué la suspension dans du tampon P. Des dilutions en série ont été étalées sur du milieu LPMA et après 16 à 18 h d'incubation, une superposition a été réalisée avec 1 ml de tampon P contenant des antibiotiques. Les unités formant colonies (UFC) ont été comptées après 7 jours pour les formes L et le mycélium ou après 14 jours pour les cellules S et les protoplastes. Les transformants ont été vérifiés par stries sur un milieu sélectif et microscopie.

Les cellules fraîchement préparées ont été incubées avec 30 ng µl-1 d'ADN non méthylé (pRed* ou pFL-ssgB comme indiqué) ou MilliQ pendant 18 à 24 h à 100 tr/min, sauf indication contraire. Une concentration finale de 100 ou 10 ng µl-1 d'ADNg intact et de 10 ng ul-1 pour l'ADNg fragmenté isolé de alphaΔssgB a été utilisée en combinaison avec de l'alpha âgé de 1 et 7 jours. Les dilutions ont été étalées sur du LPMA sélectif et non sélectif après remise en suspension soigneuse. Les cellules mycéliennes ont été diluées de manière similaire sur du milieu MYM. Les unités formant des colonies ont été déterminées après 7 jours d'incubation à 30 °C pour les formes L et le mycélium et jusqu'à 14 jours pour les protoplastes et les cellules S. Les transformants ont été vérifiés par croissance sur milieu sélectif et par PCR (en utilisant les amorces Tsr_Hyg_FW1 et Tsr_Hyg_RV1) ou microscopie. Les cellules ont été préparées à partir d'au moins cinq cultures de répliques pour comparer les efficacités de transformation entre les souches. L'absorption d'ADN des cellules S a été testée en utilisant un filtrat obtenu par la procédure standard, ainsi qu'un filtrat plus concentré obtenu par inoculation de 1 × 107 spores ml-1 et filtration de la culture bactérienne à travers le filtre EcoCloth™ uniquement. Les plaques de colonies ont été imagées à l'aide du scanner Epson Perfection V600 Photo avec le logiciel Epson Scan Utility v3.9.2.0.

Trois cultures répétées de formes L âgées de 1, 3 et 7 jours ou de protoplastes fraîchement préparés ont été soumises à un test de colorant Laurdan comme mesure de la fluidité de la membrane23. Environ 1 ml de chaque culture a d'abord été centrifugé à 1000 xg pendant 10 min pour éliminer toute trace du milieu de culture. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de tampon P et ajustées à une DO600 de 0,6. Une solution mère de Laurdan (6-dodécanoyl-2-diméthylaminonaphtalène, D250, Invitrogen) 10 mM a été préparée dans du diméthylformamide à 100 % (DMF, D4551, Sigma-Aldrich) et conservée à -20 °C dans un tube ambré. A chaque culture de 1 ml à DO ajustée, 1 ul de colorant Laurdan a été ajouté à une concentration finale de 10 uM. Les cultures ont ensuite été incubées dans l'obscurité à 30°C pendant 10 min, sous agitation à 100 tr/min. Les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon P contenant 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO, 41639, Sigma-Aldrich) pour éliminer les molécules de colorant non liées avant que les cellules ne soient remises en suspension dans du tampon P. Environ 200 ul de cette culture remise en suspension ont été aliquotés dans une SensoPlate™ à fond noir/verre à 96 puits (655892, Greiner Bio-One). Trois répliques techniques ont été mesurées par culture, ainsi qu'une réplique par condition de culture sans colorant pour mesurer la fluorescence de fond.

L'excitation de l'échantillon a été réalisée à 350 nm suivie d'une capture d'émission de fluorescence à 435 et 490 nm, déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Spark® (Tecan) avec le logiciel Sparkcontrol V3.1. Après soustraction de la fluorescence de fond, la valeur de polarisation généralisée (GP) a été calculée à l'aide de l'Eq. (1):

Les valeurs obtenues après calcul sont comprises entre -1 et +1, celles plus proches de -1 indiquant une plus grande fluidité.

La préparation des cellules pour la quantification de la fluidité membranaire par microscopie a été effectuée comme suit. Les cellules ont été lavées et ajustées à la DO comme mentionné ci-dessus. Le colorant Laurdan (concentration de réserve 10 mM) a été ajouté à 100 µl de culture pour obtenir une concentration finale de 100 µM. La culture a été placée à 30 °C pendant 5 min, sous agitation à 100 tr/min dans l'obscurité. Environ 900 ul de tampon P préchauffé contenant 1 % de DMSO ont été ajoutés et la culture a été centrifugée (1000 x g, 10 min) pour éliminer toutes les molécules de colorant non liées. Les cellules ont finalement été remises en suspension dans 100 ul de tampon P pour analyse au microscope. Des cellules traitées de manière similaire mais sans colorant Laurdan ont été utilisées comme contrôle pour les mesures de microscopie.

L'ADN plasmidique marqué par fluorescence a été préparé à l'aide du kit de marquage Mirus Label IT® Cy™5 (MIR 2725) conformément aux spécifications du fabricant. Des aliquotes d'ADN marqué (100 ng µl-1) ont été conservées à -20 °C jusqu'à utilisation ultérieure.

Tous les lipides (DLin-MC3-DMA76 ; Cholesterol, C8667, Sigma-Aldrich ; Avanti Polar Lipids : DSPC, 850365, DMG-PEG2000, 880151, 18:1 Liss Rhod PE, 810150) ont été combinés dans un rapport molaire de 50/38,3 /10/1,5/0,2 en utilisant des solutions mères (100 µM–10 mM) dans du chloroforme:méthanol (mélange 1:1 de chloroforme, 22706, VWR Chemicals et de méthanol, 83638, VWR Chemicals). Les solvants organiques ont été évaporés sous un courant d'azote et le solvant restant a été éliminé sous vide pendant au moins 1 h. Par la suite, le film lipidique a été dissous dans EtOHabs (20821, VWR Chemicals) et un tampon citrate 50 mM (pH = 4, MilliQ ; en utilisant de l'acide citrique, C0759, et du citrate de sodium tribasique déshydraté, C7254 ; Sigma-Aldrich) a été préparé. Chaque solution a été chargée dans des seringues séparées et connectée à un mélangeur microfluidique à jonction en T. Les solutions ont été mélangées dans un rapport de flux de 3: 1 de tampon citrate contre les lipides (1, 5 ml min-1 pour le tampon citrate, 0, 5 ml min-1 pour les solutions lipidiques), donnant une concentration totale de lipides de 1 mM. Après mélange, la solution a été directement chargée dans une cassette de dialyse MWCO 10k (Slide-A-Lyzer™, Thermo Scientific) et dialysée pendant une nuit contre 1× Phosphate Buffered Saline (PBS), contenant 137 mM NaCl (NAC02, Formedium), 2,7 mM KCl (1.04936, VWR Chemicals), Na2HPO4 8 mM (1.06586, VWR Chemicals) et KH2PO4 2 mM (60229, Sigma-Aldrich), pendant la nuit. Les nanoparticules lipidiques (LNP-LR) sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Toutes les incubations avec des LNP ont été réalisées avec des cellules remises en suspension dans du milieu LPB, dont le volume final de solution de LNP était de 25 %.

Les préparations de nanoparticules lipidiques ont été caractérisées de la manière suivante (tableau supplémentaire 8). Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont été effectuées sur un Zetasizer Nano Series S (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Le laser HeNe intégré fonctionne à une longueur d'onde de 633 nm et utilise un détecteur à un angle de 173° (technologie de rétrodiffusion non invasive). Les mesures ont été enregistrées avec un temps d'équilibrage de 1 min dans des cuvettes UV à 25 ° C. Pour l'estimation du diamètre moyen z (diamètre moyen en poids d'intensité) et de l'indice de polydispersité (PDI) (largeur relative de la distribution granulométrique), des échantillons ont été préparés par dilution au dix avec du PBS 1 ×. Pour l'estimation du potentiel zêta, l'échantillon a été dilué avec du PBS 0,1 × et mesuré dans un Zetasizer Nano Series SZ (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Toutes les données étaient en triple pour obtenir la valeur moyenne.

La détection de l'émission de fluorescence des transformants a été réalisée à l'aide d'un axioscope Zeiss A.1 équipé d'une caméra numérique couleur Zeiss Axiocam 305, en utilisant le jeu de filtres 63 HE (Carl Zeiss, composé d'un filtre d'excitation passe-bande 572/25 nm, d'un séparateur de faisceau 590 nm et d'un filtre 629 HE /Filtre d'émission passe-bande 62 nm) pour capturer la fluorescence mCherry. Des colonies individuelles ont été imagées à l'aide d'un Zeiss SteREO Discovery v. 8 équipé d'un Schott VisiLED Ring Light S80-55 et d'un Bresser MikroCam SP5.0. Le logiciel Bresser MikroCamLabII a été utilisé pour capturer les images. Toutes les autres microscopies ont été réalisées à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 900 avec module Airyscan 2, chambre de contrôle de température et logiciel Zeiss Zen 3.1 (édition bleue, Carl Zeiss Microscopy GmbH), sauf indication contraire. Tous les paramètres d'excitation et d'émission de ce microscope sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 7. Des images multicanaux (DIC et fluorescence) et multistack ont ​​été obtenues, sauf indication contraire. 10 μl de cellules ont été imagés sur une lame à 8 chambres (ibidi®) recouverte de 0,1 % (p/v) de poly-L-lysine (P8920, Sigma-Aldrich ; l'excès de poly-l-lysine a été retiré et la lame a été laissée sécher avant d'appliquer l'échantillon). Pour l'imagerie accélérée ou l'incubation d'une nuit dans la chambre de contrôle de température, 400 μl de culture cellulaire ont été ajoutés à un μ-Dish d'imagerie de 35 mm (ibidi®) et laissés reposer à 30 ° C pendant une heure avant l'imagerie nocturne. L'analyse des images a été réalisée à l'aide du logiciel Fiji (ImageJ)77.

L'ADN chromosomique a été visualisé après 30 min d'incubation avec SYTO 9 (S34854, Invitrogen) à une concentration finale de 2 μM. Les membranes cellulaires ont été visualisées par incubation avec SynapseRed C2M (SynapseRed, PK-CA707-70028, PromoKine, PromoCell GmbH) à une concentration finale de 40 μg ml-1. Après une incubation d'une nuit dans une μ-Dish (ibidi®) à l'aide de la chambre de contrôle de température confocale Zeiss LSM 900, les cellules ont été imagées à l'aide du mode Airyscan avec un traitement post-image super-résolution via le logiciel Zen. Les protoplastes et les cellules S ont été incubés avec SynapseRed jusqu'à 72 h avant l'imagerie sur une lame de verre. La quantification des vésicules internes putatives a été réalisée après incubation de formes L âgées de 7 jours (alpha pRed *) ou de cellules S et de protoplastes fraîchement récoltés (K. viridifaciens pRed *) produisant mCherry cytoplasmique avec SynapseRed pendant 0 ou 72 h. SYTO 9 a été ajouté directement avant l'imagerie pour identifier l'ADN. Les cellules ont été placées sur une lame à huit chambres (ibidi®) recouverte de 0,1 % de poly-l-lysine. Les formes L et les cellules S ont été imagées de haut en bas avec un pas de 0, 5 μm et des protoplastes avec un pas de 0, 28 μm pour tenir compte de leur plus petite taille de cellule. Les cellules ayant une ou plusieurs régions dépourvues de coloration mCherry, SYTO 9 ou SynapseRed ont été comptées comme une cellule avec une vésicule interne putative à l'aide du plugin Cell Counter à Fidji (ImageJ).

L'absorption d'ADN marqué par fluorescence a été évaluée en incubant des cellules avec de l'ADN plasmidique marqué au Cy5 (pFL-ssgB) à une concentration finale de 1, 25 μg ml-1 et a été imagée dans un μ-Dish (ibidi®) après 72 h.

Pour capturer la formation de vésicules internes et l'absorption de Dextran-Texas Red (D-TR, D-3329, 3000 MW, neutre, Molecular Probes), des cellules d'alpha pKR2 ont été incubées avec une concentration finale de 1 mg ml-1 D-TR dans PBS et ont été imagés pendant la nuit. L'imagerie multistack sur une distance totale de 6 μm avec des pas de 1,5 μm a été réalisée avec une image capturée toutes les 10 min. L'imagerie de l'absorption de D-TR dans les formes L, les protoplastes ou les cellules S a été réalisée après une incubation jusqu'à 72 h. La quantification du pourcentage de cellules qui avaient absorbé le D-TR a été effectuée comme suit. Les cellules produisant de l'eGFP cytoplasmique ont été incubées avec du PBS ou 1 mg ml-1 D-TR en duplo pendant 72 h (alpha pIJ82-GFP âgé de 7 jours ou cellules S fraîchement récoltées ou protoplastes de K. viridifaciens pIJ82-GFP). Les cellules ont été diluées dix fois dans du milieu LPB et centrifugées doucement pendant 10 min à 1000 xg, après quoi le surnageant a été remplacé par du milieu LPB. Les cellules ont été placées sur une lame à huit chambres (ibidi®) recouverte de 0,1 % de poly-l-lysine. Les images Z-stack ont ​​été acquises de haut en bas des cellules avec des pas de 0, 28 μm. Les cellules avec une absorption putative de D-TR ont été identifiées comme celles dépourvues d'une région d'eGFP cytoplasmique (vésicule interne putative) tout en révélant une émission accrue de D-TR dans cette région, mesurée à l'aide de l'outil Plot Profile aux Fidji (ImageJ). Les cellules avec et sans absorption ont été comptées à l'aide du plugin Cell Counter à Fidji (ImageJ).

L'absorption de LNP fluorescents rouges (LNP-LR) par alpha a été visualisée par imagerie après une nuit d'incubation dans un μ-Dish (ibidi®) ou après une incubation jusqu'à 3 jours avant l'imagerie, comme indiqué. L'inhibition de l'absorption de LNP a été réalisée par incubation en présence d'azide de sodium 1, 2,5 ou 10 mM (S-8032, Sigma-Aldrich) ou par incubation à 4 ° C, et les images ont été obtenues via le logiciel Zen après 0, 24, et 48h. Pour déterminer la localisation subcellulaire de LNP-LR dans alpha pIJ82-GFP, l'imagerie a été réalisée en utilisant le mode Airyscan avec un traitement post-image super-résolution et analysée en utilisant l'intensité des pixels des canaux rouge (LNP-LR) et vert (eGFP) à l'aide de l'outil Plot Profile à Fidji (ImageJ).

Pour mesurer la fluidité de la membrane, des échantillons ont été excités à l'aide d'un laser à 405 nm et des images ont été capturées à des émissions de 430 et 500 nm. La valeur GP a été calculée à l'aide du plug-in Calculate GP dans Fiji78 pour obtenir un histogramme du nombre de pixels sur la plage de -1 à +1. En bref, l'image est divisée en canaux individuels, suivis d'une soustraction de fond et d'une mise à zéro des pixels non significatifs. Les images sont ensuite affectées des lettres A et B pour calculer A - B et A + B à l'aide du calculateur d'images. Enfin, un rapport de (A - B)/(A + B) est affiché sous la forme d'une image où les valeurs de pixel minimales sont définies sur -1 (rouge) et les valeurs de pixel maximales définies sur +1 (bleu). À l'aide de la fonction d'analyse d'histogramme, une liste de valeurs est obtenue et utilisée pour tracer les distributions de différents échantillons.

Pour capturer la rupture des vésicules, les formes L ont été remises en suspension dans du LPB frais à une DO600 de 0,04. Les dilutions ont été placées dans une SensoPlate à fond noir/verre à 96 puits et centrifugées doucement pendant 5 min à 1000 x g pour déposer les cellules au fond des puits. Les cellules ont été imagées à l'aide d'un microscope automatisé Lionheart FX (BioTek) avec le logiciel Gen 5 v.3.10 à un grossissement de 60 × air (champ clair et mCherry en utilisant le cube de filtre Texas Red 586/647). Les images de la pile Z ont été capturées toutes les 15 min avec une taille de pas de 1 µm couvrant 12 µm au total pendant 20 h (film supplémentaire 5) ou une taille de pas de 0,5 µm couvrant un total de 5 µm pendant 17,5 h (films supplémentaires 6, 7).

La souche alpha pIJ82-GFP de forme L âgée de sept jours exprimant l'eGFP cytoplasmique a été ajustée à une DO600 de 2 dans un milieu frais contenant 25 % (v/v) de PBS et une concentration finale de 17 % (p/v) de saccharose. Les cellules ont été incubées pendant 4 jours, au cours desquels les cellules se sont déposées au fond. Quelques microlitres de la pastille en forme de L remise en suspension ont été pris en sandwich entre des supports HPF (congélation à haute pression) de 2 mm de diamètre interne (cavité de 0,1 mm ou 0,05 mm, Art. 241 et Art. 390 respectivement, Wohlwend) et sur mesure. faite grille étiquetée, côté plat finderTOP (Alu-plaquette étiquetée, 0,3 mm, Art.1644 Wohlwend) pour permettre une empreinte d'une matrice finder sur la glace amorphe79. Le finderTOP a été traité avec 1% de l-α-phosphatidylcholine (61755, Sigma-Aldrich) dans de l'éthanol (1.00983.1000, Supelco) avant congélation. Les échantillons ont ensuite été congelés à haute pression (Live µ, CryoCapCell) et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à l'imagerie.

Pour améliorer la corrélation entre la cryo-lumière et la cryo-microscopie électronique, les échantillons congelés ont été chargés dans un porte-cryo universel (Art. 349559-8100-020, kit d'accessoires cryo Zeiss) à l'aide de la solution ZEISS Correlative Cryo Workflow, adaptée au PrepDek® (PP3010Z, Quorum technologies, Laughton, Royaume-Uni). Ici, les supports HPF s'insèrent dans un cryo-support universel, qui peut ensuite être placé dans un adaptateur spécifique pour la cryo-lumière ou la cryo-microscopie électronique.

Les échantillons congelés ont été imagés avec un adaptateur cryo-stage (CMS-196, Linkam scientific inc.) appliqué à un microscope confocal droit (LSM 900, Zeiss microscopy GmbH) équipé d'un détecteur Airyscan 2. Des images d'ensemble (Zeiss C Epiplan-Apochromat 5 × / 0,2 DIC) ont été réalisées avec une microscopie à réflexion pour visualiser le motif quadrillé sur la surface de la glace. Ensuite, des images Z-stack à résolution moyenne (Zeiss C Epiplan-Apochromat 10×/0,4 DIC) ont été prises avec un laser à 488 nm (0,4 %) avec une taille de voxel de 0,15 µm × 0,15 µm × 1,18 µm. En utilisant cette résolution, les cellules d'intérêt ont pu être sélectionnées et des images Z-stack ont ​​été créées (Zeiss C Epiplan-Neofluar 100x/0,75 DIC) à l'aide d'un laser à 488 nm (4 %), avec une taille de voxel de 0,08 µm × 0,08 µm × 0,44 µm. De plus, la surface de la glace a été imagée dans toutes les ROI avec microscopie à réflexion à des fins de corrélation dans le FIB-SEM.

Avant l'imagerie cryo-lumineuse, un projet Zeiss ZEN Connect (logiciel Zeiss pour la microscopie corrélative, version 3.1) a été créé pour créer une feuille de travail (toile) pour aligner et superposer toutes les images et faciliter la corrélation avec cryo-FIB-SEM .

L'échantillon a été recouvert par pulvérisation cathodique de platine, courant de 5 mA pendant 30 s, à l'aide du dispositif de revêtement par pulvérisation cathodique de préparation (PP3010, Quorum technologies, Laughton, Angleterre) et a été transféré dans le Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Oberkochen , Allemagne) en utilisant la chambre de préparation PP3010T (Quorum, Laughton, Angleterre). Tout au long de l'imagerie, les échantillons ont été maintenus à -140 ° C et la pression de vide du système était de 1 × 10 -6 mbar.

Après avoir inséré l'échantillon dans la chambre FIB-SEM, des images d'ensemble ont été prises à l'aide du SEM pour aligner les données avec l'image de réflexion LSM de la surface du même projet ZEN Connect. Cet alignement permet l'enregistrement du stade, ce qui permet d'utiliser le signal de fluorescence pour naviguer vers différentes régions d'intérêt. Après alignement initial à l'aide du SEM, une image FIB de la surface a été collectée avec la sonde 30 kV @ 10 pA à 54 ° d'inclinaison.

Une tranchée grossière a été fraisée pour l'observation SEM à l'aide de la sonde FIB 30 kV @ 30 nA. Le dépôt à froid a été fait avec du platine pendant 30 s. Le fraisage FIB fin sur la section transversale a été effectué à l'aide de la sonde 30 kV @ 700 pA. Pour le fraisage FIB en série et l'imagerie SEM, la largeur de tranche (tranchée) était de 40 μm et pour le fraisage FIB, la sonde 30 kV @ 300 pA a été utilisée, avec une épaisseur de tranche de 20 nm. Lorsqu'une nouvelle surface de tranche a été exposée par fraisage FIB, des images secondaires InLens et EsB ont été simultanément collectées à un potentiel d'accélération de 2, 33 kV avec un courant de sonde de 250 pA. La grille EsB a été définie sur -928 V. La taille de l'image a été définie sur 2048 × 1536 pixels. Pour la réduction du bruit, la moyenne des lignes avec un nombre moyen de lignes N = 46 à la vitesse de balayage 1 a été utilisée. La taille de voxel de toutes les piles était de 5 nm3 × 5 nm3 × 20 nm3.

Les images cryo-FIB-SEM ont été traitées à l'aide de MATLAB (R2018b, Natick, Massachusetts : The MathWorks Inc.) pour corriger les défauts tels que le rideau, le désalignement et la charge locale. Le même logiciel a été utilisé pour la réduction du bruit et l'amélioration du contraste. Un résumé de chaque étape de traitement est le suivant :

La suppression des bandes verticales dans les piles a été effectuée en suivant une approche de filtrage par ondelettes-FFT80. En bref, les informations haute fréquence correspondant aux bandes verticales ont été successivement condensées en une seule carte de coefficients en utilisant la décomposition par la famille d'ondelettes coif. Par la suite, une transformée de Fourier 2D a été effectuée pour resserrer davantage les informations de bande en bandes étroites. Enfin, les informations de stipe condensées ont été éliminées par multiplication avec une fonction d'amortissement gaussienne et l'image dérayée a été reconstruite par transformée en ondelettes inverse.

Les tranches consécutives ont été alignées en utilisant une corrélation croisée normalisée. En bref, la première image de la pile a été choisie comme référence et la deuxième image a été translatée pixel par pixel à travers la référence et une matrice de corrélation croisée normalisée a été obtenue à l'aide de la fonction normxcorr2. L'emplacement du pic le plus élevé dans la matrice de corrélation croisée (représentant la meilleure corrélation) a ensuite été utilisé pour calculer la translation nécessaire pour aligner les deux images. Une fois l'image en mouvement alignée avec l'image de référence, elle a servi de référence pour l'alignement de la tranche suivante.

L'élimination du déséquilibre de charge local a été obtenue en utilisant la soustraction de fond gaussien anisotrope. En bref, la fonction imgaussfilt a été utilisée pour effectuer un lissage gaussien 2D avec un vecteur d'écart type à deux éléments. Les éléments du vecteur ont été choisis de manière à appliquer une gaussienne large et nette dans les directions horizontale et verticale, respectivement. Par la suite, l'image corrigée a été obtenue en soustrayant l'image filtrée de l'image originale.

Afin d'améliorer le rapport signal sur bruit, une réduction du bruit a été réalisée à l'aide d'un filtrage de diffusion anisotrope81. Brièvement, en utilisant la fonction la plus imdiffuse, le seuil de gradient optimal et le nombre d'itérations nécessaires pour filtrer chaque image ont été estimés. Par la suite, la fonction imdiffusefilt a été appliquée avec les valeurs de paramètre optimales estimées pour débruiter chaque image.

En tant qu'étape de traitement finale, le contraste a été amélioré à l'aide de l'égalisation d'histogramme adaptative limitée par le contraste82. En utilisant la fonction adapthisteq, le contraste a été amélioré en deux étapes, en utilisant une distribution uniforme et une faible limite d'écrêtage afin d'éviter la suramplification des régions homogènes.

Le logiciel d'analyse d'images et d'apprentissage en profondeur DragonflyTM (version 2021.1, Objects Research Systems, Montréal, QC, Canada) a été utilisé pour segmenter toutes les données d'image.

Séquences protéiques de Bacillus subtilis str. 168, Neisseria gonorrhoeae et la souche Helicobacter pylori P12 ont été obtenues à partir de la base de données ou de la littérature UniProt et sont fournies dans les données supplémentaires 1. Protein BLAST a été exécuté pour ces séquences par rapport à la base de données de séquences codantes traduites de la souche DSM40239 de Streptomyces viridifaciens (également connue sous le nom de K. viridifaciens souche DSM40239), avec les numéros d'accès de séquence CP090840, CP090841 et CP090842, en utilisant le logiciel BLAST hors ligne (v. 2.12.0). Les coups avec une valeur E de 1 × 10−6 ou moins ont été collectés (tableau supplémentaire 1).

Toutes les statistiques sont indiquées et ont été réalisées à l'aide du logiciel de statistiques SPSS (IBM, version 27.0), à l'exception du test z à deux proportions, qui a été calculé manuellement. Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les hypothèses de test ont été déterminées à l'aide des méthodes suivantes. L'homogénéité des variances a été testée à l'aide du test de Levene. La normalité a été testée à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov, du test de Shapiro-Wilk et des tracés QQ, le cas échéant. Les graphiques ont été générés à l'aide de Graphpad Prism v. 9.0.0 ou à l'aide de R version 3.6.1, et d'autres images graphiques ont été générées à l'aide d'Adobe Illustrator v. 26.3.1 ou via Biorender.com (accessible en août 2022). Les écarts types ont été calculés et tracés via Graphpad Prism.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les séquences de protéines obtenues à partir de la base de données UniProt ou de la littérature pour effectuer la recherche NCBI BLAST sont fournies avec des numéros d'accession dans les données supplémentaires 1. Toutes les micrographies de fluorescence et FIB-SEM dans cet article, y compris les données brutes FIB-SEM sous-jacentes au rendu de volume de segmentation 3D ( Films supplémentaires 3, 4), ainsi que les micrographies utilisées pour la quantification de l'absorption des vésicules et du D-TR dans la Fig. 3f et les tableaux supplémentaires 2 et 3, ont été déposés dans la base de données Open Science Framework (OSF) disponible à l'adresse https:// doi.org/10.17605/OSF.IO/5WKGJ. Pour la recherche BlastP, les occurrences ont été collectées à partir de la souche DSM40239 de Streptomyces viridifaciens avec les numéros d'accès CP090840, CP090841 et CP090842. Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (l'accès CP023698 a été utilisé pour déduire le codon putatif de départ et d'arrêt comEC de K. viridifaciens pour la construction knock-out du gène. Les données sources sont fournies avec cet article.

Vert, ER & Mecsas, J. Systèmes de sécrétion bactérienne : un aperçu. Microbiol. Spectre. 4, (2016).

Chen, I. & Dubnau, D. Absorption d'ADN lors de la transformation bactérienne. Nat. Rév. Microbiol. 2, 241–249 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ellison, CK et al. La rétraction des pili de compétence de type IV liés à l'ADN initie l'absorption d'ADN lors de la transformation naturelle dans Vibrio cholerae. Nat. Microbiol. 3, 773–780 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stülke, J., Eilers, H. & Schmidl, SR Dans Encyclopedia of Microbiology (Elsevier, 2009).

Leaver, M., Dominguez-Cuevas, P., Coxhead, JM, Daniel, RA et Errington, J. La vie sans mur ni machine de division chez Bacillus subtilis. Nature 457, 849–853 (2009).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Mercier, R., Kawai, Y. & Errington, J. La synthèse membranaire excessive entraîne un mode primitif de prolifération cellulaire. Cellule 152, 997-1007 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ramijan, K. et al. Formation induite par le stress de cellules déficientes en paroi cellulaire chez les actinomycètes filamenteux. Nat. Commun. 9, 5164 (2018).

Article ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Briers, Y., Walde, P., Schuppler, M. & Loessner, MJ Comment les ancêtres bactériens se sont-ils reproduits ? Leçons des cellules de forme L et des vésicules lipidiques géantes : similitudes de multiplication entre les vésicules lipidiques et les bactéries de forme L. Bioessais 34, 1078-1084 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Errington, J., Mickiewicz, K., Kawai, Y. & Wu, LJ Bactéries de forme L, maladies chroniques et origines de la vie. Philos. Trans. R. Soc. B 371, 20150494 (2016).

Article Google Scholar

Kieser, T., Bibb, MJ, Buttner, MJ, Chater, KF et Hopwood, DA Pratique Streptomyces Genetics (Fondation John Innes, 2000).

Shitut, S. et al. Génération de cellules hétérocaryotes par fusion cellule-cellule bactérienne. Microbiol. Spectre. 10, e0169322 (2022).

Roberts, J. & Park, JS Mfd, le facteur de couplage de réparation de la transcription bactérienne : translocation, réparation et terminaison. Courant. Avis. Microbiol. 7, 120-125 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kruger, NJ & Stingl, K. À deux pas de la nouveauté - principes de l'absorption d'ADN bactérien. Mol. Microbiol. 80, 860–867 (2011).

Article PubMed CAS Google Scholar

Gilbreath, JJ, Cody, WL, Merrell, DS & Hendrixson, DR Le changement est bon : variations des mécanismes biologiques courants dans les genres epsilonprotéobactériens Campylobacter et Helicobacter. Microbiol. Mol. Biol. Rév. 75, 84–132 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Inamine, GS & Dubnau, D. ComEA, une protéine membranaire intégrale de Bacillus subtilis nécessaire à la transformation génétique, est nécessaire à la fois pour la liaison et le transport de l'ADN. J. Bactériol. 177, 3045-3051 (1995).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friedrich, A., Hartsch, T. & Averhoff, B. Transformation naturelle des bactéries mésophiles et thermophiles : identification et caractérisation de nouveaux gènes de compétence étroitement liés chez Acinetobacter sp. souche BD413 et Thermus thermophilus HB27. Appl. Environ. Microbiol. 67, 3140–3148 (2001).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blokesch, M. Compétence naturelle pour la transformation. Courant. Biol. 26, R1126–R1130 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hamoen, LW, Venema, G. & Kuipers, OP Compétence de contrôle chez Bacillus subtilis : utilisation partagée de régulateurs. Microbiologie 149, 9-17 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dubnau, D. Compétence génétique dans Bacillus subtilis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 55, 395–424 (1991).

CAS Google Scholar

Lenaz, G. Fluidité lipidique et dynamique des protéines membranaires. Biosci. Rep. 7, 823–837 (1987).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chapman, D. Transitions de phase et caractéristiques de fluidité des lipides et des membranes cellulaires. Q. Rev. Biophys. 8, 185–235 (1975).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lande, MB, Donovan, JM & Zeidel, ML La relation entre la fluidité de la membrane et les perméabilités à l'eau, aux solutés, à l'ammoniac et aux protons. J. Gen. Physiol. 106, 67–84 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Scheinpflug, K., Krylova, O. & Strahl, H. Mesure de la fluidité de la membrane cellulaire par Laurdan GP : spectroscopie et microscopie de fluorescence. Méthodes Mol. Biol. 1520, 159–174 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jelinkova, A., Malinska, K. & Petrasek, J. Utilisation de colorants FM pour étudier les endomembranes et leur dynamique dans les plantes et les suspensions cellulaires. Méthodes Mol. Biol. 1992, 173–187 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Griffing, analyse LR FRET du retournement transmembranaire du FM4-64 dans les cellules végétales : le FM4-64 est-il un marqueur robuste de l'endocytose ? J. Microsc. 231, 291–298 (2008).

Article MathSciNet CAS PubMed Google Scholar

Cossart, P. & Helenius, A. Endocytose des virus et des bactéries. Cold Spring Harb. Perspective. Biol. 6, a016972 (2014).

Elkin, SR, Lakoduk, AM & Schmid, SL Voies endocytaires et trafic endosomal : une amorce. Vienne. Méd. Wochenschr. 166, 196-204 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Araki, N., Johnson, MT & Swanson, JA Rôle de la phosphoinositide 3-kinase dans l'achèvement de la macropinocytose et de la phagocytose par les macrophages. J. Cell Biol. 135, 1249-1260 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, L., Wan, T., Wan, M., Liu, B., Cheng, R. et Zhang, R. L'effet de la taille du dextrane fluorescent sur sa voie endocytaire. Cell Biol. Int. 39, 531–539 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lenarcic, R. et al. Localisation de DivIVA en ciblant les membranes à courbure négative. EMBO J. 28, 2272-2282 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cullis, PR & Hope, MJ Systèmes de nanoparticules lipidiques pour activer les thérapies géniques. Mol. Là. 25, 1467-1475 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lichstein, HC & Soule, MH Études de l'effet de l'azoture de sodium sur la croissance microbienne et la respiration. J. Bactériol. 47, 221-230 (1944).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoffmann, J. & Mendgen, K. Endocytose et renouvellement de la membrane dans le tube germinatif d'Uromyces fabae. Genet fongique. Biol. 24, 77–85 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sato, K., Nagai, J., Mitsui, N., Ryoko, Y. et Takano, M. Effets des inhibiteurs de l'endocytose sur l'internalisation des IgG humaines par les cellules épithéliales intestinales humaines Caco-2. Vie Sci. 85, 800–807 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Shimoni, E. & Muller, M. Sur l'optimisation de la congélation à haute pression : de la théorie du transfert de chaleur à un nouveau dispositif de microbiopsie. J. Microsc. 192, 236-247 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Studer, D., Michel, M. & Müller, M. La congélation à haute pression arrive à maturité. Microscope à balayage. Suppl. 3, 253–268 (1989).

CAS PubMed Google Scholar

Heiligenstein, X. et al. HPM live µ pour un workflow CLEM complet. Méthodes Cell Biol. 162, 115–149 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Vidavsky, N. et al. Usinage en série Cryo-FIB-SEM et imagerie de face de bloc : analyse structurale à grand volume de tissus biologiques préservés proches de leur état natif. J. Structure. Biol. 196, 487–495 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Spehner, D. et al. Cryo-FIB-SEM comme outil prometteur pour localiser des protéines en 3D. J. Structure. Biol. 211, 107528 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Arnold, BJ, Huang, IT & Hanage, WP Transfert horizontal de gènes et évolution adaptative chez les bactéries. Nat. Rév. Microbiol. 20, 206-218 (2021).

Berge, M., Moscoso, M., Prudhomme, M., Martin, B. & Claverys, JP Absorption de l'ADN transformant dans les bactéries Gram-positives : vue de Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 45, 411-421 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Seitz, P. & Blokesch, M. Machines d'absorption d'ADN de Vibrio cholerae naturellement compétent. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 110, 17987–17992 (2013).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thottacherry, JJ, Sathe, M., Prabhakara, C. & Mayor, S. L'embarras du choix : diverses voies endocytaires fonctionnent à la surface des cellules. Annu. Révérend Cell. Dév. Biol. 35, 55–84 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolff, JA et al. Transfert direct de gène dans le muscle de souris in vivo. Sciences 247, 1465-1468 (1990).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Budker, V., Budker, T., Zhang, G., Subbotin, V., Loomis, A. & Wolff, JA Hypothèse : l'ADN plasmidique nu est absorbé par les cellules in vivo par un processus médié par les récepteurs. J. Gen. Med. 2, 76–88 (2000).

3.0.CO;2-4" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-2254%28200003%2F04%292%3A2%3C76%3A%3AAID-JGM97%3E3.0.CO%3B2-4" aria-label="Article reference 45" data-doi="10.1002/(SICI)1521-2254(200003/04)2:23.0.CO;2-4">Article CAS Google Scholar

Oparka, KJ, Wright, KM, Murant, EA & Allan, EJ Endocytose en phase fluide - les plantes en ont-elles besoin ? J. Exp. Bot. 44, 247-255 (1993).

Google Scholar

Studer, P., Staubli, T., Wieser, N., Wolf, P., Schuppler, M. & Loessner, MJ Prolifération des cellules de forme L de Listeria monocytogenes par formation de vésicules internes et externes. Nat. Commun. 7, 13631 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bendezu, FO & de Boer, PA Létalité conditionnelle, défauts de division, involution membranaire et endocytose chez les mutants de forme mre et mrd d'Escherichia coli. J. Bactériol. 190, 1792–1811 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Takahashi, S., Mizuma, M., Kami, S. & Nishida, H. L'élargissement des protoplastes dépendant de l'espèce implique différents types de génération de vacuoles chez les bactéries. Sci. Rep. 10, 8832 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nishida, H. Facteurs qui affectent l'élargissement des protoplastes bactériens et des sphéroplastes. Int. J. Mol. Sci. 21, 7131 (2020).

Article CAS PubMed Central Google Scholar

Mercier, R., Dominguez-Cuevas, P. & Errington, J. Rôle crucial de la fluidité membranaire dans la prolifération des cellules primitives. Cell Rep. 1, 417–423 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Varkouhi, AK, Scholte, M., Storm, G. & Haisma, HJ Voies d'échappement endosomales pour l'administration de produits biologiques. J. Contrôle. Version 151, 220–228 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Patel, S., Kim, J., Herrera, M., Mukherjee, A., Kabanov, AV et Sahay, G. Brève mise à jour sur l'endocytose des nanomédicaments. Adv. Drug Del. Rev. 144, 90-111 (2019).

Article CAS Google Scholar

Behr, J.-P. L'éponge à protons : une astuce pour pénétrer dans les cellules que les virus n'ont pas exploitée. Chimia 51, 34–36 (1997).

Article CAS Google Scholar

Ciftci, K. & Levy, RJ Transfection d'ADN plasmidique améliorée avec des agents lysosomotropes dans des fibroblastes en culture. Int. J.Pharm. 218, 81–92 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Forgac, M. ATPases vacuolaires : pompes à protons rotatives en physiologie et physiopathologie. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 8, 917–929 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kuroda, T. et al. Etudes patch-clamp sur les pompes ioniques de la membrane cytoplasmique d'Escherichia coli. Formation, préparation et utilisation de structures ressemblant à des vacuoles géantes constituées d'une membrane cytoplasmique éversée. J. Biol. Chim. 273, 16897–16904 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Woese, CR Interprétation de l'arbre phylogénétique universel. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 97, 8392–8396 (2000).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Errington, J. Bactéries en forme de L, parois cellulaires et origines de la vie. Ouvrez Biol. 3, 120143 (2013).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kotnik, T. Électroporation et électrofusion déclenchées par la foudre en tant que contributeurs possibles au transfert horizontal naturel de gènes. Phys. Life Rev. 10, 351–370 (2013).

Article ADS PubMed Google Scholar

Han, J. et al. Conditions et mutations affectant la formation de la forme L de Staphylococcus aureus. Microbiologie 161, 57–66 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yabu, K. Formation de grands corps vésiculés de forme L de Staphylococcus aureus dans un milieu liquide. Microbiol. Immunol. 35, 395–404 (1991).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dell'Era, S. et al. Les formes L de Listeria monocytogenes répondent à la déficience de la paroi cellulaire en modifiant l'expression des gènes et le mode de division. Mol. Microbiol. 73, 306-322 (2009).

Article PubMed CAS Google Scholar

Briers, Y., Staubli, T., Schmid, MC, Wagner, M., Schuppler, M. & Loessner, MJ Vésicules intracellulaires en tant qu'éléments de reproduction dans les bactéries de forme L déficientes en paroi cellulaire. PLoS ONE 7, e38514 (2012).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Staubli, T. Un nouveau mode de reproduction dans les formes L de Listeria monocytogenes (ETH Zurich, 2014).

Kanaparthi, D. et al. Sur la nature des premières formes de vie connues. Préimpression chez bioRxiv 456462 (2021).

Woese, CR, Maniloff, J. & Zablen, LB Analyse phylogénétique des mycoplasmes. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 77, 494–498 (1980).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramijan, K., van Wezel, GP & Claessen, D. Séquence du génome de l'actinomycète filamenteux Kitasatospora viridifaciens. Génome Annonce 5, e01560–01516 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Stuttard, C. Phages tempérés de Streptomyces venezuelae : lysogénie et spécificité d'hôte démontrée par les phages SV1 et SV2. J. Gen. Microbiol. 128, 115-121 (1982).

Google Scholar

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. Amélioration des vecteurs de clonage du phage M13 et des souches hôtes : séquences nucléotidiques des vecteurs M13mp18 et pUC19. Gène 33, 103-119 (1985).

Article CAS PubMed Google Scholar

MacNeil, DJ, Gewain, KM, Ruby, CL, Dezeny, G., Gibbons, PH et MacNeil, T. Analyse des gènes de Streptomyces avermitilis nécessaires à la biosynthèse de l'avermectine à l'aide d'un nouveau vecteur d'intégration. Gène 111, 61–68 (1992).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gregory, MA, Till, R. & Smith, MCM Site d'intégration pour Streptomyces phage phiBT1 et développement de vecteurs d'intégration spécifiques au site. J. Bactériol. 185, 5320–5323 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, C. et al. La lugdunomycine, une molécule dérivée de l'angucycline à l'architecture chimique inédite. Angew. Chim. Int. Éd. angl. 58, 2809-2814 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zacchetti, B. et al. L'agrégation des germes est un facteur majeur contribuant à l'hétérogénéité mycélienne de Streptomyces. Sci. Rep. 6, 27045 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zacchetti, B., Smits, P. & Claessen, D. Dynamique de la fragmentation et de l'agrégation des granulés dans les cultures en milieu liquide de Streptomyces lividans. Devant. Microbiol. 9, 943 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Jayaraman, M. et al. Maximiser la puissance des nanoparticules lipidiques d'ARNsi pour le silençage génique hépatique in vivo. Angew. Chim. Int. Éd. angl. 51, 8529–8533 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidji : une plate-forme open source pour l'analyse d'images biologiques. Nat. Méthodes 9, 676–682 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vischer, N. Utilisation d'ImageJ pour montrer la "polarisation généralisée" (GP). https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/CalculateGP/MD/gp.html (2016).

de Beer, M., R. Roverts, X. Heiligenstein, E. Lamers, N. Sommerdijk et A. Akiva. Microsc. Microanal. 27, 11-12 (2021).

Article CAS Google Scholar

Munch, B., Trtik, P., Marone, F. & Stampanoni, M. Élimination des artefacts de bande et d'anneau avec ondelettes combinées - filtrage de Fourier. Opter. Express 17, 8567–8591 (2009).

Article ADS PubMed CAS Google Scholar

Perona, P. & Malik, J. Espace d'échelle et détection des bords utilisant la diffusion anisotrope. IEEE Trans. Modèle Anal. Mach. Renseignement. 12, 629–639 (1990).

Article Google Scholar

Zuiderveld, K. Dans Graphics Gems IV (éd. Heckbert, PS) Ch. VIII.5 (Academic Press, 1994).

Télécharger les références

RK et LZ sont soutenus par le programme TARGETBIO de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), subvention nr. 15812. SS est soutenu par la subvention Vici à DC de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), subvention nr. VI.C.192.002. Dans le cadre du projet COFUND oLife, DA reconnaît le financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention 847675. MdB, RR, DD et AA sont soutenus par une subvention ERC Advanced Investigator (H2020-ERC-2017-ADV -788982-COLMIN). AA est également soutenu par le NWO (VI.Veni.192.094). Nous remercions Nico Sommerdijk (Radboudumc, Centre de microscopie électronique) pour sa contribution à la congélation à haute pression des échantillons. Nous remercions Gerda Lamers et Joost Willemse pour leur aimable don de Dextran-Texas Red.

Institut de biologie, Université de Leiden, Sylviusweg 72, 2333, Leiden, Pays-Bas

Renée Kapteijn, Shraddha Shitut, Le Zhang, Gilles P. van Wezel & Dennis Claessen

Département de chimie supramoléculaire et des biomatériaux, Institut de chimie de Leiden, Université de Leiden, Einsteinweg 55, 2333, Leiden, Pays-Bas

Dennis Aschmann et Alexander Kros

Centre de microscopie électronique, Radboudumc Technology Center Microscopy, Nimègue, Pays-Bas

Marit de Beer, Deniz Daviran, Rona Roverts & Anat Akiva

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

RK et SS ont réalisé les expériences. LZ, SS et RK ont créé les plasmides et DA a fourni les nanoparticules lipidiques. AA, MdB, RR et DD ont effectué l'imagerie et l'analyse FIB-SEM. Tous les auteurs ont contribué à la conception des expériences et à la discussion des résultats. RK, DC et AA ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Gilles P. van Wezel ou Dennis Claessen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Angel Manteca, Katarzyna Mickiewicz et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Kapteijn, R., Shitut, S., Aschmann, D. et al. Absorption d'ADN de type endocytose par des bactéries déficientes en paroi cellulaire. Nat Commun 13, 5524 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

Télécharger la citation

Reçu : 16 février 2022

Accepté : 31 août 2022

Publié: 22 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Biologie des communications (2023)

Antoine van Leeuwenhoek (2023)

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.